專利名稱：一種轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌的三親雜交方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及沒有染色體抗性標(biāo)記的野生型發(fā)根農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化，屬于生物技術(shù) 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化、作物品質(zhì)的改 良，以及培育抗病、抗蟲、抗逆性較強(qiáng)的工程植物具有越來越廣泛的應(yīng)用。目前應(yīng)用的有根 癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌2種。根癌農(nóng)桿菌因介導(dǎo)外源基因插入的完整性好，但Ti質(zhì)粒的 T-DNA上具有致病基因，外源基因表達(dá)易失活，基因的表達(dá)和植株再生不相容，且操作復(fù)雜， 取材限制大，轉(zhuǎn)化效率低，且必須要有成熟的再生系統(tǒng)，限制了它的廣泛應(yīng)用；而發(fā)根農(nóng)桿 菌對植物的侵染是自然界中天然的遺傳轉(zhuǎn)化模式。發(fā)根農(nóng)桿菌iAgrobacterium rhizogenes)侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，Ri質(zhì)粒的 TL-DNA上的rWA-D基因群和TR-DNA的tms基因能誘發(fā)被感染植物的受傷部位產(chǎn)生大量 的毛狀根，發(fā)根農(nóng)桿菌也可以同時(shí)轉(zhuǎn)化雙元Ti質(zhì)粒，將Ti質(zhì)粒上的DNA整合進(jìn)植物基因 組，穩(wěn)定地遺傳給后代，實(shí)現(xiàn)植物的轉(zhuǎn)基因。同時(shí)野生型發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的T-DNA不 影響植株的再生，而且轉(zhuǎn)化效率高，因此在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用越來越多，并已在甘草 (Glycyrrhiza uralensis F.)、煙草(Ai'coiiaaa tabacum L.)、藍(lán)豬耳(Threwia fournieri L.)、鈍莨菪(辦O1SCJ^m1S muticus L.)等中獲得成功。將攜帶外源基因的雙元載體質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化 的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)?；瘜W(xué)法、電擊轉(zhuǎn)化法、三親雜交法是根癌農(nóng)桿菌研究中將雙元質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì) 菌中常用的方法?；瘜W(xué)法操作簡單，但重復(fù)性差，需要用到液氮等危險(xiǎn)藥品和冷凍離心機(jī)等 貴重儀器，而且由于發(fā)根農(nóng)桿菌菌體生長慢、植物基因工程所用雙元表達(dá)載體較大，利用該 方法制備的發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞往往不能取得滿意的轉(zhuǎn)化效率。電擊轉(zhuǎn)化法是利用外加 電場造成菌的跨膜電勢并形成細(xì)胞表面孔洞，從而攝取外源DNA。該方法轉(zhuǎn)化效率高于化學(xué) 法，但操作復(fù)雜，需要重復(fù)用超純水洗滌，對菌液需求量大，而且要用到電轉(zhuǎn)化儀、冷凍離心 機(jī)等貴重儀器。三親雜交法只需要在輔助菌的參與下就可以完成導(dǎo)入，是三種方法中效率 最高的，但需要受體菌具有相對于供體菌和輔助菌特殊的篩選標(biāo)記，由于野生型發(fā)根農(nóng)桿 菌沒有染色體抗性標(biāo)記而不能應(yīng)用，因此很大程度上制約了發(fā)根農(nóng)桿菌在植物轉(zhuǎn)基因中的 應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種適合于沒有染色體抗性標(biāo)記的野生型發(fā)根農(nóng)桿菌的 三親雜交轉(zhuǎn)化方法，加快野生型發(fā)根農(nóng)桿菌在植物轉(zhuǎn)基因工程中的應(yīng)用。首先對三親雜交所需的供體菌、受體菌和輔助菌三類菌株進(jìn)行分析，改變之前三
3親雜交方法應(yīng)用受體菌攜帶的不同于供體菌和輔助菌的染色體的抗性標(biāo)記進(jìn)行的正向選 擇的方法，根據(jù)供體菌和輔助菌菌株自身的基因和營養(yǎng)缺陷，以缺陷型培養(yǎng)基做篩選標(biāo)記， 進(jìn)行三親雜交完成基因向野生型發(fā)根農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化，并對菌株不同生長狀態(tài)以及不同 共培養(yǎng)時(shí)間下的轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化的假陽性率進(jìn)行了調(diào)查。本發(fā)明具體實(shí)現(xiàn)過程如下
一種轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌的三親雜交方法，其特征在于供體菌、受體菌和輔助菌三類菌株 中，供體菌和輔助菌菌株為營養(yǎng)缺陷型并帶有抗性標(biāo)記，受體菌為野生型發(fā)根農(nóng)桿菌，以缺 陷型培養(yǎng)基加相應(yīng)抗生素作篩選標(biāo)記進(jìn)行三親雜交，完成基因向野生型發(fā)根農(nóng)桿菌的遺傳 轉(zhuǎn)化。所述供體菌為大腸桿菌DH5a (pCAMBIA2300_attacin)，輔助菌為大腸桿菌 HBlOl (PRK2013)，DH5a和HBlOl的基因型為基因缺陷，即維生素Bl的營養(yǎng)缺陷，其 中所含質(zhì)粒均帶有Kan抗性。所述缺陷型培養(yǎng)基為匪培養(yǎng)基。所述受體菌為野生型發(fā)根農(nóng)桿菌A4。轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌的三親雜交方法具體實(shí)施步驟如下
(1)分別挑取供體菌DH5a(pCAMBIA2300-attacin)、輔助菌 HBlOl (PRK2013)單菌落于 含Kan抗生素的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，挑取野生型發(fā)根農(nóng)桿菌A4于YEB液體培養(yǎng)基 中震蕩培養(yǎng)；
(2)取等量的三種菌液離心，收集菌體，YEB培養(yǎng)基重懸并混合，再次離心，重復(fù)洗滌，最 后所得菌體用YEB培養(yǎng)基混勻；
(3)吸取混合液涂布在YEB平板上的無菌的微孔濾膜上，正置平板培養(yǎng)；
(4)取出濾膜，置入MM液體培養(yǎng)基中震蕩混勻1h，取50 PL菌液于含Kan抗生素的 MM固體平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)獲得單菌落；
(5)挑取單菌落MM液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，堿裂解法提取質(zhì)粒；
(6)以提取的質(zhì)粒DNA為模板，以rWB、iWC和aiiaci/ 基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲 得相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，證明pCAMBIA2300-attacin成功轉(zhuǎn)化至發(fā)根農(nóng)桿菌A4 ；隨機(jī)挑取的30 個(gè)單菌落(約總數(shù)的1/6)，均為陽性克隆。上述步驟(2)和(3)中，三種菌分別培養(yǎng)至0D600 ^ 0. 6時(shí)取菌液，洗滌后共培養(yǎng) 2^3 h獲得最大的轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是利用三親雜交對無染色體抗性標(biāo)記的野生型發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行遺 傳轉(zhuǎn)化，解決了其他轉(zhuǎn)化方法效率不高的缺陷，且對于化學(xué)、物理轉(zhuǎn)化方法不明確菌株進(jìn)行 三親雜交轉(zhuǎn)化具有重要的參考價(jià)值。


圖1為轉(zhuǎn)化獲得單菌落提取質(zhì)粒的PCR ；
圖2為單菌落假陽性率的ro/B、ro/C和attacin基因的PCR擴(kuò)增。
具體實(shí)施例方式圖1為轉(zhuǎn)化獲得單菌落提取質(zhì)粒的PCR;其中M代表分子量標(biāo)準(zhǔn)，每條帶的大小(bp)標(biāo)于左側(cè)，泳道1、3、5分別為rol B基因、rol C基因和attacin基因以 A4 (pCAMBIA2300-attacin)菌株提取的質(zhì)粒做模板進(jìn)行的PCR ；泳道2、4分別為rol B基因 和rol C基因的以大腸桿菌菌株質(zhì)粒提取的模板進(jìn)行的PCR ；泳道6分別為分別為attacin 基因的A4(pCAMBIA2300-attacin)菌株的質(zhì)粒模板和大腸桿菌菌株質(zhì)粒模板的PCR檢測； 圖2為單菌落假陽性率的ro/B、rolC和attacin基因的PCR擴(kuò)增；其中A圖為rol B 基因PCR擴(kuò)增；B圖為rol C基因的PCR擴(kuò)增；C圖為attacin基因的PCR擴(kuò)增；M代表分子 量標(biāo)準(zhǔn)，每條帶的大小(bp )標(biāo)于左側(cè)。本發(fā)明轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌的三親雜交方法具體實(shí)施步驟如下
(1)分析各菌株的最小培養(yǎng)基和基因型野生型發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株的最小營養(yǎng)培養(yǎng)基 為匪培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基不含有維生素Bl ；大腸桿菌DH5a和HBlOl的基因型為thH基因 缺陷，即維生素Bl的營養(yǎng)缺陷，在不含有維生素Bl的培養(yǎng)基上不能生長，分別以此菌株做 供體菌和輔助菌；
(2)分別挑取含重組雙元載體pCAMBIA2300-attacin的供體菌DH5a和含游動(dòng)質(zhì)粒 PRK2013的輔助菌HBlOl的單菌落于IOml含50 mg/L Kan抗生素的LB液體培養(yǎng)基，同 時(shí)挑取野生型發(fā)根農(nóng)桿菌A4單菌落于10ml YEB培養(yǎng)基，26 °C，160 r/min震蕩培養(yǎng)至 0D600 ^ 0. 6時(shí)進(jìn)行三親雜交，具體步驟為取三種菌各2 mL，5000 r/min離心3 min, YEB 培養(yǎng)基重懸并混合，再次5000 r/min離心3 min,收集菌體，并重復(fù)2次，所得菌體用150 μ L YEB液體培養(yǎng)基混勻；
(3)吸取50μ L混合液涂布于無菌的0. 45 mm微孔濾膜(直徑2. 5 cm)上，而后放置 在不含抗生素的YEB平板上，26°C正置平板培養(yǎng)3 h。取出濾膜，置入3 mL MM液體培養(yǎng)基 中，震蕩混勻1 h后取50 μ L涂布于含Kan抗生素的MM固體平板培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2 3 d，獲得單菌落；
(4)挑取匪固體平板培養(yǎng)基上生長的單菌落于含Kan抗生素的匪液體培養(yǎng)基振蕩 培養(yǎng)纊3 d，堿裂解法提取質(zhì)粒，并以提取的質(zhì)粒DNA為模板，以野生型發(fā)根農(nóng)桿菌A4自 身的rWB、r0A基因和重組雙元載體攜帶的基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以 DH5a(pCAMBIA2300-attacin)和HBlOl (PRK2013)的混合菌液、以及A4菌以同樣方法提取的 質(zhì)粒為模板，三個(gè)基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增做陰性對照，鑒定遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果。所用引物序列分別為
rolBF: 5’ -GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’ ； rolBR: 5’ - GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3，； rolCF: 5’ -CTCCTGACATCAAACTCGTC-3’ ； rolCR: 5’ - TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3’ ； attacinF: 5’ -TTAGAAGAATTTCGAGAAGGAG-3，；
attacinR: 5，-ATGTCCAAGAGTGTAGCGTTG-3，，分別擴(kuò)增 423 bp,626 bp 和 655 bp 的 目的產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析(見圖1、圖2)；
(5)在三種菌的OD600約0.2,0. 4,0. 6,0. 7,0. 9,1. 0時(shí)分別取樣進(jìn)行共培養(yǎng)，分別培養(yǎng) 1 h、2 h、3h、4 h、5 h和12 h，在各種菌分別培養(yǎng)至對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行共培養(yǎng)，共培養(yǎng)2 3 h 具有獲得203個(gè)轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化效率最大；
(6 )隨機(jī)挑取匪固體平板培養(yǎng)基上單菌落30個(gè)(約總數(shù)的1 /6 )，rol込、rolC和a tacin基因的引物進(jìn)行菌落PCR和1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所有菌落均為陽性克隆。
綜上所述，分析受體菌野生型發(fā)根農(nóng)桿菌A4的最小營養(yǎng)培養(yǎng)基，為不含有維 生素Bl的匪培養(yǎng)基，分析大腸桿菌DH5a和HBlOl為Ai-I基因缺陷，即維生素Bl 的營養(yǎng)缺陷，在不含有維生素Bl的培養(yǎng)基上不能生長，分別使用含有重組雙元載體 pCAMBIA2300-attacin的DH5a和游動(dòng)質(zhì)粒PRK2013的HBlOl做野生型發(fā)根農(nóng)桿菌三親轉(zhuǎn) 化的供體菌和輔助菌；三種菌的單菌落分別在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中于26°C 160 r/min 進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至0D600 - 0. 6時(shí)按常規(guī)三親雜交轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后混合 液均勻涂布于含重組雙元載體pCAMBIA2300-attacin的Kan抗生素的培養(yǎng)基平板進(jìn)行篩 選，獲得轉(zhuǎn)化有attacin基因的野生型發(fā)根農(nóng)桿菌A4;該方法在各種菌分別培養(yǎng)至對數(shù)生 長期時(shí)進(jìn)行共培養(yǎng)，共培養(yǎng)纊3 h具有最大的轉(zhuǎn)化效率，使用該方法獲得的單菌落全為陽性 菌落。
權(quán)利要求
一種轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌的三親雜交方法，其特征在于供體菌、受體菌和輔助菌三類菌株中，供體菌和輔助菌菌株為營養(yǎng)缺陷型并帶有抗性標(biāo)記，受體菌為野生型發(fā)根農(nóng)桿菌，以缺陷型培養(yǎng)基加相應(yīng)抗生素作篩選標(biāo)記進(jìn)行三親雜交，完成基因向野生型發(fā)根農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌的三親雜交方法，其特征在于供體菌為大 腸桿菌 DH5a(pCAMBIA2300-attacin)，輔助菌為大腸桿菌 HBlOl (PRK2013)，DH5a 和 HBlOl 的基因型為thi-Y基因缺陷，即維生素Bl的營養(yǎng)缺陷，其中所含質(zhì)粒均帶有Kan抗性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌的三親雜交方法，其特征在于缺陷型培養(yǎng)基為匪培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌的三親雜交方法，其特征在于受體菌為野 生型發(fā)根農(nóng)桿菌A4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌的三親雜交方法，其特征在于包括以下步驟(1)分別挑取供體菌DH5a(pCAMBIA2300-attacin)、輔助菌 HBlOl (PRK2013)單菌落于 含Kan抗生素的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，挑取野生型發(fā)根農(nóng)桿菌A4于YEB液體培養(yǎng)基 中震蕩培養(yǎng)；(2)取等量的三種菌液離心，收集菌體，YEB培養(yǎng)基重懸并混合，再次離心，重復(fù)洗滌，最 后所得菌體用YEB培養(yǎng)基混勻；(3)吸取混合液涂布在YEB平板上的無菌的微孔濾膜上，正置平板培養(yǎng)；(4)取出濾膜，置入MM液體培養(yǎng)基中震蕩混勻1h，取50 μ L菌液于含Kan抗生素的 MM固體平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)獲得單菌落；(5)挑取單菌落MM液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，堿裂解法提取質(zhì)粒；(6)以提取的質(zhì)粒DNA為模板，以r0/B、r^C和attacin基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲 得相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，證明pCAMBIA2300-attacin成功轉(zhuǎn)化至發(fā)根農(nóng)桿菌A4 ；隨機(jī)挑取的30 個(gè)單菌落(約總數(shù)的1/6)，均為陽性克隆。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌的三親雜交方法，其特征在于步驟(2)和 (3)中，三種菌分別培養(yǎng)至0D600 ^ 0. 6時(shí)取菌液，洗滌后共培養(yǎng)2 3 h獲得最大的轉(zhuǎn)化效 率。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌的三親雜交方法。其技術(shù)要點(diǎn)在于供體菌、受體菌和輔助菌三類菌株中，供體菌和輔助菌菌株為營養(yǎng)缺陷型并帶有抗性標(biāo)記，受體菌為野生型發(fā)根農(nóng)桿菌，以缺陷型培養(yǎng)基加相應(yīng)抗生素作篩選標(biāo)記進(jìn)行三親雜交，完成基因向野生型發(fā)根農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化。本方法操作簡單，轉(zhuǎn)化效率高，突破了野生型發(fā)根農(nóng)桿菌沒有染色體抗性標(biāo)記不能應(yīng)用三親雜交轉(zhuǎn)化的局限，改變了野生型發(fā)根農(nóng)桿菌只能使用電轉(zhuǎn)化或化學(xué)方法制備感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化、操作復(fù)雜、轉(zhuǎn)化效率低的局面，將大大加快發(fā)根農(nóng)桿菌在植物轉(zhuǎn)基因工程的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101914521SQ20101025793
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月20日
發(fā)明者孔衛(wèi)青, 楊金宏 申請人:安康學(xué)院