專利名稱：一種hla基因分型的pcr-sbt方法及其試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因分型檢測方法及其試劑，尤其涉及一種用于HLA-A、B、C位點1_7 外顯子基因分型的分子生物學(xué)檢測方法及其試劑。
背景技術(shù)：
人類白細胞抗原(HLA)基因位于第6號染色體短臂21. 3區(qū)域，是調(diào)控人體特異性 免疫應(yīng)答的主要基因系統(tǒng)，是目前所知的最富多態(tài)性的遺傳系統(tǒng)。HLA抗原與同種器官移 植的排斥反應(yīng)密切相關(guān)，器官移植術(shù)后移植物能否存活很大程度上取決于供者與受者之間 HLA型別是否相合。HLA位點分型對選擇合適的供體、降低移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生 率、提高移植物的存活率均有重要意義。HLA-A、-B、-C座位基因為經(jīng)典的HLA- I類基因，具有高度遺傳多態(tài)性，廣泛表達 在各種有核細胞表面。編碼HLA-HLA-A、-B、-C的基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)，一般含有7個 內(nèi)含子和8個外顯子，其大小約為3. 5kb。第1外顯子編碼前導(dǎo)鏈，第2、3、4外顯子分別編 碼α鏈的α 、α 2、α 3結(jié)構(gòu)域，第5外顯子編碼連接多肽和跨膜區(qū)蛋白，第6、7、8外顯子 分別編碼胞內(nèi)區(qū)域和非翻譯區(qū)蛋白。HLA-A、-B、_C的多態(tài)性主要由編碼α 1、α 2區(qū)的第2、 3外顯子決定，但是在第1、4、5、6、7外顯子上也有一定的多態(tài)性。HLA分型技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，如HLA多態(tài)性的研究、HLA的生物學(xué)功能、器 官和骨髓移植前供受者組織相容性配型、HLA與某些疾病的關(guān)聯(lián)、親子鑒定以及人類遺傳學(xué) 等方面。HLA的分型技術(shù)主要有血清學(xué)分型技術(shù)、細胞學(xué)分型技術(shù)、基因分型技術(shù)等。個體 HLA遺傳學(xué)差異的本質(zhì)在于編碼其抗原產(chǎn)物的基因上，所以分析個體HLA的基因型無疑是 對HLA型別分析的最準(zhǔn)確的方法，其準(zhǔn)確性遠高于血清學(xué)與細胞學(xué)分型。目前以DNA為基 礎(chǔ)的HLA基因分型技術(shù)日趨成熟，并逐漸取代血清學(xué)方法和細胞學(xué)分型技術(shù)?；蚍中头?法具有獨特的優(yōu)點需要的血樣少，標(biāo)本可長期保存，相應(yīng)的分型試劑可大量制備，來源不 受限制。特別重要的是基因分型精確可靠，重復(fù)性好，其分型錯誤率遠低于血清學(xué)方法，基 因分型技術(shù)已在實際工作中得到了廣泛的應(yīng)用。HLA的基因分型方法基本上可分為兩種類型。一類是以鑒別HLA基因序列不同 為基礎(chǔ)的HLA分型技術(shù)，如序列特異性引物PCR (polymerase chain reaction sequence specific primer, PCR-SSP)、序列特異性寡核苷酸探針分型技術(shù)(polymerase chain reaction sequence specific oligonucleotide probe, PCR-SS0)、單核苷酸序列分析 (PCR sequence base_typing，PCR-SBT)、基因芯片、流式細胞術(shù)(Luminex)等。另一類基于 不同HLA等位基因在聚丙烯酰胺凝膠電泳中具有不同的構(gòu)象而設(shè)計的。實際工作中一般采 用PCR-SSP、PCR-SS0、PCR-SBT、基因芯片、流式細胞術(shù)等技術(shù)，其中HLA分型的直接測序方 法(PCR-SBT)是最準(zhǔn)確的HLA分型方法，也是目前的金標(biāo)準(zhǔn)方法。但現(xiàn)階段的HLA-A、B、C 位點PCR-SBT分型方法主要針對多態(tài)性位點比較集中的2、3、4號外顯子的測定來確定其基 因型，而對第1、5、6、7號外顯子不進行測序，由于HLA高度遺傳多態(tài)性，在第1、5、6、7外顯 子上也有一定的多態(tài)性，因此現(xiàn)有的方法測定2-4外顯子多態(tài)性，可能引起部分等位基因無法指定，存在歧義或錯誤的結(jié)果，嚴(yán)重影響臨床工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是提供一種HLA基因分型的PCR-SBT方法，以克 服現(xiàn)有HLA-A、B、C位點分型技術(shù)中的上述缺陷。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案它對 HLA-A位點1-7外顯子、HLA-B位點1_7外顯子、HLA-C位點1_7外顯子進行基因分型，包括 以下步驟
(1)、制備人基因組DNA;
(2)、設(shè)計擴增引物，用聚合酶鏈反應(yīng)分別擴增人基因組DNA中HLA-A、HLA-C位點基因 外顯子1-8全長序列和HLA-B位點基因外顯子1-7全長序列；
(3)、將步驟(2)得到的擴增產(chǎn)物進行雙酶切純化；
(4)、設(shè)計測序引物，將步驟(3)得到的純化產(chǎn)物進行測序PCR反應(yīng)；
(5)、將步驟(4)得到的測序產(chǎn)物進行醋酸鈉-乙醇沉淀法純化，進行毛細管電泳測序；
(6)、將步驟(5)獲得的序列通過軟件分析，確定其基因型。本發(fā)明另一個所要解決的技術(shù)問題是提供一種HLA基因分型的PCR-SBT方法所用 的試劑。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案它由用于擴增的引物和36條用于測序分析的寡 核苷酸測序引物組成；
所述用于擴增的引物為
HLA-A基因組全長擴增引物HLA-AF1或HLA-AF2中的其中一種以及HLA-AR，
HLA-AFl :5’ -TGTCGGGTTTCCAGAGAAGC-3’
HLA-AF2 :5’ -GGGTTTCCAGAGAAGCCAAT-3’
HLA-AR 5' -TTGGGGAGGGAGCACAGGTCAGCGTGGGAAG-3，；
HLA-B基因組全長擴增引物HLA-BF1或HLA-BF2中的其中一種以及HLA-BR，
HLA-BFl :5’ -GGCAGACAGTGTGACAAAGAGGC-3’
HLA-BF2 :5， - GAGTTTCACTTCTTCTCCCAAC-3，
HLA-BR 5' - CTGGGGAGGAAACACAGGTCAGCATGGG-3‘；
HLA-C基因組全長擴增引物=HLA-CFl或HLA-CF2中的其中一種以及HLA-CR，
HLA-CFl :5’ - TCAGGCACACAGTGTGACAAAGAT-3，
HLA-CF2 :5’ - CCAATTCCCACTCCCATTG-3，
HLA-CR 5' - TCGGGGAGGGAACACAGGTCAGTGTGGGGAC-3，；
所述36條寡核苷酸測序引物序列如下
HLA-A外顯子1-7的測序引物
HLA-AlF :5’ - GGGTTTCCAGAGAAGCCAAT-3’
HLA-AlR 5' - CMCGACCCCGCACTCACC-3‘
HLA-A2F :5’ - GCCTCTGYGGGGAGAAGC-3’
HLA-A2R :5’ -GCCCGTCCGTGGGGGATGA-3’
HLA-A3F :5’ - CCCACAGTCTCCGGGTCCGA-3’
HLA-A3R 5' - GTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT-3‘
HLA-A4F :5’ - GGTGTSCTGTCCATTCTCAAG-3’
7HLA-A4R 5' -GACACCCCCRTCTCCCTC -3， HLA-A5F :5’ - CCACAAGGAGGGGAGACAAT-3， HLA-A5R 5' - CACCTGAGCTRTTCCTCCTC-3， HLA-A67F :5，- CACATTTCTGGAAACTTCTCTG-3， HLA-A67R 5' - CGCATGCTCAATACATCCAA-3，； HLA-B外顯子1-7的測序引物 HLA-BlF :5’ - GIGGTCCCAGTTCTAAAGTCC-3’ HLA-BlR 5' - ACTCACCRGCCCAGGTCT-3‘ HLA-B2F :5’ - GCCGCGCCGGKAGGAGGGTC-3， HLA-B2R 5' - GACCCSGGCCGTMCGT-3‘ HLA-B3F :5’ - ACCICGIGGICIGGGCCAG-3’ HLA-B3R 5' - GGCCATCCCCGSCGACCTAT-3‘ HLA-B4F :5’ - GGTCACATGGGTGGTCCTAG-3’ HLA-B4R 5' - GGGCTCCTGCTTTCCCTG-3， HLA-B5F :5’ - GTCRGGRCCCCTCRTCTTC-3’ HLA-B5R 5' - TTCATTGTCACATGTGCTG-3‘ HLA-B67F :5’ - GTCCAGGACCCACACTTGCT-3’ HLA-B67R 5' - CCCACTCTAGACCCCAAGAA-3’ ； HLA-C外顯子1-7的測序引物 HLA-ClF :5’ - CCAATTCCCACTCCCATTG-3， HLA-ClR :5’ - TCCYAACCYCGCACTCAC-3， HLA-C2F :5’ - GACCCGGGGAGCCGCGCA-3’ HLA-C2R 5' - CGACCCGGG CCGTCCGTG-3' HLA-C3F :5’ - ACCICGIGGICIGGGCCAG-3’ HLA-C3R 5' -AGGCCATICCGGGAGATCTA -3， HLA-C4F :5’ - GGTGTCCTGTCCITTCTCA-3’ HLA-C4R 5' - GICTICTGCTTTCICTGA-3’ HLA-C5F :5’ - GCCCTTCAGCYRGGTCAG-3， HLA-C5R 5' - ACTTCTACCTGGGGCTTGAA-3， HLA-C67F :5’ - GGGTCCAAGACTAGGAGGTT-3’ HLA-C67R 5' - CACCACACATTCGAAACGTC-3，。
本發(fā)明中引物設(shè)計是PCR擴增的關(guān)鍵，有關(guān)引物設(shè)計的方法和軟件均可從英特網(wǎng) 上免費獲得。本發(fā)明所設(shè)計的寡核苷酸引物是根據(jù)IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi. ac.uk/imgt/hla/)中人類HLA-A、B、C位點基因序列中包括多態(tài)性位點在內(nèi)的連續(xù)寡核苷 酸序列而設(shè)計獲得的。所有引物的設(shè)計均避開突變位點或采用簡并引物方法，以免因位點 的漏檢而導(dǎo)致分型的錯誤。本發(fā)明以6對寡核苷酸引物分別擴增包含全部外顯子的HLA-A、 B、C位點全長片段，可保證包含所有外顯子的有效擴增。擴增引物的設(shè)計避開了 HLA-A、B、 C位點編碼序列的多態(tài)性位點，避免了任何突變點的漏檢從而導(dǎo)致的基因型誤判。測序引物 的設(shè)計能保證清晰準(zhǔn)確測得所擴增片段的全長序列，對外顯子序列進行雙向測序，從而將標(biāo)本進行精確的基因分型。本發(fā)明通過對HLA-A、B、C位點1_7外顯子進行全長序列測序，獲得HLA_A、B、C位 點相關(guān)外顯子的全長和部分內(nèi)含子寡核苷酸序列，精確地對其基因型進行分型。隨著DNA 序列分析儀的普及，PCR-SBT技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床檢測。高通量獲得的所有HLA-A、B、C位點 編碼序列精確信息在基因分型，多態(tài)性檢測，基因頻率調(diào)查分析等方面的應(yīng)用受到廣泛重 視，特別是造血干細胞移植供受者配型選擇和中國造血干細胞捐獻者資料庫的供者配型。本發(fā)明所提供的試劑和方法可作為一種獨立的、應(yīng)用廣泛的鑒定方法，解決了 HLA-A、B、C位點的準(zhǔn)確分型鑒定問題，發(fā)揮PCR-SBT對HLA-A、B、C位點基因定型操作結(jié)果 精確和高通量的特點，在臨床輸血醫(yī)學(xué)研究和遺傳學(xué)等領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用受到高度重視，對 于醫(yī)學(xué)研究單位、藥學(xué)研究和試劑開發(fā)單位具有重要的現(xiàn)實意義。特別是有利于提高造血 干細胞移植供受者HLA配型的準(zhǔn)確性，這對進一步提高器官移植的成功率和生存率具有重 要的意義，有利于選擇更合適的移植供者，降低移植過程中的排斥反應(yīng)，從而提高器官移植 水平。


圖1為本發(fā)明中檢測標(biāo)本的HLA-A、HLA-B, HLA-C位點基因組全長的PCR擴 增電泳圖譜。M為DNA Marker (DL15000，TaKaRa，從上到下條帶長度分別為15000bp， IOOOObp, 7500bp, 5000bp, 2500bp, IOOObp)，1 為 HLA-A 位點擴增片段，2 為 HLA-B 位點擴增 片段，3為HLA-C位點擴增片段。圖2為本發(fā)明中對1例檢測標(biāo)本HLA-A (A*02:07:01)的第1_7外顯子的全部測 序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶， T為胸腺嘧啶。El表示1號外顯子序列，E2表示2號外顯子序列，E3表示3號外顯子序列， E4表示4號外顯子序列，E5表示5號外顯子序列，E6表示6號外顯子序列，E7表示7號外 顯子序列。圖3為本發(fā)明中對1例檢測標(biāo)本HLA-B(B*15:01:01)的第1_7外顯子的全部測序 電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T 為胸腺嘧啶。El表示1號外顯子序列，E2表示2號外顯子序列，E3表示3號外顯子序列， E4表示4號外顯子序列，E5表示5號外顯子序列，E6表示6號外顯子序列，E7表示7號外 顯子序列。圖4為本發(fā)明中對1例檢測標(biāo)本HLA-C(C*01:02:01)的第1_7外顯子的全部測序 電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T 為胸腺嘧啶。El表示1號外顯子序列，E2表示2號外顯子序列，E3表示3號外顯子序列， E4表示4號外顯子序列，E5表示5號外顯子序列，E6表示6號外顯子序列，E7表示7號外 顯子序列。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明內(nèi)容作進一步詳細說明。實施例1
本實施具體以白血病患者進行HLA-A、HLA-B和HLA-C基因分型為例對本發(fā)明內(nèi)容做詳細說明，本發(fā)明所采用的一種HLA-A、HLA-B和HLA-C基因分型的PCR-SBT方法具體包括以 下步驟
1、制備人基因組DNA，作為后續(xù)步驟的PCR擴增模板。取待檢全血200yL，按照invitrogen DNA isolation試劑盒說明書提取基因組 DNA (可采用其他的方法抽提基因組DNA)，利用分光光度計測定基因組DNA的濃度和純度。2、合成6對擴增引物和36條測序引物，將擴增引物用純水稀釋至50 μ M，所述擴增 引物和測序引物見發(fā)明內(nèi)容中，在此不再贅述，
準(zhǔn)備 LA Taq 酶(TaKaRa)UOX 緩沖液(TaKaRa)、dNTP (TaKaRa)^Mg2+ (TaKaRa)JifoR, 與步驟1所制備的PCR擴增模板按表1所述體系配制PCR擴增體系 表1 步驟2中HLA-A、HLA-B和HLA-C基因組全長PCR擴增體系
其中HLA-A的擴增體系中，引物1 =HLA-AFl或者HLA-AF2中選擇任意一條，引物2 HLA-AR ； HLA-B的擴增體系中，引物1 :HLA_BF1或者HLA-BF2中選擇任意一條，引物2 HLA-BR ； HLA-C的擴增體系中，引物1 :HLA_CF1或者HLA-CF2中選擇任意一條，引物2 HLA-CR0用PCR儀(ABI9700)分別按以下程序擴增
擴增條件預(yù)變性 95° C 5min ；95° C 30s, 67° C 45s, 72° C，3min30s，35 個循環(huán)； 72° C IOmin 冷卻到 4° C。3、擴增產(chǎn)物的雙酶切純化。HLA-A、B、C位點所擴增片段各取3 μ L PCR產(chǎn)物 進行瓊脂糖凝膠電泳，如圖1所示，擴增后可得到單一片段，長度與預(yù)期大小符合，約為 3. 2-3. 3Kb，表明體系擴增成功。在剩余的PCR產(chǎn)物中分別加入蝦堿性磷酸酶(SAP，1 U/μ L, Promega)和核酸外切酶I (Exo- I，5 U/μ L，TaKaRa)，利用蝦堿性磷酸酶(SAP)的DNA 5' 端去磷酸化功能以及核酸外切酶I (Exo- I )的單鏈特異性3' — 5'核酸外切酶功能，進 行擴增產(chǎn)物純化。在25 μ L擴增產(chǎn)物體系中加入SAP IyL和Exo- I 2 yL, 37 °C 30 min 酶切反應(yīng)，80 V 15 min滅活酶的活性。4、對PCR產(chǎn)物進行測序PCR。將步驟3中純化之后的PCR產(chǎn)物中加入25 μ L純水 稀釋，混勻。測序引物用純水稀釋至3. 2 μΜ，以BigDye terminator v3. 1 sequencing kit (美國ABI公司)試劑按照表2配制反應(yīng)體系
表2 步驟4中PCR產(chǎn)物的PCR測序體系
以所擴增純化的片段為模板，分別進行48個反應(yīng)體系，用PCR儀(ABI9700)按以下程 序擴增96° C Imin ；96° C 10s，50° C 5s,60° C 4min，25個循環(huán)。測序引物濃度為 3. 2μΜ,稀釋的上述純化后DNA模板2 μ 1。5、測序擴增PCR產(chǎn)物直接用醋酸鈉/乙醇純化法進行純化。將步驟4中測序擴增 PCR產(chǎn)物直接用醋酸鈉/乙醇純化法進行純化。直接在PCR產(chǎn)物中加入1 μ L EDTAC0. 125Μ) 禾口 25 μ 1醋酸鈉(3Μ)/無水乙醇(1 40)混合液，混勻，靜置15分鐘，3000g離心30min ；去 除上清，加入75%乙醇，3000g離心lOmin，去除上清，酒精揮發(fā)后加入10 μ 1甲酰胺溶解， 95° C變性3min，迅速在冰上冷卻。將制備好的產(chǎn)物在ABI 3730測序儀上進行高通量測 序，以ASSign3. 5或其他HLA專業(yè)軟件分析。6、將制備好的產(chǎn)物在ABI 3730測序儀上進行高通量分析，所測序列結(jié)果(圖2_4) 利用Assign3. 5或其他HLA專業(yè)軟件進行序列比對，按照IMGT/HLA Databasehttp //ebi. ac. uk/imgt/hla)數(shù)據(jù)庫序列確定HLA-A、HLA_B和HLA-C的基因型，結(jié)果顯示檢測標(biāo)本HLA 座位結(jié)果為111^-六*02:07:01(圖2)，8*15:01:01 (圖 3)，OOl 02 Ol (圖 4)。所以，本發(fā)明所提供的試劑和方法可作為一種獨立的、應(yīng)用廣泛的鑒定方法，解決 了 HLA-A、B、C位點的準(zhǔn)確分型鑒定問題，發(fā)揮PCR-SBT對HLA_A、B、C位點基因分型結(jié)果精 確、高通量操作的特點，在臨床輸血醫(yī)學(xué)研究和遺傳學(xué)等領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用受到高度重視，對 于醫(yī)學(xué)研究單位、藥學(xué)研究和試劑開發(fā)單位具有重要的現(xiàn)實意義。特別是有利于提高造血 干細胞移植供受者HLA配型的準(zhǔn)確性，這對進一步提高器官移植的成功率和生存率具有重 要的意義，有利于選擇更合適的移植供者，降低移植過程中的排斥反應(yīng)，從而提高器官移植 水平。
權(quán)利要求
一種HLA基因分型的PCR SBT方法，其特征在于它對HLA A位點1 7外顯子、HLA B位點1 7外顯子、HLA C位點1 7外顯子進行基因分型，包括以下步驟(1)、制備人基因組DNA；(2)、設(shè)計擴增引物，用聚合酶鏈反應(yīng)分別擴增人基因組DNA中HLA A、HLA C位點基因外顯子1 8全長序列和HLA B位點基因外顯子1 7全長序列；(3)、將步驟(2)得到的擴增產(chǎn)物進行雙酶切純化；(4)、設(shè)計測序引物，將步驟(3)得到的純化產(chǎn)物進行測序PCR反應(yīng)；(5)、將步驟(4)得到的測序產(chǎn)物進行醋酸鈉 乙醇沉淀法純化，進行毛細管電泳測序；(6)、將步驟(5)獲得的序列通過軟件分析，確定其基因型。
2.如權(quán)利要求1所述的一種HLA基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于所述步驟(2) 中的引物為HLA-A基因組全長擴增引物對HLA-AFl和HLA-AR或者HLA-AF2和HLA-AR，HLA-AFl :5’ -TGTCGGGTTTCCAGAGAAGC-3’HLA-AF2 :5’ -GGGTTTCCAGAGAAGCCAAT-3’HLA-AR 5' -TTGGGGAGGGAGCACAGGTCAGCGTGGGAAG-3，；HLA-B基因組全長擴增引物對HLA-BFl和HLA-BR或者HLA-BF2和HLA-BR，HLA-BFl :5’ -GGCAGACAGTGTGACAAAGAGGC-3’HLA-BF2 :5， - GAGTTTCACTTCTTCTCCCAAC-3，HLA-BR 5' - CTGGGGAGGAAACACAGGTCAGCATGGG-3‘；HLA-C基因組全長擴增引物對HLA-CFl和HLA-CR或者HLA-CF2和HLA-CR，HLA-CFl :5’ - TCAGGCACACAGTGTGACAAAGAT-3，HLA-CF2 :5’ - CCAATTCCCACTCCCATTG-3，HLA-CR 5' - TCGGGGAGGGAACACAGGTCAGTGTGGGGAC-3，；所述步驟(4)中的引物為用于測序分析的36條寡核苷酸測序引物；HLA-A外顯子1-7的測序引物HLA-AlF :5’ - GGGTTTCCAGAGAAGCCAAT-3’HLA-AlR 5' - CMCGACCCCGCACTCACC-3‘HLA-A2F :5’ - GCCTCTGYGGGGAGAAGC-3’HLA-A2R :5’ -GCCCGTCCGTGGGGGATGA-3’HLA-A3F :5’ - CCCACAGTCTCCGGGTCCGA-3’HLA-A3R 5' - GTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT-3‘HLA-A4F :5’ - GGTGTSCTGTCCATTCTCAAG-3’HLA-A4R 5' -GACACCCCCRTCTCCCTC -3，HLA-A5F :5’ - CCACAAGGAGGGGAGACAAT-3，HLA-A5R 5' - CACCTGAGCTRTTCCTCCTC-3，HLA-A67F :5，- CACATTTCTGGAAACTTCTCTG-3，HLA-A67R 5' - CGCATGCTCAATACATCCAA-3，；HLA-B外顯子1-7的測序引物HLA-BlF :5’ - GIGGTCCCAGTTCTAAAGTCC-3’HLA-BlR 5' - ACTCACCRGCCCAGGTCT-3‘ HLA-B2F :5’ - GCCGCGCCGGKAGGAGGGTC-3， HLA-B2R 5' - GACCCSGGCCGTMCGT-3‘ HLA-B3F :5’ - ACCICGIGGICIGGGCCAG-3’ HLA-B3R 5' - GGCCATCCCCGSCGACCTAT-3‘ HLA-B4F :5’ - GGTCACATGGGTGGTCCTAG-3’ HLA-B4R 5' - GGGCTCCTGCTTTCCCTG-3， HLA-B5F :5’ - GTCRGGRCCCCTCRTCTTC-3’ HLA-B5R 5' - TTCATTGTCACATGTGCTG-3‘ HLA-B67F :5’ - GTCCAGGACCCACACTTGCT-3’ HLA-B67R 5' - CCCACTCTAGACCCCAAGAA-3’ ； HLA-C外顯子1-7的測序引物 HLA-ClF :5’ - CCAATTCCCACTCCCATTG-3， HLA-ClR :5’ - TCCYAACCYCGCACTCAC-3， HLA-C2F :5’ - GACCCGGGGAGCCGCGCA-3’ HLA-C2R 5' - CGACCCGGG CCGTCCGTG-3' HLA-C3F :5’ - ACCICGIGGICIGGGCCAG-3’ HLA-C3R 5' -AGGCCATICCGGGAGATCTA -3， HLA-C4F :5’ - GGTGTCCTGTCCITTCTCA-3’ HLA-C4R 5' - GICTICTGCTTTCICTGA-3’ HLA-C5F :5’ - GCCCTTCAGCYRGGTCAG-3， HLA-C5R 5' - ACTTCTACCTGGGGCTTGAA-3， HLA-C67F :5’ - GGGTCCAAGACTAGGAGGTT-3’ HLA-C67R 5' - CACCACACATTCGAAACGTC-3，。
3.如權(quán)利要求1所述的一種HLA基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于所述步驟(4) 中純化所需的兩種酶為蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶I。
4.一種HLA基因分型的PCR-SBT方法所用的試劑，其特征在于它由用于擴增的引物和 36條用于測序分析的寡核苷酸測序引物組成；所述用于擴增的引物為HLA-A基因組全長擴增引物HLA-AFl或HLA-AF2的其中一種以及HLA-AR，HLA-AFl :5’ -TGTCGGGTTTCCAGAGAAGC-3’HLA-AF2 :5’ -GGGTTTCCAGAGAAGCCAAT-3’HLA-AR 5' -TTGGGGAGGGAGCACAGGTCAGCGTGGGAAG-3，；HLA-B基因組全長擴增引物HLA-BF1或HLA-BF2的其中一種以及HLA-BR，HLA-BFl :5’ -GGCAGACAGTGTGACAAAGAGGC-3’HLA-BF2 :5， - GAGTTTCACTTCTTCTCCCAAC-3，HLA-BR 5' - CTGGGGAGGAAACACAGGTCAGCATGGG-3‘；HLA-C基因組全長擴增引物=HLA-CFl或HLA-CF2的其中一種以及HLA-CR，HLA-CFl :5’ - TCAGGCACACAGTGTGACAAAGAT-3，HLA-CF2 :5’ - CCAATTCCCACTCCCATTG-3，HLA-CR 5' - TCGGGGAGGGAACACAGGTCAGTGTGGGGAC-3，；所述36條寡核苷酸測序引物序列如下HLA-A外顯子1-7的測序引物HLA-AlF :5’ - GGGTTTCCAGAGAAGCCAAT-3’HLA-AlR 5' - CMCGACCCCGCACTCACC-3‘HLA-A2F :5’ - GCCTCTGYGGGGAGAAGC-3’HLA-A2R :5’ -GCCCGTCCGTGGGGGATGA-3’HLA-A3F :5’ - CCCACAGTCTCCGGGTCCGA-3’HLA-A3R 5' - GTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT-3‘HLA-A4F :5’ - GGTGTSCTGTCCATTCTCAAG-3’HLA-A4R 5' -GACACCCCCRTCTCCCTC -3，HLA-A5F :5’ - CCACAAGGAGGGGAGACAAT-3，HLA-A5R 5' - CACCTGAGCTRTTCCTCCTC-3，HLA-A67F :5，- CACATTTCTGGAAACTTCTCTG-3，HLA-A67R 5' - CGCATGCTCAATACATCCAA-3，；HLA-B外顯子1-7的測序引物HLA-BlF :5’ - GIGGTCCCAGTTCTAAAGTCC-3’HLA-BlR 5' - ACTCACCRGCCCAGGTCT-3‘HLA-B2F :5’ - GCCGCGCCGGKAGGAGGGTC-3，HLA-B2R 5' - GACCCSGGCCGTMCGT-3‘HLA-B3F :5’ - ACCICGIGGICIGGGCCAG-3’HLA-B3R 5' - GGCCATCCCCGSCGACCTAT-3‘HLA-B4F :5’ - GGTCACATGGGTGGTCCTAG-3’HLA-B4R 5' - GGGCTCCTGCTTTCCCTG-3，HLA-B5F :5’ - GTCRGGRCCCCTCRTCTTC-3’HLA-B5R 5' - TTCATTGTCACATGTGCTG-3‘HLA-B67F :5’ - GTCCAGGACCCACACTTGCT-3’HLA-B67R 5' - CCCACTCTAGACCCCAAGAA-3’ ；HLA-C外顯子1-7的測序引物HLA-ClF :5’ - CCAATTCCCACTCCCATTG-3，HLA-ClR :5’ - TCCYAACCYCGCACTCAC-3，HLA-C2F :5’ - GACCCGGGGAGCCGCGCA-3’HLA-C2R 5' - CGACCCGGG CCGTCCGTG-3'HLA-C3F :5’ - ACCICGIGGICIGGGCCAG-3’HLA-C3R 5' -AGGCCATICCGGGAGATCTA -3，HLA-C4F :5’ - GGTGTCCTGTCCITTCTCA-3’HLA-C4R 5' - GICTICTGCTTTCICTGA-3’HLA-C5F :5’ - GCCCTTCAGCYRGGTCAG-3，HLA-C5R 5' - ACTTCTACCTGGGGCTTGAA-3， HLA-C67F :5’ - GGGTCCAAGACTAGGAGGTT-3’ HLA-C67R 5' - CACCACACATTCGAAACGTC—3，。
全文摘要
本發(fā)明提供一種HLA基因分型的PCR-SBT方法，它對HLA-A位點1-7外顯子、HLA-B位點1-7外顯子、HLA-C位點1-7外顯子進行基因分型，包括以下步驟(1)、制備人基因組DNA；(2)、設(shè)計擴增引物；(3)、將擴增產(chǎn)物進行雙酶切純化；(4)、設(shè)計測序引物，將純化產(chǎn)物進行測序PCR反應(yīng)；(5)、將測序產(chǎn)物進行醋酸鈉-乙醇沉淀法純化，進行毛細管電泳測序；(6)、將獲得的序列通過軟件分析，確定其基因型。本發(fā)明通過對HLA-A、B、C位點1-7外顯子進行全長序列測序，獲得HLA-A、B、C位點相關(guān)外顯子的全長和部分內(nèi)含子寡核苷酸序列，精確地對其基因型進行分型。
文檔編號C12Q1/68GK101928776SQ20101025643
公開日2010年12月29日 申請日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月18日
發(fā)明者嚴(yán)力行, 朱發(fā)明, 章偉 申請人:浙江省血液中心