專(zhuān)利名稱(chēng)：刺參腸道內(nèi)容物及環(huán)境底泥中生物總dna的高效提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物和分子生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種針對(duì)刺參腸道內(nèi)容物和環(huán)境 底泥中生物總DNA的高效提取方法。
背景技術(shù)：
刺參(Apostichopus japonicus)屬海洋底棲生物，主要以棲息環(huán)境中微生物、原 生動(dòng)物、微藻、大型藻類(lèi)碎片、有機(jī)碎片、海泥等為食，攝入的食物組成復(fù)雜，其中也包括一 些病原微生物。腸道是刺參十分重要的消化器官，了解刺參腸道食物組成和微生物菌群狀 況，對(duì)弄清刺參的消化機(jī)理、腸道微生態(tài)變動(dòng)機(jī)制和預(yù)防疾病發(fā)生具有重要意義。近年來(lái)，DNA指紋分析技術(shù)廣泛應(yīng)用于腸道、環(huán)境生物多樣性的研究，已成為研究 其群落多樣性的重要工具。而有效提取樣品中生物總DNA是進(jìn)行DNA指紋分析的前提，取 得質(zhì)量好、獲得率高的DNA，可真實(shí)準(zhǔn)確的分析樣品中微生物組成的實(shí)際情況，是保證分子 生態(tài)學(xué)分析關(guān)鍵技術(shù)所在。刺參腸道內(nèi)容物和環(huán)境底泥中物質(zhì)復(fù)雜，含有大量的腐植酸、粘土礦物質(zhì)以及其 它離子物質(zhì)，這些成分嚴(yán)重影響了生物總DNA的提取效率和后續(xù)的DNA指紋分析。已報(bào)道的 針對(duì)土壤、淡水底泥及其它養(yǎng)殖動(dòng)物腸道微生物的DNA提取方法有趙大勇等“一種適用于 底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)分析的DNA提取方法”(河海大學(xué)，專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?00910180630. 0)、 劉淮德等“一種對(duì)蝦腸道微生物DNA的提取方法”(中國(guó)科學(xué)院海洋研究所，專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?200910263665. 0)。刺參屬海洋底棲生物，上述方法不適用于刺參腸道內(nèi)容物和環(huán)境底泥生 物總DNA的高效提取。迄今為止，針對(duì)刺參腸道內(nèi)容物和環(huán)境底泥中生物DNA的高效提取方法至今尚未 報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是建立一種針對(duì)刺參腸道內(nèi)容物和環(huán)境底泥中生物總DNA高效提取 的技術(shù)，解決刺參腸道內(nèi)容物和環(huán)境底泥中生物總DNA提取效率低的難題。該方法獲得的 DNA片段完整、獲得率和純度較高，可以顯著提高分子生態(tài)學(xué)分析的準(zhǔn)確性。本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，刺參腸道內(nèi)容物及環(huán)境底泥中生物總DNA的高 效提取方法，其步驟為1)取 2g 樣品置于 IOmL 滅菌離心管中，加 5mL TENP (6. 2g/L Tris-Cl，7. 4g/L EDTA, 5. 8g/L NaCl，10. Og/L PVP)，同時(shí)加0. 5g滅菌玻璃珠，渦旋振蕩2min，充分混勻，4°C， IlOOOg離心5min，棄上清，重復(fù)洗滌一次；2)沉淀用 5mL 的 PBS(8. Og/L NaCl,0. 2g/L KCl, 1. 42g/L Na2HPO4,0. 27g/L KH2PO4)洗滌兩次，離心同上；3)把樣品分成三份，分別加到2mL滅菌離心管中，每管加入600 μ L裂解液 (12. lg/L Tris-Cl,37. 2g/L EDTA,11. 7g/L NaCl, 10. Og/L PVP, 20. Og/L CTAB，pH為 8. 0旋渦振蕩，再加入0. 5mL 100mg/mL的溶菌酶，37°C水浴Ih ；4)加入600 μ L的2% SDS緩沖液，輕輕上下顛倒5min。然后將樣品放入_80°C冰 箱中5min，取出后在55°C水浴2min，反復(fù)凍融三次；5)加入等體積的氯仿異戊醇(24 1)，輕輕上下顛倒混勻，12000g離心5min ；6)將上清液轉(zhuǎn)移到2ml滅菌離心管中，再加入等體積的酚氯仿異戊醇 (25 24 1)輕輕上下顛倒混勻5min, 12000g離心5min ；7)將上清液轉(zhuǎn)移到新2ml滅菌離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，_20°C lh, 12000g離心15min，慢慢吸棄上清液，底部白色沉淀物為DNA ；8)加入ImL 70%的乙醇清洗沉淀，IOOOOg離心lOmin，重復(fù)該步驟一次，在無(wú)菌操 作臺(tái)中風(fēng)干，加35 μ L的滅菌超純水，-20°c保存。所述的步驟2，洗滌過(guò)程中要上下顛倒，樣品充分懸浮于PBS溶液中。所述的步驟3，37°C水浴Ih過(guò)程中，每隔IOmin上下顛倒混勻。所述的步驟3，加入裂解液后渦旋振蕩3-5min，在渦旋過(guò)程中上下顛倒。所述的步驟8，DNA沉淀用酒精清洗后，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)風(fēng)干5min。本發(fā)明具有以下特點(diǎn)1、本發(fā)明方法可消除腐殖酸等物質(zhì)對(duì)DNA的干擾，提高DNA提取效率和純度。在 提取過(guò)程中生物基因組DNA損失少，DNA獲取率高，能更好的反映樣品中生物的多樣性。2、本發(fā)明從刺參腸道內(nèi)容物和環(huán)境底泥中提取的生物基因組DNA片段完整，電泳 條帶清晰、單一，無(wú)拖尾現(xiàn)象。3、從刺參腸道內(nèi)容物和環(huán)境底泥中提取生物基因組DNA時(shí)，無(wú)需特殊的儀器，整 個(gè)過(guò)程在較短的時(shí)間內(nèi)完成，易操作。


圖1 為刺參腸道內(nèi)容物與養(yǎng)殖環(huán)境中生物總基因組DNA M為DNA Maker ；lanel、2刺參腸道內(nèi)容物；lane3、4刺參附著基；lane5、6養(yǎng)殖刺 參池塘底泥。圖2 為刺參腸道內(nèi)容物與養(yǎng)殖環(huán)境中細(xì)菌16S rDNA的PCR電泳M為DNA Maker ； laneU2刺參腸道內(nèi)容物；lane3、4刺參附著基；lane5、6養(yǎng)殖刺參池塘底泥。圖3 為刺參腸道內(nèi)容物與養(yǎng)殖環(huán)境中真核生物18S rDNA的PCR電泳M為DNA Maker ；Ianel空白對(duì)照；lane2、3刺參腸道內(nèi)容物；lane4、5刺參附著基； lane6,7養(yǎng)殖刺參池塘底泥。圖4 為不同提取方法提取生物總DNA的電泳檢測(cè)M 為 DNA Maker ；lanel、2 為 Zhou 等(1996)改進(jìn)方法；lane3、4 為該發(fā)明方法； lane5,6為試劑盒提取方法。圖5 為不同方法提取的生物總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果M 為 DNA Maker ；lanel、2 為 Zhou 等(1996)改進(jìn)方法；lane3、4 為該發(fā)明方法； lane5,6為試劑盒提取方法。下面以實(shí)施例結(jié)合附圖詳細(xì)敘述本發(fā)明的提取方法1 實(shí)施例
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本發(fā)明其步驟為1)取刺參室外養(yǎng)殖池塘底泥、附著基、刺參腸道內(nèi)容物樣品分別2g置于IOmL滅 菌離心管中，加 5mL TENP(6. 2g/L Tris_Cl，7. 4g/L EDTA，5. 8g/LNaCl，10. Og/L PVP)，同時(shí) 加0. 5g滅菌玻璃珠，渦旋振蕩2min，充分混勻，4°C，IlOOOg離心5min，棄上清，重復(fù)洗滌一 次；2)沉淀用 5mL 的 PBS(8. Og/L NaCl,0. 2g/L KCl, 1. 42g/L Na2HPO4,0. 27g/L KH2PO4)洗滌兩次，離心同上；3)把樣品分成三份，分別加到2mL滅菌離心管中，每管加入600 μ L裂解液 (12. lg/L Tris-Cl,37. 2g/L EDTA,11. 7g/L NaCl,10. Og/L PVP,20. Og/L CTAB，pH為8. 0)， 旋渦振蕩，再加入0. 5mL 100mg/mL的溶菌酶，37°C水浴Ih ；4)加入600 μ L的2% SDS緩沖液，輕輕上下顛倒5min。然后將樣品放入_80°C冰 箱中5min，取出后在55°C水浴2min，反復(fù)凍融三次；5)加入等體積的氯仿異戊醇(24 1)，輕輕上下顛倒混勻，12000g離心5min ；6)將上清液轉(zhuǎn)移到2ml滅菌離心管中，再加入等體積的酚氯仿異戊醇 (25 24 1)輕輕上下顛倒混勻5min, 12000g離心5min ；7)將上清液轉(zhuǎn)移到新2ml滅菌離心管中，加入0. 6倍體積的異丙醇，混 勻，-200C lh, 12000g離心15min，慢慢吸棄上清液，底部白色沉淀物為DNA ；8)加入1000 μ L 70%的乙醇清洗沉淀，IOOOOg離心lOmin，重復(fù)該步驟一次，在無(wú) 菌操作臺(tái)中風(fēng)干，加35 μ L的滅菌超純水，-20°c保存。所述的步驟2，洗滌過(guò)程中要上下顛倒，樣品充分懸浮于PBS溶液中。所述的步驟3，37°C水浴Ih過(guò)程中，每隔IOmin上下顛倒混勻。所述的步驟3，加入裂解液后渦旋振蕩3-5min，在渦旋過(guò)程中上下顛倒。所述的步驟8，DNA沉淀用酒精清洗后，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)風(fēng)干5min。利用該發(fā)明方法對(duì)刺參室外養(yǎng)殖池塘底泥、附著基、刺參腸道內(nèi)容物進(jìn)行生物基 因組DNA的提取，結(jié)果如下所示提取總DNA通過(guò)的瓊脂糖凝膠電泳可以看出，條帶在20Kb左右(參見(jiàn)圖1)， DNA的亮度和純度較高，沒(méi)有拖尾現(xiàn)象，片段完整性好。以生物基因組DNA為模板，用細(xì)菌 16S rDNA基因通用引物GC-F341/R907和真核生物18S rDNA基因通用引物GC-F1427/R1616 進(jìn)行PCR擴(kuò)增(參見(jiàn)圖2、圖3)，擴(kuò)增后條帶亮度和特異性均較好，未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條 帶,通過(guò)與Marker對(duì)比，可知GC-F341/R907PCR擴(kuò)增片段大小約為600bp左右，GC-F1427/ R1616PCR擴(kuò)增片段大小約為200bp左右，在底泥中雖然含有少量的雜質(zhì)，但能獲得質(zhì)量較 高的PCR產(chǎn)物。2 本發(fā)明與其他DNA提取方法的比較方法一利用本發(fā)明的方法方法二 參照文獻(xiàn)Zhou等(1996)進(jìn)行修改的液氮反復(fù)凍融法，步驟如下(1)、取出冰凍的樣品，稍微解凍后，在超凈工作臺(tái)上，切去表層，以避免取樣過(guò)程 中的污染，取沉積物0. 3g置于滅菌的2mL離心管中；(2)、力卩入 500yL DNA 抽提緩沖液(100mmol/L Tris. HCl pH 8. 0 ； 100mmol/L EDTA ； IOOmmo 1/L 磷酸鈉緩沖液，pH 8. 0 ；1. 5mol/L NaCl ；1% CTAB)；
(3)、充分混勻，置液氮罐中完全凍結(jié)(液氮中冷凍約3 5min)，取出在65°C水浴 中至融化，重復(fù)該步驟三次；(4)、加入 1 μ L 蛋白酶 K(20mg/ml)和 100μ L SDS(10% )；(5)、混勻后60°C保溫2h，每隔15 20min顛倒混勻幾次；(6)、IOOOOg 室溫離心 IOmin ；(7)、收集上清液；(8)、加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25 24 1)，lOOOOg，4°C離心IOmin ；(9)、上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管中，重復(fù)兩次步驟(8)；(10)、上清液中加0. 6倍體積冷異丙醇，輕輕混勻，置于_20°C下過(guò)夜。(11)、12000g，4°C離心 15min ；(12)、沉淀用70%乙醇和冷無(wú)水乙醇各洗一次，自然干燥；(13)、沉淀用50 μ L TE (ρΗ 8. 0)溶解，并置于_20°C下保存?zhèn)溆谩７椒ㄈ酵寥郎锘蚪M提取DNA試劑盒法按照說(shuō)明書(shū)用柱式土壤生物基 因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行生物總DNA提取。不同DNA提取方法的電泳檢測(cè)結(jié)果參見(jiàn)圖4。通過(guò)三種方法的比較，本發(fā)明方法提 取的刺參腸道內(nèi)容物及環(huán)境底泥中DNA的獲得率較高，說(shuō)明此方法可以使生物細(xì)胞充分裂 解，釋放出DNA。不同DNA提取方法的PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)結(jié)果參見(jiàn)圖5。三種方法均得到了單一的 PCR條帶，而本發(fā)明方法比其它兩種方法獲得的PCR條帶亮度高，說(shuō)明該方法可有效去除腐 殖酸等抑制PCR擴(kuò)增的雜質(zhì)，提高了 PCR效率。通過(guò)大量的試驗(yàn)證明本發(fā)明方法通用性好，能分別對(duì)刺參腸道與環(huán)境底泥中微 生物DNA進(jìn)行提取，DNA獲得率、純度較高，片段完整性好，提取的DNA用于PCR擴(kuò)增，能得 到亮度較高、特異性較好的產(chǎn)物，而且此方法不需要額外的儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，成本低。
權(quán)利要求
一種刺參腸道內(nèi)容物及環(huán)境底泥中生物總DNA的高效提取方法，其特征在于它的步驟為1)、取2g樣品置于10mL滅菌離心管中，加5mL TENP，同時(shí)加0.5g滅菌玻璃珠，渦旋振蕩2min，充分混勻，4℃，11000g離心5min，棄上清，重復(fù)洗滌一次；其中TENP的成分為6.2g/L Tris Cl，7.4g/L EDTA，5.8g/LNaCl，10.0g/L PVP；2)、沉淀用5mL的PBS洗滌兩次，離心同上；其中PBS的成分為8.0g/LNaCl，0.2g/L KCl，1.42g/L Na2HPO4，0.27g/L KH2PO4；3)、把樣品分成三份，分別加到2mL滅菌離心管中，每管加入600μL裂解液，旋渦振蕩，再加入0.5mL 100mg/mL的溶菌酶，37℃水浴1h；其中裂解液的成分為12.1g/L Tris Cl，37.2g/L EDTA，11.7g/L NaCl，10.0g/LPVP，20.0g/L CTAB，pH為8.0；4)、加入600μL的2％SDS緩沖液，輕輕上下顛倒5min，然后將樣品放入 80℃冰箱中5min，取出后在55℃水浴2min，反復(fù)凍融三次；5)、加入等體積的氯仿∶異戊醇，輕輕上下顛倒混勻，12000g離心5min；6)、將上清液轉(zhuǎn)移到2mL滅菌離心管中，再加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇輕輕上下顛倒混勻5min，12000g離心5min；7)、將上清液轉(zhuǎn)移到新2ml滅菌離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻， 20℃ 1h，12000g離心15min，慢慢吸棄上清液，底部白色沉淀物為DNA；8)、加入1mL 70％的乙醇清洗沉淀，10000g離心10min，重復(fù)該步驟一次，在無(wú)菌操作臺(tái)中風(fēng)干，加35μL的滅菌超純水， 20℃保存。
2.按權(quán)利要求書(shū)1所述刺參腸道內(nèi)容物及環(huán)境底泥中生物總DNA的高效提取方法，其 特征在于所述步驟2的洗滌，洗滌過(guò)程中要上下顛倒，樣品充分懸浮于PBS溶液中。
3.按權(quán)利要求書(shū)1所述刺參腸道內(nèi)容物及環(huán)境底泥中生物總DNA的高效提取方法，其 特征在于所述步驟3的水浴，37°C水浴Ih過(guò)程中，每隔IOmin上下顛倒混勻。
4.按權(quán)利要求書(shū)1所述刺參腸道內(nèi)容物及環(huán)境底泥中生物總DNA的高效提取方法，其 特征在于所述步驟3的渦旋，加入裂解液后渦旋振蕩3-5min，在渦旋過(guò)程中上下顛倒。
5.按權(quán)利要求書(shū)1所述刺參腸道內(nèi)容物及環(huán)境底泥中生物總DNA的高效提取方法，其 特征在于所述步驟8的風(fēng)干，DNA沉淀用酒精清洗后，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)風(fēng)干5min。
全文摘要
一種刺參腸道內(nèi)容物及環(huán)境底泥中生物總DNA的高效提取方法，其方法步驟為T(mén)ENP預(yù)處理、機(jī)械破碎、反復(fù)凍融、溶菌酶、SDS裂解液裂解細(xì)胞、酚∶氯仿∶異戊醇抽提。在提取過(guò)程中，樣品預(yù)先用TENP處理，通過(guò)離心有效去除腐植酸，防止與DNA的結(jié)合，以提高DNA獲得率。該方法對(duì)樣品中生物細(xì)胞裂解完全，腐植酸的去除效率高，DNA獲得率及純度較高、片段完整，提高了分子生態(tài)學(xué)對(duì)刺參腸道內(nèi)容物及環(huán)境底泥中生物多樣性研究的準(zhǔn)確性。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101935643SQ20101025722
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者廖梅杰, 張正, 張輝, 李彬, 王印庚, 榮小軍, 薛太山, 陳霞 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所