專利名稱：一種檢測傘狀犁頭霉的dna探針、基因芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測傘狀犁頭霉的DNA探針、基因芯片 及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
侵襲性真菌感染是真菌入侵人體而導(dǎo)致血液感染、各個(gè)臟器感染或全身播散的嚴(yán) 重感染。近20年來侵襲性真菌感染的發(fā)病呈明顯增長趨勢，這與大量應(yīng)用廣譜抗生素、抗 癌放療、化療以及其他免疫抑制劑、類固醇藥物、器官移植、靜脈插管和各種侵襲性操作有關(guān)。侵襲性真菌感染主要的致病真菌有念珠菌屬、曲霉屬、隱球菌屬等條件致病真菌， 還有組織胞漿菌、皮炎芽生菌、孢子絲菌等地方流行性致病真菌。不同環(huán)境下，感染的真菌 種類不同。侵襲性真菌感染早期沒有特異性表現(xiàn)，所以很容易被掩蓋，病死率很高。目前臨床常用的檢測真菌的技術(shù)主要有(一 )鏡檢及培養(yǎng)、鑒定如六胺銀染色、PAS染色、銀氨G-S染色法、10% KOH法 以及真菌培養(yǎng)法是臨床最常用的鑒定手段，但直接鏡檢特異性差、敏感性不足，不能鑒定出 真菌種類。真菌培養(yǎng)雖能鑒定真菌種類，但培養(yǎng)條件苛刻，培養(yǎng)時(shí)間長，假陰性高，敏感性不 足，無法輔助臨床治療。(二)免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法的基本原理是利用抗原與抗體的特異結(jié)合，來達(dá)到 相互間的特異探察。該法主要用于檢測真菌的抗原、抗體、代謝產(chǎn)物及細(xì)胞成分。能根據(jù)真 菌抗原性的不同將真菌分類。但抗體的特異性限制了該項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展。免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫印跡法及凝集反應(yīng)都是基于免疫學(xué)方法檢測 真菌的手段，但目前廣泛應(yīng)用于臨床的僅有G試驗(yàn)，G試驗(yàn)檢測的是真菌的細(xì)胞壁成分(1， 3) - β -D-葡聚糖，人體的吞噬細(xì)胞吞噬真菌后，能持續(xù)釋放該物質(zhì)，使血液及體液中含量 增高(淺部真菌感染無類似現(xiàn)象)。適用于除隱球菌和接合菌外的所有深部真菌感染的早 期診斷，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能確定菌種。臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)有諸多假陽性可能，例 如(1)使用纖維素膜進(jìn)行血透標(biāo)本或患者暴露于紗布或其他含有葡聚糖的材料；(2)靜脈輸注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品；(3)鏈球菌血癥；(4)操作者處理標(biāo)本時(shí)存在污染。另外，使用多糖類抗癌藥物、放化療造成的粘膜損傷導(dǎo)致食物中的葡聚糖或定植 的念珠菌經(jīng)胃腸道進(jìn)入血液等也可能造成假陽性。(三)分子生物學(xué)技術(shù)包括原位雜交、聚合酶鏈反應(yīng)、DNA中G+C mol %含量測定、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA(RAPD)分析、限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析(RFLP)等，但上述技術(shù)均耗時(shí)耗力，不具有高通 量的特點(diǎn)，不能用少量的樣本快速同時(shí)檢測多種可能存在的真菌，因此多局限于實(shí)驗(yàn)室研究，尚不能真正應(yīng)用于臨床。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測傘狀犁頭霉的DNA探針，具有SEQID No. 1所示序 列，其與傘狀犁頭霉DNA特異性結(jié)合，檢測傘狀犁頭霉靈敏度高。本發(fā)明所述DNA探針可廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如與以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的核 酸雜交技術(shù)結(jié)合，進(jìn)行生物學(xué)分析或臨床診斷。本發(fā)明結(jié)合基因芯片技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)小樣本、高通量、特異、快速、自動(dòng)化檢測傘狀犁 頭霉的目的。本發(fā)明提供的一種用于真菌檢測的基因芯片，通過將特異性寡核苷酸探針固 定在固相載體表面形成，所述寡核苷酸探針包含具有SEQ ID No. 1所示序列的DNA探針。探 針、引物與真菌目的基因之間的關(guān)系如表1所示。表1.本發(fā)明所述基因芯片所使用的引物及探針引物 探針靶區(qū)域GenBank 加入碼堿基序列(5，—3，)ACOR傘狀犁頭霉FJ444944TAAGAGAAGACCTTAAGTTAGGCCAACa SEQ ID No. I 所示)ITSl18SrRNA通用引 物 5’ primerAF455531TCCGTAGGTGAACCTGCGG ( SEQ ID No.2 所示)ITS428SrRNA通用引 物 3，primerL28817TCCTCCGCTTATTGATATGC ( SEQ ID No.3 所示)作為優(yōu)選，所述固相載體選自硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片、微 粒和塑料片。本發(fā)明的基因芯片所采用的固相載體選自任何可用于制備基因芯片的材料，包括 但不限于硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚丙乙烯、玻璃片、硅片、微粒和塑料片。所述的固相載體 經(jīng)不同的化學(xué)修飾后，在其表面帶有可以固定核酸分子的活性基團(tuán)，這些基團(tuán)包括但不限 于氨基(-NH2)、醛基(-CH0)、羧基(-C00H)和巰基(-SH)。本發(fā)明所述基因芯片在所述固相載體上連接針對傘狀犁頭霉的特異性核酸探針， 所述探針可以為單鏈或雙鏈DNA分子，其在適當(dāng)?shù)臈l件下可以與傘狀犁頭霉基因特異性雜 交。所述探針可以通過DNA自動(dòng)合成或PCR擴(kuò)增而獲得。所述探針在其與載體連接的一端 可以選擇性地添加一個(gè)目的在于增加探針的空間活動(dòng)性以利于雜交的連接臂。本發(fā)明所述基因芯片的制備，是將所述核酸探針有序地點(diǎn)樣到載體上，通過核酸 探針末端修飾的活性基團(tuán)與載體表面相應(yīng)的活性基團(tuán)反應(yīng)，形成共價(jià)連接，將探針固定于 載體上，從而制成基因芯片。同時(shí)，在本發(fā)明所述基因芯片上，按序與不同樣品雜交后，通過 對所捕獲陽性信號的尋址即可明確對應(yīng)的樣品中是否有傘狀犁頭霉的存在。作為優(yōu)選，所述固相載體表面還固定有陽性對照探針、陰性對照探針。更優(yōu)選地，所述陽性對照探針其序列如SEQ ID No. 4所示，其與陽性對照樣品特異性結(jié)合，陽性對照樣品片段序列如SEQ ID No. 6所示，其中與陽性對照探針結(jié)合部位的序列 為 CCCATGGGTCTTGTCTGGA。更優(yōu)選地，所述陰性對照探針，其序列如SEQ ID No. 5所示。本發(fā)明還提供一種用于檢測傘狀犁頭霉的試劑盒，包含與傘狀犁頭霉特異性結(jié) 合的探針，所述探針具有序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列中。本發(fā)明所述試劑盒優(yōu) 選還包含用于對真菌基因擴(kuò)增的引物，其具有序列表SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3所示的 序列。本發(fā)明還提供一種對可能含傘狀犁頭霉的樣品進(jìn)行檢測的方法，包含以下步驟步驟1 提取并擴(kuò)增樣品的核酸序列，所述擴(kuò)增將信標(biāo)分子標(biāo)記到擴(kuò)增產(chǎn)物；步驟2 取步驟1所得擴(kuò)增產(chǎn)物與固定于所述基因芯片上的探針進(jìn)行雜交；步驟3 根據(jù)所述信標(biāo)分子采用相應(yīng)的檢測方法對基因芯片進(jìn)行掃描分析。作為優(yōu)選，步驟1擴(kuò)增步驟所用的5’引物為真菌ISSrRNA通用引物，具有序列表 SEQ ID No. 2所示序列，3，引物為真菌28SrRNA通用引物，具有SEQ ID No. 3所示的序列。在所述的樣品標(biāo)記過程中，可以利用本領(lǐng)域已知各種核酸標(biāo)記方法使標(biāo)本中的目 的基因標(biāo)記信標(biāo)分子，所述方法包括但不限于，PCR、RT-PCR、體外轉(zhuǎn)錄、隨機(jī)引物標(biāo)記、缺口 平移以及末端轉(zhuǎn)移標(biāo)記等方法。所述信標(biāo)分子可以為熒光素或同位素；所述熒光素包括但 不限于，Cy3, Cy5、異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅；所述同位素包括但不限于32P。在適當(dāng)?shù)臏囟群碗x子強(qiáng)度條件下，將所述標(biāo)記產(chǎn)物與本發(fā)明所述基因芯片進(jìn)行雜 交。雜交條件和方法是本領(lǐng)域已知的。雜交后，根據(jù)所選用的信標(biāo)分子采用相應(yīng)的檢測方 法對基因芯片進(jìn)行掃描分析，根據(jù)所捕獲的陽性信號尋址，判斷所述標(biāo)本中是否含有傘狀 犁頭霉。本發(fā)明采用傘狀犁頭霉特異性寡核苷酸作為探針，在真菌檢測過程中利用真菌通 用引物對樣品中真菌基因擴(kuò)增進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明所述基因芯片連接的探針和擴(kuò)增所用的真 菌通用引物列于表1中。需要說明的是，本發(fā)明所采用的寡核苷酸探針和真菌通用引物也 可以用于對目的基因的普通PCR擴(kuò)增，而擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物同樣可以作為探針按照所述方法 制備真菌檢測基因芯片，因此所述PCR產(chǎn)物作為探針?biāo)苽涞幕蛐酒苍诒景l(fā)明的保護(hù) 范圍之內(nèi)。分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于真菌研究已顯示出多方面的優(yōu)點(diǎn)，醫(yī)學(xué)真菌研究已逐漸形 成了以基因分析為基礎(chǔ)的鑒定和分類系統(tǒng)。我們基于分子生物學(xué)技術(shù)，利用芯片的高通量 平臺，設(shè)計(jì)完善了基于基因芯片特異性診斷傘狀犁頭霉感染的技術(shù)。本發(fā)明所述DNA探針特異性強(qiáng)，靈敏度高，樣品中含有2-3CFU以上傘狀犁頭霉經(jīng) 檢測即可見陽性信號，傘狀犁頭霉PCR產(chǎn)物達(dá)0. 04ng以上即可被檢測出來。本發(fā)明所述基因芯片以及利用所述基因芯片進(jìn)行樣品檢測的方法所需樣本量少， 反應(yīng)體積小，試劑消耗少，可實(shí)現(xiàn)樣品的高通量、自動(dòng)化及快速檢測，分析過程客觀，特異性 強(qiáng)，通過本方法檢測出的結(jié)果與分離培養(yǎng)或測序比對結(jié)果的一致率達(dá)100%，保證了檢測結(jié) 果的精確性，適于應(yīng)用于臨床。


圖1示本發(fā)明所述基因芯片與傘狀犁頭霉菌株雜交的檢測結(jié)果；
圖2示不同數(shù)量傘狀犁頭霉孢子提取的DNA與本發(fā)明所述基因芯片雜交的檢測結(jié) 果；圖3示不同劑量傘狀犁頭霉PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種檢測傘狀犁頭霉的DNA探針、基因芯片及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改 動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品及應(yīng) 用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi) 對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。實(shí)施例1 :DNA的提取可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行提取，樣本可以為新鮮組織、血液、尿液、腦脊液、分泌 物(痰液、胸水、腹水、肺泡灌洗液等)等。在本實(shí)施例中使用Qiagen微量DNA提取試劑盒， 以新鮮組織為例(1)將新鮮組織放入高溫滅菌的研缽中，倒入液氮后研碎，將研碎的組織移入 1. 5ml的EP管中；(2)加入Iml生理鹽水沖洗，離心3000rpm 5min,棄上清；(3)加入 200 μ 1 Na0H(50mM)，95°C孵育 lOmin，離心 5000rpml0min，棄上清；(4)加入 500 μ 1 Lyticase 溶壁酶溶液，37°C孵育 30min ；(5)離心 14000rpm lOmin，棄上清；(6)迅速加 180 μ 1 ATL 禾口 20 μ 1 蛋白酶 K 55°C 15min ；(7)加 100 μ 1 AL，震蕩 15s.充分混勻。70°C IOmin (100 μ 1 AL 緩沖液中加 1 μ g 載體RNA)；(8) 50 μ 1 乙醇(96-100% )震蕩 15s.室溫 5min(15_25°C )；(9)短暫離心；(10)小心將所有溶胞產(chǎn)物移至柱，避免沾濕管壁，移液器勿觸及膜，離心 6000g(SOOOrpm) lmin.將柱子放進(jìn)2ml收集管，棄收集管。若溶胞產(chǎn)物未完全通過膜，再次用更高轉(zhuǎn)速離心直至柱子空；(11)往柱子里加500 μ 1 AWl (搖勻)，避免沾濕管壁。離心6000g (8000rpm) lmin.將柱子放進(jìn)2ml收集管，棄收集管；(12)往柱子里加500 μ 1 AW2，避免沾濕管壁。離心6000g(8000rpm) lmin.將柱子 放進(jìn)2ml收集管，棄收集管；(13) 14，OOOrpm, 3min使膜完全干燥，確保沒有乙醇；(14)將柱子置于1. 5ml離心管，棄收集管。加20-100 μ 1 AE蒸餾水(PH大于7)于膜中央。(15)室溫(15-25 "C ) lmin.(16)將柱子置于收集管上，20，OOOg(14, OOOrpm)離心lmin，將收集管內(nèi)液體保存
實(shí)施例2 樣品的PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)總體積為25μ 1，含模板DNA(傘狀犁頭霉，黃曲霉，煙曲 霉，黑曲霉，土曲霉，構(gòu)巢曲霉，乳酒念珠菌，皺褶念珠菌，阿薩希毛孢子菌，少根根霉，小孢 根霉，微小根毛霉，白念珠菌，克柔念珠菌，光滑念珠菌，熱帶念珠菌，近平滑念珠菌，季也蒙 念珠菌，都柏林念珠菌或新生隱球菌DNA) 5 μ 1，10XBuffer2. 5 μ 1，2. 5mM dNTP 1. 25 μ 1, 25mM MgCl2 3 μ 1，引物 ITS 1、ITS4 50pmol 各 0· 25 μ l，Hotstart Taq 酶(5U/μ 1) 0· 1 μ 1， 補(bǔ)超純水至25 μ 1。PCR反應(yīng)條件95°C 15分鐘，擴(kuò)增變性、退火、延伸的條件分別為94°C變性30秒， 60°C退火30秒，72°C延伸1分鐘，；35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。取8μ1 PCR產(chǎn)物于 1. 5%的瓊脂糖中電泳30分鐘，電泳后染色30分鐘，于凝膠成像系統(tǒng)照相。剩余的PCR產(chǎn) 物用于雜交(5 μ 1 PCR產(chǎn)物即可)。實(shí)施例3 探針的標(biāo)記以及基因芯片的制備(1)用0. 5Μ NaHCO3(PH 8. 4)稀釋本發(fā)明所述探針至適宜濃度，取4ul探針溶液 入微孔板中，每孔加入4ul點(diǎn)樣液，充分混勻，空白對照為等量上述NaHCO3與點(diǎn)樣液的混合 液。(2)將BiodyneC尼龍膜裁剪至合適大小。(3)室溫下，16% w/v EDAC 孵育 Biodyne C 尼龍膜 10 分鐘。(4)去離子水漂洗Biodyne C尼龍膜1分鐘。(5)用濾紙吸干尼龍膜。(6)用點(diǎn)樣儀取探針溶液及空白對照溶液點(diǎn)樣于制備好的尼龍膜上。(7)室溫下孵育5分鐘。(8)吸除尼龍膜表面液體，將尼龍膜放入0. IM NaOH液中滅活9分鐘。(9)在搖床中用100ml 2 X SSPE漂洗Biodyne C尼龍膜5分鐘。(10)在搖床中用60°C 2XSSPE/0. 5% SDS液漂洗Biodyne C尼龍膜5分鐘。(11)于室溫下在搖床中用200ml 20mM EDTA液清洗Biodyne C尼龍膜20分鐘。(12)將Biodyne C尼龍膜放入潔凈的塑料袋中，并加入IOml的EDTA，密封保存于 4°C冰箱中，備用。實(shí)施例4 利用本發(fā)明所述探針進(jìn)行樣品的檢測使用鏈親和素-過氧化物酶(RocheDiagnostics Co.)用 2 X SSPE (SSPE is 0. 18M NaCl，IOmM NaH2PO4, ^P ImM EDTA[pH 7. 7]_0. 5% SDS) 1 4，000 稀釋；雜交溫度為 60°C;膠 片(Hyperfilm ；Amersham)的曝光時(shí)間為2分鐘。具體步驟如下(1)取5 μ 1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、與1 μ 1陽性對照片段(序列如SEQ IDNo. 6所示)樣 本同時(shí)加入150 μ 1 2XSSPE/0. 1% SDS混勻，加入EP管中。(2) 99°C加熱10分鐘，然后將EP管迅速放置于冰上至少5分鐘。(3)在雜交箱中用250ml 60°C的2XSSPE/0. 1% SDS液體搖動(dòng)漂洗已標(biāo)記了探針 的Biodyne C尼龍膜5分鐘。(4)吸除尼龍膜表面液體。(5)用自制模具加入經(jīng)2 X SSPE/0. 1 % SDS溶液稀釋后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物150 μ 1于對應(yīng)位置。(6)在雜交箱中，60°C雜交60分鐘。
(7)用250ml 60°C 2XSSPE/0. 5% SDS溶液于搖床中洗Biodyne C尼龍膜兩次，每 次10分鐘。(8)加入15ml 2XSSPE/0. 5% SDS和1/5000鏈親和素-過氧化物酶結(jié)合物混合液，42 °C孵育45分鐘。(9)用250ml 42°C 2X SSPE/0. 5% SDS液于搖床中洗Biodyne C尼龍膜兩次，每次 10分鐘。(10)室溫下用250ml 2 X SSPE液在搖床中洗Biodyne C尼龍膜兩次，每次5分鐘。(11)加入20ml ECL顯影劑于Biodyne C尼龍膜上，室溫孵育1分鐘。(12)將Biodyne C尼龍膜放入暗盒中。(13)在暗盒中放入X光片，曝光，洗片，觀察結(jié)果。(14)將Biodyne C尼龍膜用80°C 250ml 1 % SDS液搖動(dòng)漂洗兩次，每次30分鐘。(15)再用200ml 20mM EDTA液于搖床中清洗Biodyne C尼龍膜15分鐘。(16)將Biodyne C尼龍膜放入潔凈的塑料袋中，并加入IOml的EDTA，密封4°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例5:結(jié)果的判定在探針對應(yīng)的底片位置上，出現(xiàn)黑點(diǎn)，表示結(jié)果為陽性。無黑點(diǎn)，表示結(jié)果為陰性。圖1示按照實(shí)施例1-4制備的標(biāo)記了本發(fā)明探針的基因芯片雜交結(jié)果?；蛐酒?上標(biāo)記的探針的順序?yàn)?陽性對照(如SEQ ID No. 4所示)，2陰性對照(如SEQ ID No. 5 所示)，3空白對照，4-23本發(fā)明所述探針；菌株P(guān)CR產(chǎn)物雜交順序1-4傘狀犁頭霉，5煙曲霉，6黃曲霉，7黑曲霉，8 土曲霉， 9構(gòu)巢曲霉，10乳酒念珠菌，11皺褶念珠菌，12阿薩希毛孢子菌，13少根根霉，14小孢根霉， 15微小根毛霉，16白念珠菌，17克柔念珠菌，18光滑念珠菌，19熱帶念珠菌，20近平滑念珠 菌，21季也蒙念珠菌，22都柏林念珠菌，23新生隱球菌。從圖1可見，本發(fā)明所述特異性探針僅僅與傘狀犁頭霉的PCR產(chǎn)物雜交，未與其它 真菌PCR產(chǎn)物發(fā)生非特異性雜交，證實(shí)其與傘狀犁頭霉結(jié)合特異性強(qiáng)。實(shí)施例6 靈敏度及重復(fù)性檢測不同數(shù)量傘狀犁頭霉孢子提取DNA后，經(jīng)本發(fā)明所述基因芯片檢測，結(jié)果如 圖 2 所示，1-2. 5ng(相當(dāng)于 100CFU)，2-l. 25ng(相當(dāng)于 50CFU)，3-0. 63ng(相當(dāng)于 25CFU)，4-0. 3 Ing (相當(dāng)于 12. 5CFU)，5-0. 15ng (相當(dāng)于 6CFU)，6-0. 08ng (相當(dāng)于 3CFU)， 7-0. 04ng (相當(dāng)于 1. 5CFU)，8-0. 02ng (相當(dāng)于 0. 75CFU)，9-0. 0 Ing (相當(dāng)于 0. 4CFU)。取不同劑量傘狀犁頭霉PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示。Marker 為 750bp、500bp，C 為陰性對照，1-1 X 103ng，2_500ng，3_250ng，4_50ng，5_5ng，6-0. 5ng, 7-0. 05ng,8-5X10」ngo以上結(jié)果說明，樣品中含有2-3CFU以上傘狀犁頭霉經(jīng)檢測即可見陽性信號；真菌 PCR產(chǎn)物達(dá)0. 04ng以上即可被檢測出來。而利用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物時(shí)，至少要 5ng以上PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳方可見肉眼所見條帶。說明本發(fā)明所述檢測方案的敏感性明顯 高于單純PCR檢測。重復(fù)性檢測本發(fā)明具有良好的重復(fù)性，取10份陽性傘狀犁頭霉進(jìn)行重復(fù)檢測， 陽性率達(dá)100%。
實(shí)施例8 臨床分離菌株檢測結(jié)果檢測自臨床標(biāo)本中分離培養(yǎng)的菌株，利用本發(fā)明所述基因芯片檢測出的結(jié)果經(jīng)分 離培養(yǎng)或測序比對驗(yàn)證，其檢測結(jié)果一致率達(dá)100 %，結(jié)果見表2。表2.本發(fā)明所述方法進(jìn)行臨床病例檢測
權(quán)利要求
1.一種用于檢測傘狀犁頭霉的DNA探針，具有SEQ ID No. 1所示序列。
2.一種用于傘狀犁頭霉檢測的基因芯片，通過將寡核苷酸探針固定在固相載體表面形 成，其特征在于，所述寡核苷酸探針包含權(quán)利要求1所述DNA探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因芯片，其特征在于，所述固相載體選自硝酸纖維素膜、尼 龍膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片、微粒和塑料片。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的基因芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探針還包括陽性對 照探針、陰性對照探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所述陽性對照探針如SEQID No. 4所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所述陰性對照探針如SEQID No. 5所示
7.一種用于檢測傘狀犁頭霉的試劑盒，包含權(quán)利要求1所述DNA探針。
8.一種對可能含傘狀犁頭霉的樣品進(jìn)行檢測的方法，包含以下步驟步驟1 提取并擴(kuò)增樣品的核酸序列，所述擴(kuò)增將信標(biāo)分子標(biāo)記到擴(kuò)增產(chǎn)物； 步驟2 取步驟1所得擴(kuò)增產(chǎn)物與固定于權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)所述基因芯片上的探針 進(jìn)行雜交；步驟3 根據(jù)所述信標(biāo)分子采用相應(yīng)的檢測方法對基因芯片進(jìn)行掃描分析。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟1所述擴(kuò)增步驟的引物具有序列表 SEQ ID No. 2 或 SEQ ID No. 3 所示的序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述信標(biāo)分子可以為熒光素或同位素， 所述熒光素包括Cy3、Cy5、異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅；所述同位素包括32P。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種檢測傘狀犁頭霉的DNA探針。本發(fā)明所述檢測傘狀犁頭霉的DNA探針具有序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其檢測傘狀犁頭霉特異性強(qiáng)，靈敏度高達(dá)0.04ng。本發(fā)明還提供包含所述DNA探針的基因芯片。采用本發(fā)明所述基因芯片可實(shí)現(xiàn)對可能含傘狀犁頭霉的樣品的高通量、自動(dòng)化及快速檢測，特異性強(qiáng)，可保證檢測結(jié)果的精確性，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/11GK102041304SQ20101025796
公開日2011年5月4日 申請日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月18日
發(fā)明者李國輝 申請人:李國輝