專利名稱：用反向遺傳操作拓展口蹄疫疫苗株抗原譜及疫苗制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用反向遺傳操作拓展口蹄疫疫苗株抗原譜及疫苗制備方法。
背景技術(shù)：
口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由 口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的豬、牛、羊等多種偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染 病。因其傳染性極強(qiáng)，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(FA0/0IE)將其列為必報(bào)疫病之首，我國(guó)規(guī)定為一 類動(dòng)物傳染病。該病的爆發(fā)和流行使家畜的生產(chǎn)力下降，活畜及畜產(chǎn)品貿(mào)易停滯，經(jīng)濟(jì)損失 巨大；同時(shí)，給公共衛(wèi)生和國(guó)家聲譽(yù)造成嚴(yán)重的負(fù)面影響。因此，世界各國(guó)十分重視對(duì)該病 的防控。目前，在世界上許多國(guó)家，尤其是非洲、亞洲和南美洲國(guó)家，該病發(fā)生次數(shù)頻繁，流 行嚴(yán)重。此外，不時(shí)出現(xiàn)全球的流行性爆發(fā)。預(yù)防和控制口蹄疫的一個(gè)主要措施是用疫苗免疫易感動(dòng)物。常用的有效疫苗是 滅活疫苗。其制備是用篩選的口蹄疫病毒接種培養(yǎng)的細(xì)胞，大量增殖病毒，收獲病毒，經(jīng)滅 活后與佐劑乳化而成。篩選的口蹄疫病毒即為疫苗株，也叫種毒。疫苗株必須滿足的一個(gè) 要求是其抗原關(guān)系與流行的口蹄疫病毒(流行毒)密切。然而，口蹄疫病毒易發(fā)生變異，在 不同畜種、不同地區(qū)流行的病毒，經(jīng)反復(fù)感染，循環(huán)流行，會(huì)衍化出多個(gè)變異株(遺傳關(guān)系 密切的毒株歸為一個(gè)譜系)，抗原有差異[B. Borrego, I. S. Novella, Ε. Giralt，D. Andreu, Ε. Domingo. 1993. Distinct repertoire of antigenic variants of foot-and-mouth disease virus in the presence or absence of immune selection. J. Virol.67, 6071-6079, A.Holguin, J. Hernandez, M.A.Martinez, M. G.Mateu, E. Domingo. 1997. Differential restrictions on antigenic variation among antigenic sites of foot-and-mouth disease virus in the absence of antibody selection. J Gene Virol. ,78 601-609] 0其結(jié)果使原有疫苗株的有效性減弱甚至喪失，難以達(dá)到免疫防疫要 求，需要更換新的疫苗株，才能起到有效的免疫防控效果。疫苗株有效性減弱的根本原因是抗原關(guān)系和流行毒疏遠(yuǎn)，不匹配。和其它病毒一 樣，不同病毒株間的抗原關(guān)系與組成病毒蛋白(結(jié)構(gòu)蛋白)的氨基酸序列有關(guān)(口蹄疫病 毒的結(jié)構(gòu)蛋白有VP4，VP2，VP3，VP1四種，其中VPl暴露于病毒顆粒表面，且有一段氨基酸鏈 形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)(G-H環(huán))外露)。更為精確地說(shuō)決定抗原關(guān)系的分子基礎(chǔ)是抗原決定族或抗 原位點(diǎn)氨基酸序列組成的異同。當(dāng)抗原決定族或抗原位點(diǎn)氨基酸序列發(fā)生變異，形成抗原 性有差異的變異株，當(dāng)發(fā)生多處變異或氨基酸累積變異，這種衍化的變異株與原病毒的抗 原關(guān)系逐漸疏遠(yuǎn)，原病毒作為疫苗株難以發(fā)揮有效的免疫預(yù)防作用，需要篩選新的疫苗株。 但篩選新的疫苗株費(fèi)時(shí)費(fèi)力，甚至篩選不到滿足要求的種毒。更為困難的是，在一個(gè)地區(qū)或 國(guó)家存在多個(gè)抗原差異的流行毒，篩選一個(gè)能匹配多個(gè)譜系流行毒的疫苗株幾乎不可能實(shí) 現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一株口蹄疫病毒毒株。本發(fā)明所提供的口蹄疫病毒毒株，其VP3和VPl結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 4中第304-736位氨基酸殘基所示。上述口蹄疫病毒毒株的結(jié)構(gòu)蛋白如SEQ ID NO 4中第1_736位氨基酸殘基所示；上述口蹄疫病毒毒株中，所述VP3和VPl結(jié)構(gòu)蛋白的編碼基因如SEQ ID NO :2中 第2569-3867位核苷酸所示；上述口蹄疫病毒毒株中，結(jié)構(gòu)蛋白的編碼基因如SEQ ID NO 2中第1660-3867位 核苷酸所示。上述口蹄疫病毒毒株的基因組RNA對(duì)應(yīng)的cDNA序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種疫苗。本發(fā)明所提供的疫苗，其活性成分為滅活的上述任一所述口蹄疫病毒毒株。上述疫苗中，所述疫苗為口蹄疫疫苗；上述疫苗中，使用的佐劑為IS201 ；佐劑IS201的產(chǎn)品名稱為Montanide ISA 201VG，購(gòu)自法國(guó)SEPPIC公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為L(zhǎng)01408。上述疫苗中，所述口蹄疫為0型口蹄疫病毒引起的口蹄疫；上述疫苗中，所述0型口蹄疫病毒為豬源的；上述疫苗中，所述0型口蹄疫病毒為中國(guó)譜系或泛亞譜系或緬甸98譜系；上述疫苗中，所述中國(guó)譜系病毒毒株為O/TL/Taiwan/97，所述泛亞譜系病毒毒株 為0/China/99，所述緬甸98譜系病毒毒株為0/GS/2010。上述任一所述口蹄疫病毒毒株在制備疫苗中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述應(yīng)用中，所述疫苗為口蹄疫疫苗；上述應(yīng)用中，使用的佐劑為IS201 ；佐劑IS201的產(chǎn)品名稱為Montanide ISA 201VG，購(gòu)自法國(guó)SEPPIC公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為L(zhǎng)01408。上述應(yīng)用中，所述口蹄疫為0型口蹄疫病毒引起的口蹄疫；上述應(yīng)用中，所述0型口蹄疫病毒為豬源的；上述應(yīng)用中，所述0型口蹄疫病毒為中國(guó)譜系或泛亞譜系或緬甸98譜系；上述應(yīng)用中，所述中國(guó)譜系病毒毒株為O/TL/Taiwan/97，所述泛亞譜系病毒毒株 為0/China/99，所述緬甸98譜系病毒毒株為0/GS/2010。本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種拓展口蹄疫病毒抗原譜的方法。本發(fā)明所提供的拓展口蹄疫病毒抗原譜的方法，包括如下步驟1)獲得出發(fā)口蹄 疫病毒基因組RNA互補(bǔ)的cDNA ；2)將所述cDNA中的編碼出發(fā)口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白的編 碼基因進(jìn)行突變或?qū)⑺鯿DNA中的編碼出發(fā)口蹄疫病毒的抗原決定簇的編碼基因進(jìn)行突 變，使突變后的編碼基因與待抗口蹄疫病毒毒株的等位基因相同，得到抗原譜廣于所述出 發(fā)口蹄疫病毒的目的口蹄疫病毒的基因組cDNA ；3)表達(dá)得到步驟2)所述目的口蹄疫病毒。上述方法中，所述出發(fā)口蹄疫病毒為任一血清型的野生型病毒，或通過(guò)任意操作 獲得的口蹄疫病毒；上述方法中，所述任意操作為培育或基因操作；上述方法中，所述出發(fā)口蹄疫病毒優(yōu)先為免疫原性好、復(fù)制性能強(qiáng)和病毒滴度高的野生型病毒；上述方法中，所述抗原決定簇為B細(xì)胞抗原決定簇或T細(xì)胞抗原決定簇。由上述任一所述方法得到的口蹄疫病毒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所提供的拓展口蹄疫病毒抗原譜的方法如下1、獲得一株口蹄疫病毒全基因組RNA互補(bǔ)的cDNA片段；2、利用基因操作技術(shù)突變cDNA的一些堿基或密碼子，使之與流行毒株的等位基 因相同；3、按口蹄疫病毒基因組順序，串連突變和未突變的cDNA片段，連接入一質(zhì)粒載體 的T7啟動(dòng)子下游，構(gòu)建成口蹄疫病毒基因組全長(zhǎng)感染性cDNA重組質(zhì)粒；4、核酸內(nèi)切酶線化重組質(zhì)粒DNA，體外轉(zhuǎn)錄為RNA，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞；或線化的重 組質(zhì)粒DNA與表達(dá)T7RNA聚合酶的重組質(zhì)粒DNA同時(shí)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞；或線化的重組質(zhì)粒 DNA直接轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的表達(dá)T7RNA聚合酶的細(xì)胞系，產(chǎn)生口蹄疫病毒，拯救獲得的病毒即為拓 展了抗原譜的口蹄疫病毒。所述方法1中，所述口蹄疫病毒為分離的任一血清型的野生型病毒，或通過(guò)任意 操作獲得的口蹄疫病毒，包括培育的和基因操作獲得的病毒，優(yōu)先為免疫原性好，復(fù)制性能 強(qiáng)，病毒滴度高的野生型病毒。所述互補(bǔ)的cDNA為口蹄疫病毒基因組RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物 或依據(jù)口蹄疫病毒基因組RNA序列人工化學(xué)合成的cDNA。所述方法2中，所述cDNA為不同的口蹄疫病毒株基因組的同一功能區(qū)域的cDNA， 優(yōu)先為各結(jié)構(gòu)蛋白基因cDNA，更優(yōu)先為抗原位點(diǎn)的編碼基因cDNA，包括B細(xì)胞和T細(xì)胞抗 原位點(diǎn)編碼基因cDNA。所述突變?yōu)榛虿僮魉軐?shí)現(xiàn)堿基或密碼子替換的任意技術(shù)，包括 人工化學(xué)合成技術(shù)。所述方法3中，所述突變的cDNA為方法2所得。所屬口蹄疫病毒基因組全長(zhǎng)感染 性cDNA為突變和未突變的cDNA片段連接產(chǎn)物，包含T7啟動(dòng)子。所述方法4中，所述重組質(zhì)粒DNA為方法3所得。所述細(xì)胞為體外培養(yǎng)的口蹄疫 病毒敏感的細(xì)胞系，如BHK21、IB-RS-2和PK15等；所述T7 RNA聚合酶細(xì)胞為攜帶T7 RNA 聚合酶基因的細(xì)胞系，優(yōu)先為攜帶T7聚合酶基因的BHK21和IB-RS-2細(xì)胞系。本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)目前東南亞地區(qū)流行的多譜系0型口蹄疫病毒，利用反向遺傳 操作技術(shù)，對(duì)免疫原性強(qiáng)、復(fù)制性能好(病毒滴度高)的口蹄疫病毒(0ZK/93-08)基因組全長(zhǎng) cDNA突變修飾后，拯救獲得了基因工程病毒。該病毒的抗原位點(diǎn)中數(shù)個(gè)氨基酸突變?yōu)?/TL/ Taiwan/97病毒(屬CATHAY，中國(guó)型譜系，豬源毒)的，另幾個(gè)氨基酸突變?yōu)镺/China/99病毒 (屬Pan-Asia，泛亞譜系)和0/GS/2010病毒(屬SEA_Mya98，東南亞型緬甸98譜系)的。用 該病毒作為疫苗株，在培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞上增殖后滅活，與ISA201佐劑(法國(guó)SEPPIC)乳 化制成疫苗，肌肉接種免疫豬，能有效保護(hù)中國(guó)譜系豬源流行毒、泛亞譜系豬源流行毒和緬甸 98譜系豬源流行毒的攻擊，提高了對(duì)中國(guó)譜系豬源流行毒的保護(hù)率，免疫效力增加，表明抗 原譜變廣。因此，利用反向遺傳操作技術(shù)能拓展口蹄疫病毒的抗原譜。實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明得到的突變病毒株制成疫苗，可以同時(shí)抗中國(guó)譜系豬源流 行毒O/TL/Taiwan/97、泛亞譜系豬源流行毒O/China/99和緬甸98譜系豬源流行毒0/ GS/2010的侵害，具有抗原譜廣的特性，免疫豬，能明顯提高對(duì)抗原性有差異的同型口蹄疫 病毒攻擊的保護(hù)率，達(dá)到交叉保護(hù)的免疫效果，在預(yù)防和控制口蹄疫中將發(fā)揮重要作用。


圖1為FMDV 0ZK/93-08株全長(zhǎng)cDNA分子克隆的構(gòu)建策略。圖2為突變修飾的口蹄疫病毒0ZK/93-08株全基因組感染性cDNA克隆的構(gòu)建過(guò) 程示意圖。圖3為突變病毒rV-OSYNa氨基酸突變示意圖。圖4為含突變氨基酸的1674bp片段和重組質(zhì)粒p0ZK_Z123DKV的酶切鑒定電泳圖。圖5為A、B和C片段的電泳圖。圖6為重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖。圖7為病毒rV-OSyNa感染BHK-21細(xì)胞后引起的CPE。圖8為突變病毒的鑒定結(jié)果。A為OZK父本拯救病毒部分VP3、VP1測(cè)序峰圖；B為 修飾病毒rV-OSyNa部分VP3、VPl測(cè)序峰圖；C為修飾病毒rV_0SyNa和OZK父本拯救病毒 部分VPl測(cè)序峰圖，左rV-0SyNa VPl測(cè)序峰圖；右0ΖΚ父本拯救病毒VPl測(cè)序峰圖。圖9為間接免疫熒光檢測(cè)拯救病毒在BHK上的復(fù)制。圖10為電鏡下rV-OSyNa拯救病毒粒子。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室獲得以下病毒 株口蹄疫病毒0ZK/93-08株、0型中國(guó)譜系豬源流行毒O/TL/Taiwan/97、0型泛亞譜系豬 源流行毒0/China/99、0型緬甸98譜系豬源流行毒0/GS/2010。上述菌株在農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局 指定國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室保藏，公眾可通過(guò)農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局批示的委托函獲得。0 型中國(guó)譜系豬源流行毒 0/TL/Taiwan/97 在文獻(xiàn)[Tsai, C. P.，Pan, C. H.，Liu, M. Y.，Lin, Y. L.，Chen, C. Μ.，Huang, Τ. S.，Cheng, I. C.，Jong, Μ. H. and Yang, P. C. 2000. Molecular epidemiological studies on foot-and-mouth disease type 0 Taiwan viruses from the 1997 epidemic. Vet. Microbiol. 74 (3), 207-216.]中公開(kāi)過(guò)，由中國(guó)農(nóng) 業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供。該毒株的genebank的序列號(hào)為Accession No.AF030259。實(shí)施例1、突變毒株的制備及功能驗(yàn)證一、口蹄疫病毒基因組RNA對(duì)應(yīng)的全長(zhǎng)cDNA重組質(zhì)粒構(gòu)建設(shè)計(jì)合成下列寡核苷酸引物(上海桑尼有限公司合成)Zl :agactagt taatacgactcactataggg ttgaaagggggcgctagggtZ1-2 tggttggggggggggggggggtgaaZ2 :ttcaccccccccccccccccaaccaZ2~2 :agcgtggagtcgagcacagtacZ3 :ggtctaagcaggtttccacaactgZ3-2 :aactgcagtgcttcgtgctgccctttctcaatgZ4 :gctaagcttggaactccacgaaaaggtgtcga
6
Z4-2 .Jtggcgcgccgcggccgc ttttttttttttttttttttt [注斜體的核苷酸為另外加
的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，后面的為序列中的核苷酸].Tl:gaaaacgcctgaggccgccgcacactgcattTl-2 :aatgcagtgtgcggcggcctcaggcgttttcT2 :gtgaagaagatatctgactcgctctccagtT2-2 :actggagagcgagtcagatatcttcttcac用RNeasy mini Kit(Qiagen)提取口蹄疫病毒 0ZK/93-08 株的總 RNA,分別用 Ζ2-2、Ζ3-2和Ζ4-2引物，合成第一鏈cDNA。以第一鏈CDNA為模板，用4對(duì)引物Z1/Z1_2、Z2/ Z2-2、Z3/Z3-2和Z4/Z4-2，擴(kuò)增獲得4個(gè)相互重疊的cDNA雙鏈片段，分別命名為ZlcDNA、 Z2cDNA、Z3cDNA 和 Z4cDNA。Z3cDNA 和 pBluescriptSKhdv 載體分別用 XbaI 和 BglII (TakaRa)消化后連接，得 到重組質(zhì)粒pSK-Z3。pBluescriptSKhdv載體在文獻(xiàn)“《華北農(nóng)學(xué)報(bào)》2010年第25卷第3期， 曹偉軍，李平花，白興文等，口蹄疫病毒0/HN/93疫苗株的拯救及病毒活性鑒定”中公開(kāi)過(guò)， 公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所獲得。利用 QuikChangeOLightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)定 點(diǎn)突變?cè)噭┖?，以引物?duì)T1/T1-2和T2/T2-2進(jìn)行定點(diǎn)突變引入分子標(biāo)簽。分別依次突變 了重組質(zhì)粒PSK-Z3中2985位的NotI (TakaRa)位點(diǎn)和4238位的BglII (TakaRa)位點(diǎn)，得 到陽(yáng)性重組質(zhì)粒P0ZK-Z3。ZlcDNA和Z2cDNA混合作模板，用一對(duì)引物Z1/Z2-2進(jìn)行融合PCR，得Z12cDNA。 Z12cDNA與pMD20-T質(zhì)粒(TakaRa)連接，得到重組質(zhì)粒pMD_Z12。pMD-Z12 和 pBluescriptSKhdv 質(zhì)粒載體分別用 KpnI/Xbal (TakaRa)雙酶切消化 后，純化回收相應(yīng)的目的片段，連接得到重組質(zhì)粒P0ZK-Z12。用BglΙΙ/XbaI (TakaRa)分別 雙酶切消化重組質(zhì)粒P0ZK-Z12和ρ0ΖΚ-Ζ3，純化回收相應(yīng)的目的片段，連接得到重組質(zhì)粒 P0ZK-Z123。最后用Bglll/NotI (TakaRa)分別消化重組質(zhì)粒p0ZK_Z123和Ζ4片段，純化回 收，連接得到含口蹄疫病毒0ΖΚ/93-08株全基因組⑶NA克隆的重組質(zhì)粒p0ZKF_Z1234。測(cè) 序驗(yàn)證，結(jié)果在pBluescriptSKhdv質(zhì)粒載體的Kpn I/Not I (TakaRa)位點(diǎn)間插入了 SEQ ID NO 1所示核苷酸序列(即病毒0ZK/93-08的基因組RNA對(duì)應(yīng)的DNA，Z1234)。核苷酸序列Z1的核苷酸序列為SEQ ID NO 1中第1_389位核苷酸；Z2的核苷 酸序列為SEQ ID NO 1中第365-696位核苷酸；Z3的核苷酸序列為SEQ ID NO 1中第 588-5394位核苷酸；Z4的核苷酸序列為SEQ ID NO 1中第5289-8137位核苷酸。結(jié)構(gòu)蛋白VP4-VP2-VP3-VP1的編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO 1中第 1660-3867位核苷酸。VP4的編碼序列為SEQ ID NO 1中第1660-1914位核苷酸；VP2的 編碼序列為SEQ ID NO 1中第1915-2568位核苷酸；VP3的編碼序列為SEQ ID NO 1中第 2569-3228位核苷酸；VPl的編碼序列為SEQ ID NO 1中第3229-3867位核苷酸。上述構(gòu)建過(guò)程如圖1所示。最后得到的病毒基因組中，1表示5' UTR，2表示L，3 表示VP4,4表示VP2, 5表示VP3，6表示VPl，7表示2A, 8表示2B, 9表示2C, 10表示3A, 11 表示 3B，12 表示 3C，13 表示 3D，14 表示 3' UTR。VP4、VP2、VP3、VP1 為結(jié)構(gòu)蛋白，L、2A、2B、 2C、3A、3B、3C、3D為非結(jié)構(gòu)蛋白。二、突變修飾基因
載體pUC57購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為SD1176。合成病毒株0ZK/93-08編碼區(qū)DNA (即SEQ ID NO 3中第1056-8024位核苷酸)， 含VP3 58位、VPl 43位和48位氨基酸突變(58E — D、43T — K和481 — V)，將合成DNA片 段與載體PUC57連接，測(cè)序驗(yàn)證，得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒，記作pHC。用下列引物，構(gòu)建突變口蹄疫病毒的基因組全長(zhǎng)cDNA重組質(zhì)粒pOZKF-TmFull，構(gòu) 建過(guò)程如圖2所示。EapaI (+) CCGGGCCCAATACCTCTGGACTGGAAAC ；EsacI(-) GTTGAAGGAGGTGGGCAGAGCTCTCTC ；F207(+) :TACGGTGACACTAGCACTAACAACGTGCGGGGAGACCTGCAGGTGCTG ；R1629(-) :CAGCACCTGCAGGTCTCCCCGCACGTTGTTAGTGCTAGTGTCACCGTA ；EXmal(-) TGCTTGTGTCTAGCGTCACTCG ；Exma2(-) :CTGTTTTGCGGGTGCCACGATC ；Eky2027(+) :GGTGACGTACGGGTATGCAACAGC。以pHC 質(zhì)粒為模板，用 Eapal(+)/EsacI(_)引物，PCR 擴(kuò)增含 VP3 58 位，VPl 43 位和48位氨基酸突變的1674bp的目的片段(即SEQ ID NO 3中第2052-3719)，該片段經(jīng) ApaI和Sac I雙酶切，回收后與質(zhì)粒p0ZK_Z123經(jīng)Apa I和SacI雙酶切回收的大片段連接， 連接產(chǎn)物經(jīng)酶切鑒定，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒記作P0ZK-Z123DKV，酶切鑒定結(jié)果如圖4(1 含VP3 58 位，VPl 43 和 48 位氨基酸突變的 PCR 片段；2 :500_12000bpwide range DNA mark (500、 1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、8000、12000bp)3 重組質(zhì)粒 p0ZK_Z123DKV Apa I和SacI酶切鑒定)。以質(zhì)粒 p0ZK-Z123DKV 為模板，分別用 Eky2027 (+) /R1629 (-)和 F207 (+) /Exma2 (-) 引物對(duì)，PCR擴(kuò)增得A片段(A片段的核苷酸序列為SEQ ID NO :3中第2007-3681位核苷酸) 和B片段(B片段的核苷酸序列為SEQ ID NO 3中第3634-3836位核苷酸)。純化的A片 段和B片段等量混合做為模板，以EapaI (+VExmal (-)為引物PCR擴(kuò)增得C片段(C片段的 核苷酸序列為SEQ ID NO :2中第2052-3836位核苷酸)。該C片段含VP1137 (137S — G)、 139 (139A — T)、140 (140R — S)、141 (141V — T)和 142 (142S — N)位氨基酸突變。A 片段、 B片段、C片段的電泳圖如圖5所示(1 :A片段；2 :B片段；3、5 :DL，2000 (100、250、500、750、 1000、2000bp) ；6 融合 C 片段)。包含SacI位點(diǎn)的核苷酸在設(shè)計(jì)EXmal (-)引物的上游，所以即使引物中不帶該位 點(diǎn)，擴(kuò)增片段中也包含。C片段用Sacl/Apal (TakaRa)內(nèi)切酶消化后插入用Apal/SacI (TakaRa)酶消 化的質(zhì)粒pOZK-Z 123DKV中，用Kpn I (TakaRa)進(jìn)行酶切鑒定，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒記作 p0ZKF-Z123m，酶切鑒定結(jié)果如圖 6(1 :wide range DNA mark ;2 重組質(zhì)粒 pOZKF-TmFull XhoI酶切鑒定；3 重組質(zhì)粒p0ZKF-Z123m質(zhì)粒Kpn I酶切鑒定)。(C片段替換了載體 pOZK-Z 123DKV上的含“VP3 58位，VPl 43位和48位氨基酸突變的約1674bp片段，但該片 段仍然含有VP3 58位，VPl 43位和48位氨基酸突變，但有點(diǎn)差異的是C片段中同時(shí)含有 7 VPl 137 (1378 — G)、139 (139A — T)、140 (140R — S)、141 (141V — T)和 142 (1428 — N) 位氨基酸突變)用BglII和SpeI (TakaRa)雙酶切重組質(zhì)粒p0ZKF_Z123m，回收大片段；用SpeI和BglII雙酶切質(zhì)粒P0ZKF-Z1234，回收Z(yǔ)4片段；將兩片段連接，用XhoI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒 定，鑒定結(jié)果如圖6所示，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒記作pOZKF-TmFull，即為突變修飾的口蹄疫病毒 0ZK/93-08株全基因組感染性cDNA克隆，該質(zhì)粒pOZKF-TmFull中含有突變病毒的全部基因 組 RNA 對(duì)應(yīng)的 DNA (即 SEQ ID NO :2)。突變病毒的核苷酸序列VP4的核苷酸序列為SEQ ID NO 2中第1660-1914位核 苷酸；VP2的核苷酸序列為SEQ ID NO 2中第1915-2568位核苷酸；VP3的核苷酸序列為 SEQ ID NO :2中第2569-3228位核苷酸；VPl的核苷酸序列為SEQ ID NO :2中第3229-3867 位核苷酸。與0ZK/93-08的核苷酸序列相比，將第2740-2742位核苷酸由gaa突變?yōu)間at， 第3355-3357位核苷酸由aca突變?yōu)閍ag，第3370-3372位核苷酸由ate突變?yōu)間tg，第 3637-3639位核苷酸由agt突變?yōu)間gt，第3643-3654位核苷酸由gcc cgc gtg age突變?yōu)?act age act bbc。突變病毒的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示VP4的氨基酸序列為SEQ ID NO 4 中第1-85位氨基酸；VP2的氨基酸序列為SEQ ID NO :4中第86-303位氨基酸；VP3的氨 基酸序列為SEQ ID NO 4中第304-523位氨基酸；VPl的氨基酸序列為SEQ ID NO 4中第 524-736位氨基酸。突變病毒的結(jié)構(gòu)蛋白與0ZK/93-08的結(jié)構(gòu)蛋白相比，氨基酸突變情況如 圖3所示。三、拯救拓展了抗原譜的基因工程病毒BHK-21細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)監(jiān)察所，產(chǎn)品目錄號(hào)為BHK21F5620071213。用QIAGEN Plasmid Midi Kits(QIAGEN 公司)制備質(zhì)粒 pOZKF-TmFull 和 pcDNAT7P。pcDNAT7P質(zhì)粒在文獻(xiàn)“《中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)》2009年第42卷第2期，李平花，白興文， 盧曾軍等，“細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄拯救Asial型口蹄疫病毒”中公開(kāi)過(guò)，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州 獸醫(yī)研究所獲得。用Not I線化pOZKF-TmFull后，加入蛋白酶K(終濃度為0. 25 μ g/mL， Invitrogen公司)，37°C溫育30min后，純化后作為轉(zhuǎn)染cDNA模板。常規(guī)培養(yǎng)的單層BHK-21 細(xì)胞生長(zhǎng)至70 % 80 %時(shí)用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)各取2 μ g線化cDNA模板和pcDNAT7P用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后6h吸去細(xì)胞上 清，加入2mL含8%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司)，置37°C 5% C02培養(yǎng)箱， 72h后收獲病毒，凍融2-3次后，在BHK-21上連續(xù)2-3傳代，出現(xiàn)典型細(xì)胞病變(CPE)(圖7， A 正常BHK-21細(xì)胞，B 出現(xiàn)CPE的細(xì)胞)，收集病毒液，即為目的病毒，命名為rV_0SyNa。 用該病毒在培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞上傳代增殖30代，_70°C保存各代病毒備用。四、病毒rV-0SyNa的鑒定1、測(cè)序鑒定病毒基因取連續(xù)傳20代的rV-0SyNa細(xì)胞毒，用RNAasy Mini Kit提取細(xì)胞毒總RNA，RT-PCR 方法擴(kuò)增含有突變氨基酸的特定片段，結(jié)果如圖8所示。RT-PCR 引物為EXmal(-) TGCTTGTGTCTAGCGTCACTCGEky2599(+) GCATCTTCCCTGTGGCTTGCTCEky3427 (+) CGCACCGCTACATACTACTT結(jié)果顯示:0ZK/93-08病毒基因組的第 2740-2742，3355-3357，3370-3372 測(cè)序
9結(jié)果分別為GAA，ACA, ATC,編碼E，T，I三個(gè)氨基酸(圖8A)，人工拯救病毒rV_0SyNa的 第 2740-2742，3355-3357，3370-3372 測(cè)序結(jié)果分別為 GAT，AAG，GTG，編碼 D，K, V 三個(gè)氨 基酸(圖8B)，人工拯救病毒rV-OSyNa的第3637-3639和3643-3654測(cè)序結(jié)果為GGT和 ACTAGCACTAAC，分別編碼G和T、S、T、N氨基酸(圖8C左)，而0ZK/93-08病毒基因組的第 3637-3639和3643-3654測(cè)序結(jié)果為AGT和GCCCGCGTGAGC，分別編碼S和A、R、V、S氨基酸 (圖8C右)。表明本發(fā)明構(gòu)建的rV-OSyNa基因組序列正確。2、間接免疫熒光鑒定病毒蛋白接種病毒的BHK-21 (單層細(xì)胞生長(zhǎng)至70 % )，24h后進(jìn)行間接免疫熒光法鑒定。一 抗為0型口蹄疫病毒兔陽(yáng)性血清，二抗為加FITC羊抗兔IgG (Sigma公司)，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞 對(duì)照。接種病毒的BHK細(xì)胞中可見(jiàn)綠色特異性熒光，而正常細(xì)胞對(duì)照無(wú)可見(jiàn)熒光(圖9，A 接種rV-OSyNa病毒的BHK-21細(xì)胞；B 未接種病毒的BHK-21細(xì)胞)。表明，病毒與0型口 蹄疫病毒兔陽(yáng)性血清能夠相互結(jié)合。3、電鏡檢查在BHK-21細(xì)胞中增殖后收獲的細(xì)胞毒200mL，凍融2_3次后，加BEI滅活， 40C 6000rpm離心40min,收集病毒上清，4°C 45000rpm離心3h，沉淀加500 μ L NET緩沖液 重懸，負(fù)染后電鏡觀察。結(jié)果檢查到直徑約為25nm、球形的口蹄疫病毒粒子(圖10)。4、拯救病毒的遺傳穩(wěn)定性分析將rV-OSyNa病毒按10%接種量接種BHK-21細(xì)胞，連續(xù)傳代，觀察出現(xiàn)典型細(xì)胞病 變(CPE)的時(shí)間，并對(duì)9、13、30代病毒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)拯救病毒突變氨基酸的變化。RT-PCR檢測(cè)的引物為EXmal(-) TGCTTGTGTCTAGCGTCACTCGEky2599(+) GCATCTTCCCTGTGGCTTGCTCEky3427(+) CGCACCGCTACATACTACTT。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果拯救病毒rV-OSyNa用小方瓶連續(xù)傳至第8代后，出現(xiàn)的CPE的時(shí)間趨于穩(wěn) 定，100%病變時(shí)間約9-10h，小方瓶20代病毒轉(zhuǎn)入大轉(zhuǎn)瓶，100%病變時(shí)間約為11-12小時(shí)， 病變時(shí)間穩(wěn)定。拯救病毒9、13、30代VP3、VP1基因的序列測(cè)定結(jié)果表明突變的氨基酸穩(wěn)定 存在，在傳代過(guò)程中未發(fā)生變化。五、疫苗制備工藝1、拯救病毒的大量增殖培養(yǎng)靜止或旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)BHK21細(xì)胞至單層細(xì)胞長(zhǎng)滿，向其中加入病毒液和培養(yǎng)液，其 中病毒液按5-15%體積比例加入，補(bǔ)加培養(yǎng)液至培養(yǎng)容器體積的1/20-1/30 ；37°C繼續(xù) 培養(yǎng)，待出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathogenic effct, CPE)，收獲病毒液即為病毒培養(yǎng)物， 置-20-40°C保存。培養(yǎng)液的組成為水解乳蛋白液(93-97% )、氨基酸溶液(2_5% )、抗生素液 (1% )> HEPES液(0. 5% )，加7. 5%的NaHCO3調(diào)Ph至7. 5-7. 7 ；所述百分含量為體積百分 含量水解乳蛋白液、氨基酸溶液、抗生素液和HEPES液均購(gòu)自Invitrogen公司。2、病毒滅活用BEI (Sigma公司)滅活大量增殖的病毒液。
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3、疫苗配制IS201佐劑產(chǎn)品名稱為Montanide ISA 201 VG，購(gòu)自法國(guó)SEPPIC公司，產(chǎn)品目錄 號(hào)為 L01408。用滅活病毒液(抗原)和佐劑配制疫苗，如下(1) “抗原/佐劑/抗原”雙相佐劑 型。滅活病毒液與IS201佐劑(法國(guó)SEPPIC)混合乳化。滅活病毒液與IS201佐劑的體積 比為50%: 50%，振蕩或乳化機(jī)攪拌均勻后即成。置4-8°C。將得到的疫苗記作rV-0/STN疫苗。六、疫苗免疫動(dòng)物效果比對(duì)將步驟五制備得到的疫苗免疫48頭豬(要求被免疫的豬的口蹄疫抗體滴度小于 1 6，感染抗體為陰性)測(cè)定免疫效力。疫苗劑量2ml/頭，免疫途徑為肌肉接種。以0ZK/93-08制備的疫苗為對(duì)照，接種48頭豬。疫苗劑量2ml/頭，免疫途徑為肌 肉接種。常規(guī)疫苗的制備方法如下將0ZK/93-08株病毒液用BEI滅活后，與佐劑以1 1 比例混合，按《中華人民共和國(guó)獸藥典》中獸用生物制品的口蹄疫滅活疫苗規(guī)程制備。攻毒方法及結(jié)果判定方法均按照《Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals)) (2009年版，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(ΟΙΕ))中所述。具體如下所有免疫豬，28d-39d后，按每組16頭進(jìn)行隨機(jī)分組。中國(guó)型豬源流行毒組用中國(guó)型O/TL/Taiwan/97系豬源流行毒進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。泛亞型豬源流行毒組用泛亞型O/China/99系豬源流行毒進(jìn)行攻毒實(shí)試驗(yàn)。東南亞型緬甸98譜系豬源流行毒組用東南亞型緬甸98譜系0/GS/2010豬源流 行毒毒株進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。以上每種病毒設(shè)5頭非免疫豬對(duì)照。攻擊每頭豬接種IOOOID5q的病毒量，觀察10d，判定免疫效力結(jié)果。以口蹄部不出 現(xiàn)任何水泡病癥為保護(hù)。接種疫苗和免疫效力數(shù)據(jù)如表1所示。表1、疫苗免疫豬效力測(cè)定結(jié)果(保護(hù)數(shù)/免疫數(shù))
病毒/疫苗免疫豬rV-O/STN疫苗免疫豬常規(guī)疫苗免疫豬非免疫對(duì)照豬中國(guó)譜系豬源毒16/1612/160/5泛亞譜系豬源毒16/1616/160/5緬甸98譜系豬源毒16/1616/160/5 結(jié)果表明用突變修飾的口蹄疫病毒作為疫苗株，在培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞上增殖后 滅活，與ISA201佐劑(法國(guó)SEPPIC)乳化制成疫苗，免疫豬，能有效保護(hù)中國(guó)譜系豬源流行 毒、泛亞譜系豬源流行毒和緬甸98譜系豬源流行毒的攻擊?？谔阋卟《疽呙缰杲?jīng)針對(duì)抗原 表位氨基酸的替換，制備的疫苗免疫豬，提高了對(duì)中國(guó)譜系豬源流行毒的保護(hù)率，免疫效力 增加，表明抗原譜變廣。因此，利用反向遺傳操作技術(shù)能拓展口蹄疫病毒的抗原譜。
權(quán)利要求
一株口蹄疫病毒毒株，其VP3和VP1結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO4中第304 736位氨基酸殘基所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口蹄疫病毒毒株，其特征在于所述口蹄疫病毒毒株的結(jié)構(gòu) 蛋白如SEQ ID NO 4中第1-736位氨基酸殘基所示；所述VP3和VPl結(jié)構(gòu)蛋白的編碼基因如SEQ ID NO 2中第2569-3867位核苷酸所示；所述口蹄疫病毒毒株的結(jié)構(gòu)蛋白的編碼基因如SEQ ID NO :2中第1660-3867位核苷酸 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的口蹄疫病毒毒株，其特征在于所述口蹄疫病毒毒株的 基因組RNA對(duì)應(yīng)的cDNA序列如SEQ ID NO 2所示。
4.一種疫苗，其活性成分為滅活的權(quán)利要求1-3中任一所述口蹄疫病毒毒株。
5.權(quán)利要求1-3中任一所述口蹄疫病毒毒株在制備疫苗中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗或權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述疫苗為口 蹄疫疫苗；所述疫苗中使用的佐劑為IS201。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的疫苗或權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于所述 口蹄疫為0型口蹄疫病毒引起的口蹄疫；和/或，所述0型口蹄疫病毒為豬源的；和/或所述0型口蹄疫病毒為中國(guó)譜系或泛亞 譜系或緬甸98譜系；和/或，所述中國(guó)譜系病毒毒株為O/TL/Taiwan/97，所述泛亞譜系病毒毒株為0/ China/99，所述緬甸98譜系病毒毒株為0/GS/2010。
8.一種拓展口蹄疫病毒抗原譜的方法，包括如下步驟1)獲得出發(fā)口蹄疫病毒基因組 RNA互補(bǔ)的cDNA ；2)將所述cDNA中的編碼出發(fā)口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白的編碼基因進(jìn)行突變 或?qū)⑺鯿DNA中的編碼出發(fā)口蹄疫病毒的抗原決定簇的編碼基因進(jìn)行突變，使突變后的 編碼基因與待抗口蹄疫病毒毒株的等位基因相同，得到抗原譜廣于所述出發(fā)口蹄疫病毒的 目的口蹄疫病毒的基因組cDNA;3)表達(dá)得到步驟2)所述目的口蹄疫病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述出發(fā)口蹄疫病毒為任一血清型的野 生型病毒，或通過(guò)任意操作獲得的口蹄疫病毒；所述任意操作為培育或基因操作；所述出發(fā)口蹄疫病毒優(yōu)先為免疫原性好、復(fù)制性能強(qiáng)和病毒滴度高的野生型病所述抗 原決定簇為B細(xì)胞抗原決定簇或T細(xì)胞抗原決定簇。
10.由權(quán)利要求8或9所述方法得到的口蹄疫病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用反向遺傳操作拓展口蹄疫疫苗株抗原譜及疫苗制備方法。本發(fā)明的口蹄疫病毒毒株，其VP3和VP1結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO4中第304-736位氨基酸殘基所示。實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明得到的突變病毒株制成疫苗，可以同時(shí)抗中國(guó)型O/TL/Taiwan/97譜系豬源流行毒、泛亞型O/China/99譜系豬源流行毒和東南亞型緬甸98譜系O/GS/2010豬源流行毒的侵害，具有抗原普廣的特性，免疫豬，能明顯提高對(duì)抗原性有差異的同型口蹄疫病毒攻擊的保護(hù)率，達(dá)到交叉保護(hù)的免疫效果，在預(yù)防和控制口蹄疫中將發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12N7/00GK101948811SQ20101025678
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月18日
發(fā)明者付元芳, 劉在新, 包慧芳, 盧曾軍, 孫普, 曹偉軍, 曹軼梅, 李冬, 李平花, 殷宏, 白興文, 謝寶霞, 陳應(yīng)理 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所