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受四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)調控uPA表達的載體及其應用的制作方法

文檔序號:585309閱讀:615來源:國知局
專利名稱:受四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)調控uPA表達的載體及其應用的制作方法
技術領域
本發(fā)明涉及一種受四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)調控UPA表達的載體及其建立四環(huán)素誘 導表達系統(tǒng)調控uPA表達的轉基因小鼠模型中的應用。
背景技術
uPA(urokinase-plasminogen activator),艮口 尿激Bl型纖溶Bl原激 舌齊U,屬于 絲氨酸蛋白水解酶家族,uPA催化纖溶酶原轉化為纖溶酶,啟動纖維蛋白和細胞外基質蛋 白溶解級聯(lián)反應。一般來說,uPA主要在生理、病理條件下參與細胞的分化、遷移、組織重 建、細胞外基質降解、腫瘤浸潤及轉移等過程。uPA纖溶途徑的主要成分包括uPA,uPA受 體(urokinase plasminogen activator receptor,uPAR)及其 I 型抑制齊[J (plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1) (Nicholl SM, Roztocil E,Davies MG. Plasminogen activator system and vascular disease. Curr Vasc Pharmacol 2006 ;4 :101_116)0 石if 究發(fā)現(xiàn),uPA纖溶途經不僅與纖維化發(fā)病機制有關,而且在固有性免疫和獲得性免疫系統(tǒng) 的形成中發(fā)揮作用(Mondino A, Blasi F. uPA and uPAR in fibrinolysis, immunity and pathology. Trends in Immunology, 2004, 25 (8) :450_455)。此外,uPA 在組織損傷及修復 過程中起重要作用,如uPA在肝臟修復中發(fā)揮重要作用,但是其在轉基因鼠中的過表達卻 導致新生鼠的嚴重肝損傷。Tet-On系統(tǒng)是比較成熟的真核生物外源基因誘導表達系統(tǒng)之一,它利用大腸桿菌 TnlO轉座子中四環(huán)素操縱子原理來實施調控外源基因在真核細胞中定量并特異地表達,具 有高效、無毒、開/關較嚴密等特點,已被成功地應用于細胞和轉基因小鼠誘導表達外源基 因的研究。四環(huán)素操縱子(tet operon)誘導表達系統(tǒng)利用細菌四環(huán)素操縱子的阻遏與去 阻遏作用,實現(xiàn)外源基因在真核細胞中的表達,由于該系統(tǒng)調控元件來自原核生物,對真 核細胞的基因表達不會有影響,具有高效和操作方便等優(yōu)點。Tet-On系統(tǒng)由兩部分組成 ①Tet反應性元件(tetracycline responsive element, TRE),由7拷貝的細菌四環(huán)素 耐藥操縱子的操縱基因序列(TetO)和人類巨噬細胞的立早啟動子(PminCMV)組成;②融 合的轉錄活化因子 rtTA(reverse tet-controlled transcriptional activator),是由 細菌的四環(huán)素阻遏物TetR和人類單純皰疹病毒(HSV)的毒粒蛋白VP16轉錄激活蛋白融 合而成的一個融合蛋白,能被強力霉素(Dox)所誘導和激活,并與TetO結合,通過VP16 發(fā)揮轉錄活性。此系統(tǒng)既有四環(huán)素阻遏物-操縱子相互作用的特異性,又具有VP16轉 錄活化因子的激活潛能,它們在體外培養(yǎng)細胞和轉基因小鼠中能使目的基因的表達提高 約 IO5 倍(Urlinger S,Baron U,Thellmann M,et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators :novel mutations yield expanded range and sensitivity[J]. Pro Natl Acad Sci USA,2000,97 :7963_7968)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供本發(fā)明的目的是提供一種受四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)調控UPA 表達的效應載體及其應用。本發(fā)明所提供的受四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)調控UPA表達的效應載體,其核苷酸序列 包括細菌四環(huán)素耐藥操縱子和人類巨噬細胞的立早啟動子序列、小鼠尿激酶原激活劑表 達框和小鼠尿激酶原激活劑表達框最后一個外顯子后的序列;所述小鼠尿激酶原激活劑 表達框的核苷酸序列為自GENBANK號(Accession. Version)為NM_008873. 3的5'端第 104-1405位核苷酸序列;所述小鼠尿激酶原激活劑表達框最后一個外顯子(第11外顯子) 后的711bp的序列的核苷酸序列為自GENBANK號(Accession. Version)為NM_008873. 3的 5'端第1363-2074位核苷酸序列,所述細菌四環(huán)素耐藥操縱子序列為序列1的5'端第 7-300位核苷酸序列;所述人類巨噬細胞的立早啟動子序列為序列1的5'端第301-438位 核苷酸序列。所述受四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)調控UPA表達的效應載體的出發(fā)質粒為PTRE2質粒。 所述受四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)調控uPA表達的效應載體的核苷酸序列為序列表中序列1。上述載體可以受四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)中的rtTA誘導表達,上述載體轉入動物中 可以構建得到受四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)調控uPA表達的轉基因動物模型,該轉基因動物模型 作為動物模型材料與不同組織特異性表達rtTA的動物模型雜交形成也方便了受四環(huán)素或 其衍生物誘導在不同組織表達uPA的動物模型的構建。上述載體與表達rtTA的真核表達載體可以組成用于構建受四環(huán)素或者四環(huán)素衍 生物誘導uPA表達的轉基因小鼠模型的組合載體。上述載體跟組織特異性表達rtTA的真核表達載體共同轉入動物中可以由四環(huán)素 或者四環(huán)素衍生物誘導組織特異性表達uPA。在本發(fā)明的一個實施例中,所述表達rtTA的真核表達載體為肝組織特異性表達 rtTA的真核表達載體。所述肝組織特異性表達rtTA的真核表達載體,其核苷酸序列包括依次串連的小 鼠血清白蛋白增強子序列、小鼠血清白蛋白啟動子序列和rtTA基因序列;所述小鼠血清白 蛋白增強子的核苷酸序列為自GENBANK號(Accession. Version)為AC140220. 4的5'端第 104540-106528位核苷酸序列;所述小鼠血清白蛋白啟動子的核苷酸序列為自GENBANK號 (Accession. Version)為 AC140220. 4 的 5'端第 115631-115832 位核苷酸序列;所述 rtTA 基因的核苷酸序列為自GENBANK號(Accession. Version)為U89930. 1的5'端第774-1781 位核苷酸序列。所述肝組織特異性表達rtTA的真核表達載體的出發(fā)質粒為pTet-on質粒。所述肝組織特異性表達rtTA的真核表達載體的核苷酸序列為序列表中序列2。上述的載體及組合載體在構建受四環(huán)素或者四環(huán)素衍生物誘導uPA表達的轉基 因小鼠模型中的應用也屬于本發(fā)明保護的范圍。所述應用中,所述構建受四環(huán)素或者四環(huán)素衍生物誘導uPA表達的轉基因小鼠模 型,包括下述步驟1)將權利要求1-3中任意一項所述的載體導入小鼠篩選獲得轉基因小鼠;2)將權利要求4-8中任意一項所述的表達rtTA的真核表達載體導入小鼠篩選獲得轉基因小鼠;3)將步驟1)和步驟2)獲得的小鼠雜交,篩選轉入獲得權利要求1-3中任意一項 所述的載體和所述表達rtTA的載體的轉基因小鼠,即獲得受四環(huán)素或者四環(huán)素衍生物誘 導uPA表達的轉基因小鼠模型;所述四環(huán)素衍生物可為強力霉素。本發(fā)明通過構建受四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)調控表達uPA的效應載體,構建了四環(huán)素 誘導表達系統(tǒng)調控表達uPA的轉基因小鼠模型,這種轉基因小鼠可以與組織特異性表達 rtTA的轉基因動物雜交得到組織特異性表達uPA的轉基因小鼠,從而方便不同組織特異性 表達uPA的動物模型的構建,為構建組織特異性可調控表達uPA轉基因動物模型,用于特定 組織中uPA功能研究奠定了堅實基礎。


圖1 為 pTRE2_uPAcDNA 質粒 BamH I /Sal I 雙酶切鑒定圖 2 為 pTRE2-uPAcDNA-700 質粒 Hind III /Sma I I 雙酶切鑒定圖3為TRE2-uPA_711轉基因載體元件及轉基因動物鑒定引物設計模式4為uPA體外表達的mRNA水平鑒定圖5為uPA體外表達的mRNA水平及蛋白生物學活性鑒定圖6為tetO-uPA轉基因首建小鼠PCR鑒定圖7為肝組織特異性表達rtTA的AlbumiiKrtTA轉基因首建鼠鑒定引物設計示意 8為肝組織特異性表達rtTA的Albumin:rtTA轉基因首建鼠PCR鑒定結果圖9為234號肝組織特異性表達rtTA的轉基因陽性鼠不同組織rtTA和GAPDH mRNA RT-PCR 檢測圖10為232號肝組織特異性表達rtTA的轉基因陰性鼠不同組織rtTA和GAPDH mRNA RT-PCR 檢測圖11為222號肝組織特異性表達rtTA的轉基因陽性鼠不同組織rtTA和GAPDH mRNA RT-PCR 檢測圖12為223號肝組織特異性表達rtTA的轉基因陰性鼠不同組織rtTA和GAPDH mRNA RT-PCR 檢測圖13為234號肝組織特異性表達rtTA的轉基因陽性鼠不同組織rtTA和GAPDH 蛋白Western blot檢測圖14為222號肝組織特異性表達rtTA的轉基因陽性鼠不同組織rtTA和GAPDH 蛋白Western blot檢測圖15為232號和223號肝組織特異性表達rtTA的轉基因陰性鼠不同組織rtTA 和 GAPDH 蛋白 Western blot 檢測圖16為可誘導肝組織特異性表達uPA轉基因小鼠肝組織表達uPA免疫組化檢測圖17為可誘導肝組織特異性表達uPA轉基因小鼠肝細胞病理學檢測圖18為特異性誘導肝組織表達uPA后轉基因小鼠血清ALT水平檢測
具體實施例方式下述實施例中的方法,如無特別說明,均為常規(guī)方法。下述實施例中的百分含量,如無特別說明,均為質量百分含量。下述實施例中所用的實驗材料如下所示Huh7細胞系購自武漢博士德生物工程有限公司,胎牛血清(FCS)購自Gibco公司, H印es、雙抗,谷氨酰胺等均購自Clontech公司。DNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒、PCR純化 試劑盒購自Promega公司;RNeasy Mini Kit購自Qiagen公司;脂質體轉染試劑盒、Trizol 試齊Ll為 Invitrogen 產品。E. coli DH5 α competent cells 禾口 DNA standard Marker 購自 北京博邁德發(fā)展有限公司;QIAprep Spin Miniprep Kit 和 Gel Extraction Mini Kit 購 自 Qiagen &司;T4 DNA polymerase^ Pyrobest DNA Polymerase^ T4 DNA Ligase> Takara RNA LA PCR Kit (AMV) Verl. 1、DNA Marker 購自 Takara 公司。蛋白酶抑制劑 Aprotinin、 Pepstatin A、Leup印tin、PMSF均購自Amresco公司;限制性內切酶購自NEB公司和Takara 公司;引物由上海生工合成,兔抗鼠uPA單克隆抗體購自American diagnostica Inc,蘇木 素、伊紅購自Sigma公司。凝血酶(Thrombin, Τ)和纖維蛋白原(Fibrinogen, F)購自國家 生物制品檢定所。ALT采用Fuji DRI-CHEM 7000生化分析儀檢測(FUJIFILM Corporation, Tokyo, Japan)。Te-on 誘導表達系統(tǒng)(Cat. No. 631108)購自 Clontech 公司;Anti-GAPDH polyclonal antibody (Cat. No. G9545)購自 Sigma 公司;DAB 顯色液、HRP 標記山羊抗兔 IgG 購自中杉金橋公司;野生型C57BL/6J小鼠購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。四環(huán)素誘導 性真核表達載體pTet-on和PTRE2 (名稱或者為pTRE2)質粒購自Clontech公司。轉基因 動物載體DNA顯微注射由上海模式生物有限公司完成。實施例1、轉基因載體pTRE2-uPA_711載體構建及鑒定一、轉基因載體pTRE2-uPA_711載體構建按常規(guī)分子克隆方法提取野生型C57BL/6J小鼠腎組織總RNA,反轉錄PCR擴增小 鼠 uPAcDNA 編碼區(qū)序列 1302bp。引物為 uPAcDNA-F、uPAcDNA-R。uPAcDNA-F :cgggatccatg aaagtctggctggcgagcctg(弓丨入 BamH I );uPAcDNA-R :cggtcgaccatcagaaggccagacctttctcttc (弓丨入 Sal I )。反轉錄條件為PCR條件94°C預變性5分鐘;94°C變性30秒,58°C退火30秒,72°C延伸1分20 秒,2-4步30個循環(huán);720C 10分鐘,4°C 5分鐘。 克隆至PTRE2載體得到重組載體,將該重組載體進行酶切和測序驗證,將驗證正確 的重組載體命名為TRE2-uPAcDNA。TRE2-uPAcDNA的BamH I /Sal I雙酶切鑒定如圖1所示。 泳道1為Marker2000 (Takara),泳道2為BamH I /Sal I雙酶切結果,可見插入的uPAcDNA 序列。按常規(guī)分子克隆方法提取野生型C57BL/6J小鼠基因組DNA并以此為模板PCR擴 增uPA最后一個外顯子編碼區(qū)后711bp序列,為自GENBANK號(Accession. Version)為 NM_008873 第 1363-2074 位核苷酸序列。引物為 uPA3' -F2, uPA3' -R2。uPA3' -F2 cggtcgacgccctcaggtagctgagggaag(弓丨入 Sal I )uPA3' -R2 cggtcgacgtgaaaccgacatttagtgctagtc(弓 I入 Sal I )
PCR條件為94°C預變性5分鐘;94°C變性30秒,56°C退火30秒,72°C延伸1分10 秒,2-4步30個循環(huán);720C 10分鐘,4°C 5分鐘。將PCR產物鑒定正確后,用Sal I酶切PCR產物并連入用Sal I酶切的 TRE2-uPAcDNA中uPAcDNA的3'端,Hind III /Sma I雙酶切判斷插入方向,正向連接的克隆 酶切后可產生158bp,1027bp,966bp, 3594bp的4條片段,凝膠電泳大約可見3條帶(圖2), 泳道1為Markerlkb (Takara),泳道2為Hind III /Sma I雙酶切結果。將正向連接的克隆命 名為pTRE2-uPA-711,選擇該質粒進行轉基因動物制備。pTRE2-uPA_711的結構示意圖如圖3 所示,如圖3所示,pTRE2-uPA-711中包含依次串聯(lián)細菌四環(huán)素耐藥操縱子(序列表中序列 1的第7-300位)、人類巨噬細胞的立早啟動子序列(序列表中序列1的第301-438位)、 uPA cDNA(序列表中序列1的第439-1774位)、uPA第11外顯子后的序列(序列表中序列 1 的第 1775-2485 位)。二、細胞水平鑒定轉基因載體uPA的表達及其生物學活性將pTRE2-uPA_711 與 Tet-on 共轉染 Huh7 細胞系,Dox 誘導(lug/ml),誘導 后48小時分別收集細胞及其培養(yǎng)上清,RT-PCR鑒定uPA的表達(誘導的細胞應擴增 出 316bp 的目的條帶),擴增引物為:RT-uPA-F :cttcgtctgtagaccaacaag,RT-uPA-R gtgcaagatgagctgctccac ;擴增結果如圖4 :A和B。圖4中A為不同條件下細胞中uPA RT-PCR 的檢測結果,泳道1為Marker2000 (Takara),泳道2為以Tet-on共轉染但未誘導的實驗組 細胞RNA為模板;泳道3為以Tet-on共轉染且誘導的實驗組細胞RNA為模板;泳道4為 以小鼠腎組織總RNA為模板PCR結果。圖4中B為與圖A對應的內參照GAPDH的RT-PCR 結果。內參照 GAPDH 的擴增引物為 GAPDH-F 5 ‘ -TTCACCACCATGGAGAAGGC-3 ‘ ; GAPDH-R 5 ‘ -CCTCAGTGTAGCCCAAGATGC-3 ‘。該實驗表明,pTRE2_uPA_711 與 Tet-on 共轉染 Huh7 細 胞系,在Dox誘導后能檢測到uPA RNA水平表達,即體外Dox誘導實現(xiàn)了 uPA mRNA表達。溶圈法鑒定uPA的生物學活性。簡述如下誘導后48小時收集細胞培養(yǎng)上清。 IOml 瓊脂糖凝膠中加入凝血酶(Thrombin,Τ)和纖維蛋白原(Fibrinogen,F(xiàn)),混勻后 迅速倒板,凝固后打孔,加入收集的細胞培養(yǎng)上清,37°C濕盒中放置過夜。圖5為溶圈法鑒 定結果,其中1為uPA標注品(0. 2IU),2為正常細胞培養(yǎng)上清組,3為共轉染質粒但未誘導 組,4共轉染質粒加Dox誘導組。該實驗表明,pTRE2-uPA-711與Tet-on共轉染Huh7細胞 系,在Dox誘導后能檢測到uPA蛋白表達,且具有生物學活性。實施例2、tetO-uPA轉基因小鼠的制備及鑒定一、tetO-uPA轉基因首建鼠的制備及PCR鑒定將pTRE2-uPA_711質粒用Pvu I酶切,瓊脂糖凝膠回收5739bp線性化片段,進行 C57XCBA Fl小鼠受精卵(母本為CBA小鼠,父本為C57小鼠,均購自北京華阜生物科技股 份有限公司)細胞原核DNA顯微注射,注射卵分別移植到假孕母鼠輸卵管中,轉基因小鼠出 生后第2周剪取約0. 5cm鼠尾,提取基因組DNA,在轉基因載體上下游各設計一對引物進行 PCR鑒定,引物設計示意圖及序列如圖6所示,引物序列如下所述上游序列引物(陽性小鼠應擴增得到465bp的片段)2-up-F :gtttagtgaaccgtcagatcgcctg ;2-up-R :ctaggct aatagcat caggtctgo下游序列引物(陽性小鼠應擴增得到498bp的片段)
2-down-F ggtagcttgaggagtagagacact ;2-down-R :gacaatggttgtaacagagtag。PCR 反應體系如下2· 5μ 1 10 XBuffer (含 MgCl2),2 μ 1 dNTP,0. 2μ 1 Taq, 0· 5 μ 1 (10 μ mol/L)引物(2-up-F 和 2-up-R,或者 2-down-F 和 2-down-R),1· 5 μ 1 上述提 取的基因組 DNA,17. 8μ 1 ddH20。PCR 反應條件如下先 5°C 5min ;再 4°C 30S,54°C 30S, 72°C 30S,進行34個循環(huán);最后720C 7min。PCR陽性小鼠即為tetO_uPA轉基因首建小鼠。結果表明,顯微注射出生73只小鼠于2-3周齡剪尾抽提基因組DNA,經PCR篩選 發(fā)現(xiàn)5只轉基因陽性小鼠(3只$ 2只早)(部分PCR鑒定結果見圖6),耳號標記如下 yc-074 (早),yc-075 (早),yc-061 U ),yc-055 U ),yc-054 (古)。圖 6 中 A 為上游序列 引物鑒定結果,B為下游序列引物鑒定結果。圖6A和B中,泳道1為分子量MBI GenenRuler IOObp DNA Ladder marker,泳道2_6為不同首建鼠,泳道7為正常鼠,泳道8為空白對照,9 為陽性對照。二、肝組織特異性表達rtTA蛋白的轉基因小鼠的構建及其鑒定1、肝組織特異性表達rtTA的載體pTet-on-albumin的構建l)pTet-on質粒的改構為了將小鼠血清白蛋白基因啟動子及增強子序列插入pTet-on啟動子位置,以代 替pTet-on載體中的CMV啟動子,合成link以引入合適的酶切位點,依次為SpeI、Ec0R V、 Spe I ,Kpn I、Apa I ,Not I、EcoR I ;具體方法如下所述合成 link弓丨物,序列為 tet-on-linker F 5' -ctaggatatcactagtggtaccgggcccg cggccgcg-3‘ ,tet-on-linker R 5‘ -aattcgcggccgcgggcccggtaccactagtgatatc-3‘,將 tet-on-linker F 和 tet-on-linker R 在 PCR 儀中 95°C退火 IOmin,獲得 PCR 產物。將上述獲得的PCR產物同樣用EcoR I和Spe I雙酶切,回收純化后,插入到 pTet-on的EcoR I和Spe I酶切位點之間,得到重組載體,將獲得的重組載體用EcoR V / Sal I雙酶切、EcoR V /BamH I雙酶切鑒定,然后測序鑒定,結果表明linker已插入 pTet-on載體中;將鑒定表明正確的含有上述PCR獲得的link序列的重組載體命名為 pTet-on-link。2)肝組織特異性表達rtTA的載體pTet-on-albumin質粒的構建將克隆并鑒定正確的增強子序列及啟動子序列插入改構以后的pTet-on載體中, 構建pTet-on-albumin載體,具體方法如下所述按照分子克隆的方法提取C57BL/6J小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限 公司)肝組織基因組DNA,以此為模板PCR擴增小鼠血清白蛋白增強子序列(自GENBANK 號(Accession. Version)為 AC140220. 4 的 5 ‘端第 104540-106528 位核苷酸序列),上 游引物 F 5' -gccgagctcctgccggctagcttccttagcatg-3 ‘(引入 Sac I 位點),下游弓|物 R 5 ‘ -gggttaaggatcccaagctggag-3 ‘(存在 BamH I 位點),PCR 擴增獲得 1993bp 的片 段,經測序表明該片段具有自GENBANK號(Accession. Version)為AC140220. 4的5'端 第104540-106528位核苷酸序列,即為小鼠血清白蛋白增強子序列;將PCR獲得的片段用 Sac I和BamH I雙酶切,克隆至pGEM_7ZF載體Sac I和BamH I酶切位點之間,得到重組載 體,將該重組載體進行酶切和測序驗證,將驗證正確的含有小鼠血清白蛋白增強子序列的 載體命名為 p7ZF-Up-promoter。
以小鼠C57BL/6J小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)基因組DNA 為模板PCR擴增小鼠血清白蛋白啟動子序列(自GENBANK號(Accession. Version)為 AC140220. 4 的 5'端第 115631-115832 位核苷酸序列),上游引物 F 5,_cgggatccacagctcc agatggcaaacatac-3,(弓丨入 BamH I 位點),下游弓丨物 R 5,_tttgccagaggctagtggggttg_3,, 擴增產物用BamH I酶切,經PCR產物瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化獲得小鼠血清白蛋白啟動 子。 將p7ZF-up-promoter用BamH I和Sma I雙酶切,切膠回收作為載體,將純化 后的小鼠血清白蛋白啟動子連接入載體中,獲得重組載體,將獲得的重組載體用BamH I 酶切鑒定并測序,將酶切鑒定和測序表明正確的重組載體命名為p7ZF-Up-albUmin。將 p7ZF-up-albumin 用 Sac I 酶切,T4 DNA Polymerase 消平,Kpn I 酶切,切膠回收 2233bp 的片段,將回收的片段連接入EcoR V和Kpn I雙酶切后的pTet-on-link載體中,獲得重組 載體,將重組載體用BamH I酶切可見5022bp、1284bp、2689bp的條帶出現(xiàn),與預測結果相 符;對重組載體的增強子和啟動子接頭處進行測序,結果與預期相符。將該載體進行酶切和 測序鑒定,將鑒定表明正確的載體命名為pTet-on-albumin。pTet-on-albumin的序列中小 鼠血清白蛋白增強子、小鼠血清白蛋白啟動子和rt TA基因(自GENBANK號(Accession. Version)為U89930. 1的5'端第774-1781位核苷酸序列)依次串連,該pTet-on-albumin 的序列見序列表中序列2。其中小鼠血清白蛋白增強子、小鼠血清白蛋白啟動子和rt TA基 因分別是序列2中第115-2103位、第2109-2310位、第2370-3377位核苷酸序列。2、肝組織特異性表達rtTA的載體pTet-on-albumin的白蛋白啟動子轉錄活性的 活體鑒定l)Albumin:rtTA轉基因首建鼠制備及PCR鑒定pTet-on-albumin質粒用XhoI酶切,瓊脂糖凝膠回收6034bp片段,進行C57 X CBA Fl小鼠受精卵(母本為CBA小鼠,父本為C57小鼠,均購自北京華阜生物科技股份有限公 司)細胞原核DNA顯微注射,注射卵分別移植到假孕母鼠輸卵管中,轉基因小鼠出生后第2 周剪取約0. 5cm鼠尾,提取基因組DNA,在轉基因載體上下游各設計一對引物進行PCR鑒定, 引物設計示意圖及序列如圖7所示,引物序列如下所述上游序列引物Ι-up-F GTGCAGCTTGGCTTGAACTCGTTC ;1-up-R :GAGTATGGTGCCTATCTAACATCTC。下游序列引物Ι-down-F GACGCGCTAGACGAFTTCGATCTG ;1-down-R :ACCTTGCACAGATAGCGTGGTC。PCR 反應體系如下2· 5μ 1 10 X Buffer (含 MgCl2),2 μ 1 dNTP,0. 2μ 1 Taq, 0· 5 μ 1 (10 μ mol/L)引物(1-up-F 和 1-up-R,或者 l-down-F 和 1-down-R),1· 5 μ 1 上述提 取的基因組 DNA,17. 8 μ 1 ddH20。PCR 反應條件如下先 5°C 5min ;再 4°C 30S,54°C 30S, 72V 30S,進行 34 個循環(huán); 最后 72 0C 7min。PCR陽性小鼠即為Albumin:rtTA轉基因首建小鼠。結果表明,顯微注射出生49只小鼠于2-3周齡剪尾抽提基因組DNA,經PCR篩選發(fā)現(xiàn)9只轉基因陽性小鼠(部分PCR鑒定結果見圖8),耳號標記如下yc-063(早), yc-051(早),yc-071(早),yc-073(早),yc-065 (早),yc-068( $ ),yc-064( $ ), yc-056( $ ),yc-059( $ )。圖8中A為上游序列引物鑒定結果,B為下游序列引物鑒定結 果。圖8中A和B中,泳道1-9為不同首建鼠,泳道10為分子量marker,泳道11為正常鼠, 泳道12為陽性對照。2) Albumin :rtTA轉基因Fl代鼠的獲得與鑒定取步驟1)獲得的9只首建鼠,培養(yǎng)至8周齡性成熟首建鼠,將其與8周齡的野生 型小鼠C57BL/6J交配,2周齡仔鼠進行耳號標記,其中4只首建鼠共產仔8窩,yc-063和 yc-065分別產3窩,yc-064和yc-056分別產1窩,3周齡時剪尾按分子克隆提取基因組 DNA, PCR檢測陽性Fl代小鼠,PCR體系及反應條件同步驟1)。3、轉基因小鼠Fl代rtTA轉錄水平鑒定取不同首建小鼠所生Fl代轉基因陽性小鼠(yc-063及yc-065所生Fl代轉基 因陽性小鼠234和222)及陰性小鼠(yc-063及yc-065所生F 1代轉基因陰性小鼠232 和223),斷頸處死后剪取腦、胸腺、心、肺、腎、腸、脾、肝等不同組織少許(不超過30mg),于 1.5ml EP 管中剪碎,總 RNA 提取使用 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Cat. No. 74106),提取的總 RNA經Nanodrop 1000分光光度儀測定濃度及純度,各種組織總RNA取400ng,使用Takara RNA LA PCR Kit (AMV) Verl. 1 進行反轉錄反應,體系為2 μ 1 MgCl2 (25謹ol/L),1 μ 1 10XRNA PCR Buffer, 1 μ 1 dNTP Mixture, 0. 25 μ 1 RNase Inhibitor, 0. 5 μ 1 AMV Reverse Transcriptase,0.5 μ 1 Random 9mers,0.5 μ 1 Oligo dT-Adaptor Primer,400ng RNA, 用 RNase Free dH20 補足至 10 μ 1 體系,反應條件為30°C 10min,42°C 30min,99°C 5min, 5°C 5min,在 RT 反應結束后加入以下 PCR 體系3μ 1 MgCl2 (25讓ol/L),4 μ 110XLA PCR Buffer 11,31. 75 μ 1 dH20,0. 25 μ 1 Takara LA Taq,0. 5 μ 1 引物(10 μ mol/L,分別用引 物對rtTA-F和rtTA-R,或者GAPDH-F和GAPDH-R進行擴增)反應條件如下94°C 2min, (94°C 30S,56°C 30S,72°C 30S) X32,72°C IOmin, RT-PCR 產物用 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 總RNA提取過程中勻漿操作使用TlO basic ULTRA-TURRAX勻漿機5檔勻漿40S即可(購 自IKA公司)。引物序列如下rtTA-F :5:GACGCGCTAGACGATTTCGATCTG_3—rtTA-R :5、-ACCTTGCACAGATAGCGTGGTC-3、GAPDH-F :5~_ACC ACC ATG GAG AAG GCT GC-3、GAPDH-R : 5 :CTC AGT GTA GCC CAG GAT GC-3、Albumin:rtTA轉基因Fl代陽性小鼠rtTA mRNA表達鑒定結果如圖9-圖12所 示,結果表明234號陽性小鼠rtTA mRNA在肝組織特異性表達,222號陽性小鼠除在肝組織 表達外,在肺和腎也有少量表達,232號和223號陰性小鼠各種組織均不表達。圖9-圖12 中左圖均為轉基因鼠不同組織rtTA RT-PCR檢測,右圖均為轉基因鼠不同組織GAPDH mRNA RT-PCR檢測。圖9-圖12中左圖的PC表示瞬時轉染pTet-on質粒48h后Huh7細胞提取總 RNA RT-PCR 結果。4、Albumin:rtTA轉基因陽性鼠Fl代rtTA蛋白表達鑒定Fl代轉基因陽性小鼠(yc-063及yc-065所生Fl代轉基因陽性鼠234和222)及 陰性小鼠(yc-063及yc-065所生Fl代轉基因陰性鼠232和223)不同組織總蛋白的提取,使用以下配方的組織蛋白裂解液10mM IM Tris-HCl, 1% (V/V)Triton X-100,1% (V/V) 去氧膽酸鈉,0.1% (V/V) 10% (g/ml)SDS,0. 4% (V/V)NP-40,150mM NaCl,5mM EDTA,0.2mM 原釩酸鈉,蒸餾水定容。提取前分別在組織蛋白裂解液中加入蛋白酶抑制劑Aprotinin、 P印statin A、Leup印tin、PMSF,使其終濃度分另Ij為 2 μ g/ml,0. 7 μ g/ml,0. 5 μ g/ml,ImM。組織蛋白提取的具體方法為取不超過30mg各種組織,加入上述組織蛋白裂解液 及4種蛋白酶抑制劑,TlO basic ULTRA-TURRAX分散機5檔勻漿40S后,冰浴30min,每5min 振勻1次,13000rpm 4°C離心15min,上清即為總蛋白溶液。總蛋白定量使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司,P0006),各取50 μ g 總蛋白溶液,加入5 X SDS上樣緩沖液及1/20體積β -巰基乙醇,煮沸l(wèi)Omin,IOOOOrpm離心 5min,上清用于rtTA蛋白的Western檢測,其余置于-80°C保存。rtTA蛋白檢測一抗使用 TetR monoclonal antibody (Clontech,Cat. No. 631108),稀釋度 1 1000,GAPDH 蛋白一抗 使用 Anti-GAPDH polyclonal antibody (Sigma, Cat. No. G9545),二抗分別使用 HRP 標記山 羊抗小鼠IgG及HRP標記山羊抗兔IgG(中杉金橋公司,Lot. No. 80259),稀釋度1 5000, 顯影液使用 SuperSignal WestDura Trial Kit (Thermo SCIENTIFIC, Code #37071,Lot #KE132546)。Albumin:rtTA轉基因Fl代陽性鼠rtTA蛋白表達鑒定結果如圖13-圖15所示, 結果表明,234號和222號陽性鼠rtTA蛋白在肝組織特異性表達,而232號和223號陰性 鼠則在各組織均不表達。圖13-14中左圖分別為轉基因陽性鼠234和222不同組織rtTA Western blot檢測結果,右圖均為左圖中相應組織GAPDH蛋白Western blot檢測結果。圖 15為轉基因陰性鼠232 (左圖)和223 (右圖)不同組織rtTA Western blot檢測結果,圖 13-15中PC均表示瞬時轉染pTet-on質粒48h后Huh7細胞提取總蛋白Western blot結^ ο取已鑒定rtTA蛋白在肝組織特異性表達的同窩Fl代轉基因陽性鼠雌雄自交,所 生F2代轉基因陽性小鼠用于保種繁育。用于與步驟一獲得的轉基因小鼠雜交。三、可誘導肝細胞特異性表達UPA轉基因小鼠的制備及鑒定取步驟1獲得的5只首建鼠,培養(yǎng)至8周齡性成熟首建鼠,將其與8周齡的野生型 小鼠C57BL/6J交配,2周齡仔鼠進行耳號標記,剪尾按分子克隆提取基因組DNA,PCR檢測 uPA轉基因陽性Fl代小鼠,PCR體系及反應條件同步驟一。將8周齡uPA轉基因陽性Fl代 小鼠與步驟二構建的8周齡rtTA蛋白在肝組織特異性表達的Albumin-rtTA轉基因小鼠雜 交,所生2周齡仔鼠進行耳號標記,剪尾按分子克隆提取基因組DNA,PCR檢測雙轉基因陽性 小鼠,tetO-uPA PCR體系及反應條件同步驟一,Albumin-rtTA PCR檢測引物如下所述Ι-up-F GTGCAGCTTGGCTTGAACTCGTTC ;1-up-R GAGTATGGTGCCTATCTAACATCTC。PCR 反應體系如下2·5μ1 10 X Buffer (含 MgCl2),2 μ 1 dNTP,0. 2μ 1 Taq,0. 5 μ 1 (10 μ mol/L)引物(l-up-F 和 1-up-R),1. 5 μ 1 上述提取的基因組 DNA, 17. 8 μ IddH2O0PCR 反應條件如下先 5°C 5min ;再 4°C 30S,54°C 30S,72°C 30S,進行 34 個循環(huán); 最后 72 0C 7min。tetO-uPA和Albumin-rtTA PCR均為陽性的小鼠即雙轉基因陽性小鼠
11(albumin-rtTA :TetO_uPA)。該實驗原理為AlbUmin-rtTA轉基因小鼠在肝組織特異性表達rtTA蛋白,該小鼠 與tetO-uPA轉基因鼠雜交所生子代鼠在肝組織也會特異性表達rtTA蛋白,加入Dox誘導 時,rtTA表現(xiàn)為活性形式,與tetO-uPA中操縱基因序列TetO結合,發(fā)揮轉錄活性,實現(xiàn)肝 組織uPA特異性表達。3、雙轉基因小鼠肝組織uPA表達鑒定鑒定陽性的雙轉基因小鼠(albumin-rtTA TetO-uPA)飼喂含Dox(0. 5mg/ml)的飲 水誘導uPA的表達,誘導十周后收集血清進行ALT水平鑒定;處死小鼠并取各組織臟器進 行uPA特異性表達的檢測。以未添加Dox的飲水為對照。實驗結果可見uPA在肝組織特異 性表達(圖16),利用兔抗小鼠uPA單克隆抗體免疫組化檢測肝組織壞死灶有uPA特異性 表達;組織病理學檢測誘導小鼠肝組織中肝細胞胞漿疏松,肝組織灶狀壞死,枯否細胞增多 (圖17)。檢測血清中ALT水平增高,進一步暗示肝組織受到一定損傷(圖18)。圖18中A 代表雙轉基因陰性小鼠組,B代表單轉基因陰性小鼠組,C代表雙轉基因陽性小鼠組。
權利要求
一種載體,其核苷酸序列包括依次串連的細菌四環(huán)素耐藥操縱子序列、人類巨噬細胞的立早啟動子序列、小鼠尿激酶原激活劑表達框和小鼠尿激酶原激活劑表達框最后一個外顯子后的序列;所述小鼠尿激酶原激活劑表達框的核苷酸序列為自GENBANK號為NM_008873.3的5′端第104 1405位核苷酸序列;所述小鼠尿激酶原激活劑表達框最后一個外顯子后的序列的核苷酸序列為白GENBANK號為NM_008873.3的5′端第1363 2074位核苷酸序列,所述細菌四環(huán)素耐藥操縱子序列為序列1的5′端第7 300位核苷酸序列;所述人類巨噬細胞的立早啟動子序列為序列1的5′端第301 438位核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的載體,其特征在于構建所述載體的出發(fā)質粒為PTRE2質粒。
3.根據權利要求2所述的載體,其特征在于所述載體的核苷酸序列為序列表中序列1。
4.用于構建受四環(huán)素或者四環(huán)素衍生物誘導uPA表達的轉基因小鼠模型的組合載體, 由權利要求1-3中任意一項所述的載體和組織特異性表達rtTA的真核表達載體組成。
5.根據權利要求4所述的組合載體,其特征在于組織特異性表達rtTA的真核表達 載體為肝組織特異性表達rtTA的真核表達載體;所述肝組織特異性表達rtTA的真核表 達載體,其核苷酸序列包括依次串連的小鼠血清白蛋白增強子序列、小鼠血清白蛋白啟動 子序列和rtTA基因序列;所述小鼠血清白蛋白增強子的核苷酸序列為自GENBANK號為 AC140220. 4的5'端第104540-106528位核苷酸序列;所述小鼠血清白蛋白啟動子的核苷 酸序列為自GENBANK號為AC140220. 4的5'端第115631-115832位核苷酸序列;所述rtTA 基因的核苷酸序列為自GENBANK號為U89930. 1的5'端第774-1781位核苷酸序列。
6.根據權利要求5所述的組合載體,其特征在于所述肝組織特異性表達rtTA的真核 表達載體的出發(fā)質粒為pTet-on質粒。
7.根據權利要求6所述的組合載體,其特征在于所述肝組織特異性表達rtTA的真核 表達載體的核苷酸序列為序列表中序列2。
8.權利要求1-3中任意一項所述的載體在構建受四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)調控表達uPA的 轉基因動物中的應用,所述動物優(yōu)選為小鼠。
9.權利要求1-3中任意一項所述的載體或權利要求4-9中任意一項所述的一組載體在 構建受四環(huán)素或者四環(huán)素衍生物誘導uPA表達的轉基因動物模型中的應用,所述動物優(yōu)選 為小鼠。
10.根據權利要求9所述的應用,其特征在于所述構建受四環(huán)素或者四環(huán)素衍生物誘 導uPA表達的轉基因小鼠模型,包括下述步驟1)將權利要求1-3中任意一項所述的載體導入小鼠篩選獲得轉基因小鼠;2)將權利要求4-8中任意一項所述的表達rtTA的真核表達載體導入小鼠篩選獲得轉 基因小鼠;3)將步驟1)和步驟2)獲得的小鼠雜交,篩選轉入獲得權利要求1-3中任意一項所述 的載體和所述表達rtTA的載體的轉基因小鼠,即獲得受四環(huán)素或者四環(huán)素衍生物誘導uPA 表達的轉基因小鼠模型;所述四環(huán)素衍生物為強力霉素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株受四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)調控uPA表達的效應載體,其核苷酸序列包括依次串連的細菌四環(huán)素耐藥操縱子和人類巨噬細胞的立早啟動子序列、小鼠尿激酶原激活劑表達框和小鼠尿激酶原激活劑表達框最后一個外顯子后的序列。本發(fā)明通過上述載體創(chuàng)建受四環(huán)素或其衍生物誘導表達系統(tǒng)調控uPA表達的轉基因小鼠模型,為進一步構建組織特異性可調控表達uPA轉基因動物模型,用于特定組織中uPA功能研究奠定了堅實基礎。
文檔編號C12N15/63GK101948860SQ20101025735
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月19日 優(yōu)先權日2010年8月19日
發(fā)明者于虹, 周小軍, 周育森, 孫世惠, 肖文珺, 胡婧雅, 郭彥 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所
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