專利名稱：一種溶水性vi人膠原蛋白多肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種溶水性VI型人膠原蛋白多肽的制備方法，具體涉及通過基因工 程制備一種溶水性VI型人膠原蛋白多肽的方法。
背景技術(shù)：
膠原蛋白是結(jié)締組織結(jié)構(gòu)中極其重要的蛋白。在人體中主要存在于皮膚、骨、軟 骨、牙齒、肌鍵、韌帶和血管中，由于膠原蛋白固有的生物相容性、生物可降解性以及促進細 胞生長等功能，使其在醫(yī)藥、美容、化妝品、食品等領(lǐng)域的用途不斷拓大。當(dāng)前生產(chǎn)膠原蛋白主要的方法是利用酸、堿水解法從動物結(jié)締組織(豬皮、牛皮、 驢皮、魚皮等)中提取，而且提取過程中易喪失部分生物活性，提取的產(chǎn)品成份也非常復(fù) 雜，也有很多病毒隱患，從而極大地限制了膠原蛋白在醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用?？茖W(xué)家 們曾想法從人胎盤中獲取膠原蛋白，但是，該研究受到世界人權(quán)組織及FDA的阻止。其次， 利用化學(xué)法合成的膠原蛋白往往不具有生物活性結(jié)構(gòu)，并且技術(shù)較為復(fù)雜，成本較高。為了能充分利用膠原蛋白的優(yōu)良性能，并避免動物源的病毒高風(fēng)險，諸多學(xué)者利 用基因工程技術(shù)，選用各種宿主細胞，如轉(zhuǎn)基因鼠、昆蟲、轉(zhuǎn)基因蠶、轉(zhuǎn)基因煙草、大腸桿菌、 酵母等生產(chǎn)重組人膠原蛋白，其膠原蛋白產(chǎn)品具有安全性好、重現(xiàn)性好、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點， 解決了傳統(tǒng)提取方法存在的如瘋牛病阮病毒隱患等缺點，同時也改善了膠原蛋白的親水 性、免疫排斥性等?？梢娎没蚬こ碳夹g(shù)生產(chǎn)重組膠原蛋白是近幾年來該方面的熱點研 究領(lǐng)域。目前人膠原蛋白的生產(chǎn)主要集中在I型、II型、III型和IV型，對于VI型膠原 蛋白報道僅限于其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等方面的研究。VI型膠原蛋白是Chimg等于1976年從人 大動脈的胃蛋白酶水解物中首次發(fā)現(xiàn)，其顯著特征是分子量大，半胱氨酸含量高[1]。有研 究表明，VI型膠原蛋白的mRNA水平在皮膚的松弛成纖維細胞系中表達量會提高，VI型膠 原蛋白可能與皮膚松弛的變化有關(guān) 。Furuto和Miller從胎盤組織中分離了 VI型膠 原蛋白并對其結(jié)構(gòu)進行了初步描述 ]。目前，VI型人膠原蛋白的的生產(chǎn)未見有報道，胎 盤組織方法由于病原微生物的易感染及低提取率和原料的不易獲得大大限制了膠原蛋白 的大規(guī)模制備。(參考文獻[1].將挺大，張春萍。膠原蛋白Μ北京化學(xué)工業(yè)出版社， 2001[2]· AtsushiHatamochi,Masami Arakawa,Kenichi Mori,Yasuji Mori,Hiroaki Ueki, Hidekatsu Yoshiokab. Increased expression of type VI collagen genesin cutis Iaxa fibroblasts. Journal of Dermatological Science 11 (1996) 97—103 [3]王榮春，徐德昌， 膠原蛋白與VI型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)概述，生物信息學(xué)2004，4，30-34)

發(fā)明內(nèi)容
為了解決VI型人膠原蛋白現(xiàn)有制備技術(shù)存在的問題，本發(fā)明旨在提供一種溶水 性VI型人膠原蛋白多肽的制備方法，采用基因工程技術(shù)制備溶水性VI型人膠原蛋白多肽， 包括將溶水性VI型人膠原蛋白多肽編碼基因連入表達載體；重組表達載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌宿主細胞構(gòu)建工程菌；誘導(dǎo)工程菌表達含有VI型人膠原多肽的蛋白產(chǎn)物；分別建立大腸肝 菌工程菌發(fā)酵及目的蛋白純化工藝。本發(fā)明通過如下方法實現(xiàn)I.以含有人C0LVIA2 mRNA基因序列的質(zhì)粒pCMV_SP0RT6為模板，應(yīng)用PCR克隆出 溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因(1)從含有質(zhì)粒pCMV-SP0RT6的大腸桿菌中制備質(zhì)粒DNA 遵循Omega公司的質(zhì)粒 提取試劑盒的說明書來提取制備。(2)根據(jù)基因庫編號BC065509. 1的人類膠原蛋白VIA2型全長mRNA序列，設(shè)計帶 酶切位點ECORI，SalI的上下游引物如下Pl C0L6A2EC0RI 為 5’ atcGAATTCGGCAACAAAGGAGCCAAG3‘P2 C0L6A2SalI 為 5’ atcGTCGACGTTCTTGACAGCCTCCTT3，PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min ；94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 共30個循環(huán)，72°C再延伸7min。PCR 反應(yīng)體系為5XPS buffer 10 μ L ；dNTP 2 μ L，其中，dATP、dGTP、dTTP、 dCTP的濃度均為2. 5mM ;P1 1 μ L，其濃度為10 μ M ;P2 1 μ L，其濃度為10 μ M ;Taq DNA polymerase 2U ；C0LVIA2 mRNA200ng ；加水至反應(yīng)總體積為 50 μ L。其中，iTaq DNA Polymerase簡稱Taq酶，是TAKARA的DNA聚合酶；dNTP為三磷酸 脫氧核糖核苷，包括dATP，dGTP, dTTP, dCTP ；所用試劑為TAKARA的DNA Polymerase試劑盒里的試劑。經(jīng)PCR獲得目的基因，用1.2% (g/mL)濃度的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并分離，利用 DNA凝膠回收試劑盒純化后得到溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因。上述含有人C0LVIA2 mRNA氨基酸序列的質(zhì)粒pCMV_SP0RT6為-80 V條件下保存；克隆得到的溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因序列如下GGCAACAAAGGAGCCAAGGGAGACCGAGGCTTGCCTGGACCCAGAGGCCCCCAGGGAGCTCTTGGGGAG CCCGGAAAGCAGGGATCTCGGGGAGACCCCGGTGATGCAGGACCCCGTGGAGACTCAGGACAGCCAGGCCCCAAGGG AGACCCCGGCAGGCCTGGATTCAGCTACCCAGGACCCCGAGGAGCACCCGGAGAAAAAGGCGAGCCCGGCCCACGCG GCCCCGAGGGAGGCCGAGGCGACTTTGGCTTGAAAGGAGAACCTGGGAGGAAAGGAGAGAAAGGAGAGCCTGCGGAT CCTGGTCCCCCTGGTGAGCCAGGCCCTCGGGGGCCAAGAGGAGTCCCAGGACCCGAGGGTGAGCCCGGCCCCCCTGG AGACCCCGGTCTCACGGAGTGTGACGTCATGACCTACGTGAGGGAGACCTGCGGGTGCTGCGACTGTGAGAAGCGCT GTGGCGCCCTGGACGTGGTCTTCGTCATCGACAGCTCCGAGAGCATTGGGTACACCAACTTCACACTGGAGAAGAAC TTCGTCATCAACGTGGTCAACAGGCTGGGTGCCATCGCTAAGGACCCCAAGTCCGAGACAGGGACGCGTGTGGGCGT GGTGCAGTACAGCCACGAGGGCACCTTTGAGGCCATCCAGCTGGACGACGAACGTATCGACTCCCTGTCGAGCTTCA AGGAGGCTGTCAAGAACII.將克隆得到的溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因經(jīng)過ECORI和MlI限制 性酶處理后并連入表達質(zhì)粒pET-32a，獲得重組載體(1)用Omega公司的質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒載體pET_32a，用限性內(nèi)切酶ECORI 和分別對純化好的溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因和質(zhì)粒載體PET-3M進行雙 酶切。溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因雙酶切反應(yīng)體系是溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因 30 μ L，10XPS buffer 5 μ L, EC0RI2. 5 μ L, Sail 2. 5 μ L, ddH20 10 μ L，總 體積50μ L，37°C酶切5h。質(zhì)粒載體雙酶切反應(yīng)體系是pET_3h30 μ L，10 X PS buffer5 μ L, ECORI 2. 5 μ L，Sail 2. 5 μ L, ddH20 10 μ L，總體積 50 μ L，37°C酶切 5h。反應(yīng)結(jié)束，用Omega純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物，分別用20mL的(MH2O回溶。(2)將克隆得到的溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因與質(zhì)粒pET-3h連接，用 TAKARA的E. coli DNA Ligase連接酶在16°C水浴中反應(yīng)1至3h，得到重組載體。III.將重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌宿主菌中篩選陽性克隆和測序鑒定將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，轉(zhuǎn)化方法如下將重組載體15 μ L加 入到大腸桿菌DH5a感受態(tài)菌111^中，混勻，冰浴301^11 ；然后42°C熱休克90s，再迅速轉(zhuǎn)移 至冰上2min，然后升溫至37°C ；將反應(yīng)菌液涂在含有氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，恒溫 37°C條件下培養(yǎng)8小時；挑選陽性克隆至含有氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200rmp 過夜培養(yǎng)；然后提取質(zhì)粒，送測序公司進行測序，測序結(jié)果分析顯示，插入片段的氨基酸序 列與Genebank上收錄的C0LVIA2 mRNA氨基酸序列完全一致。IV.轉(zhuǎn)染大腸桿菌宿主細胞后誘導(dǎo)表達和分析取測序后正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21 (DE3)，涂布含有氨芐的LB固體培 養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)8h，隨機挑取單菌落轉(zhuǎn)至氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D600為 0. 6 0. 7時，加異丙基硫代β -半乳糖苷至終濃度為lmmol/L，下誘導(dǎo)幾后收集菌液 進行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果表明在相對分子量46kDa處有明顯特異性條帶，與預(yù)期的VI 型人膠原蛋白多肽相對分子量相符，并且該蛋白為水溶性蛋白。VI型人膠原蛋白多肽序列如下GNK GAK GDR GLP GPR GPQ GAL GEP GKQ GSR GDP GDA GPR GDS GQP GPKGDP GRP GFS YPG PRG APG EKG EPG PRG PEG GRG DFG LKG EPG RKG EKGEPA DPG PPG EPG PRG PRG VPG PEG EPG PPG DPG LTE CDV MTY VRE TCGCCG SEV SPV PPD DPA TPP DCE KRC GAL DVV FVI DSS ESI GYT NFT LEKNFV INV VNR LGA IAK DPK SET GTR VGV VQY SHE GTF EAI QLD DER IDSLSS FKE AVK N所述的VI型人膠原蛋白多肽，其分子量為46kDa，氨基酸組成為250個，線性多肽單鏈。V.重組表達載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌宿主細胞后得到工程菌，工程菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條 件培養(yǎng)基成份為酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH6. 5-7. 0。培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度37°C，pH 6. 8，轉(zhuǎn)速為150r/min，接種量為每IOOmL的LB液 體培養(yǎng)基接種4mL菌液，氨芐青霉素(ampicillin) 100 μ g/mL，培養(yǎng)至0D600為0. 6 0. 7 時，加異丙基硫代β-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為lmmol/L，條件下誘導(dǎo)幾后收集菌液。VI.水溶性VI型人膠原蛋白多肽的純化條件(1)把步驟V收集的菌液，按每IOOmL培養(yǎng)基所得菌體加入4mL緩沖液，緩沖液與 培養(yǎng)基的體積比為1 25，重懸于冰浴預(yù)冷的IX結(jié)合緩沖液，將重懸菌液進行超聲波破碎。(2)在13000r/min條件下，4°C離心20分鐘，上清為澄清的細胞粗提物。蛋白電泳 顯示VI型人膠原多肽的蛋白溶于上清液中，該粗提物經(jīng)鎳柱親和層析，然后冷凍干燥，收 集水溶性VI型人膠原蛋白多肽。純化所用的緩沖液為Novagen公司Ni-NTA緩沖液試劑盒(Ni-NTABuffer Kit)提{共。VII.用免疫印跡法分析純化的可溶性VI型人膠原蛋白多肽的特異性取純化后的可溶性VI型人膠原蛋白多肽，進行Wfestern-blotting檢測，結(jié)果如圖 4，在46KDa處左右出現(xiàn)一條蛋白染色帶，證明VI型人膠原蛋白多肽得到表達，且具有良好 的特異性和免疫反應(yīng)性。有益效果本發(fā)明將VI型人膠原蛋白多肽編碼基因連入克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸肝 菌，構(gòu)建工程菌，誘導(dǎo)工程菌表達VI型人膠原蛋白多肽，分別建立工程菌發(fā)酵和目的蛋白 純化工藝。經(jīng)過蛋白質(zhì)電泳分析和活性鑒定后，表明VI型人膠原蛋白多肽可溶于上清，具 有良好的水溶性；VI型人膠原蛋白多肽分子量為46KD，以單體或多聚物形式存在；在體外 能保護細胞免受紫外線傷害。


圖1為本發(fā)明的目的基因的電泳圖，M為marker ； 1為目的基因。圖2重組原核表達質(zhì)粒pET3h_C0L6A2的構(gòu)建示意圖。圖3為實施例的VI型人膠原蛋白多肽的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)圖。圖中M-蛋白質(zhì)marker 空白對照；2-誘導(dǎo)總液；3-誘導(dǎo)上清；4-誘導(dǎo) 沉淀；5誘導(dǎo)上清；6-誘導(dǎo)沉淀。圖4為實施例的VI型人膠原蛋白多肽的免疫印跡試驗(Western-Blotting)圖， 特異性條帶即為目的蛋白。
具體實施例方式實施例1 一種溶水性VI型人膠原蛋白多肽的制備方法I.以含有人C0LVIA2 mRNA基因序列的質(zhì)粒pCMV_SP0RT6為模板，應(yīng)用PCR克隆出 溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因(1)從含有質(zhì)粒pCMV-SP0RT6的大腸桿菌中制備質(zhì)粒DNA 遵循Omega公司的質(zhì)粒 提取試劑盒的說明書來提取制備；(2)根據(jù)基因庫(Genebank)編號BC065509. 1的人類膠原蛋白VIA2型(Human Collagen type VIA2 AccessionNumber :BC065509. 1)全長 mRNA 序列，設(shè)計帶酶切位點 ECORI, SalI的上下游引物如下C0L6A2EC0RI 為 5’ atcGAATTCGGCAACAAAGGAGCCAAG3 ‘C0L6A2SalI 為 5，atcGTCGACGTTCTTGACAGCCTCCTT3，PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min ；94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 共30個循環(huán)；72 °C再延伸7min。PCR 反應(yīng)體系為5XPS buffer 10 μ L ；dNTP 2 μ L，其中，dATP, dGTP, dTTP,dCTP的濃度均為2. 5mM ；Pll μ L,其濃度均為10 μ M ；Ρ21 μ L,其濃度均為10 μ Μ) ；Taq DNA polymerase 2U ；C0LVIA2 mRNA 200ng ；加水至反應(yīng)總體積為 50 μ L。其中，TaqDNA Polymerase 簡稱 Taq 酶，是 TAKARA 的 DNA 聚合酶；dNTP為三磷酸脫氧核糖核苷，包括dATP，dGTP，dTTP，dCTP ；所用試劑為TAKARA的DNA Polymerase試劑盒里的試劑。經(jīng)PCR獲得目的基因，用1.2% (g/mL)濃度的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并分離(如圖 1)，利用DNA凝膠回收試劑盒純化后得到溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因。上述含有人C0LVIA2 mRNA氨基酸序列的質(zhì)粒pCMV_SP0RT6為-80 V條件下保存；克隆得到的溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因序列如下GGCAACAAAGGAGCCAAGGGAGACCGAGGCTTGCCTGGACCCAGAGGCCCCCAGGGAGCTCTTGGGGAG CCCGGAAAGCAGGGATCTCGGGGAGACCCCGGTGATGCAGGACCCCGTGGAGACTCAGGACAGCCAGGCCCCAAGGG AGACCCCGGCAGGCCTGGATTCAGCTACCCAGGACCCCGAGGAGCACCCGGAGAAAAAGGCGAGCCCGGCCCACGCG GCCCCGAGGGAGGCCGAGGCGACTTTGGCTTGAAAGGAGAACCTGGGAGGAAAGGAGAGAAAGGAGAGCCTGCGGAT CCTGGTCCCCCTGGTGAGCCAGGCCCTCGGGGGCCAAGAGGAGTCCCAGGACCCGAGGGTGAGCCCGGCCCCCCTGG AGACCCCGGTCTCACGGAGTGTGACGTCATGACCTACGTGAGGGAGACCTGCGGGTGCTGCGACTGTGAGAAGCGCT GTGGCGCCCTGGACGTGGTCTTCGTCATCGACAGCTCCGAGAGCATTGGGTACACCAACTTCACACTGGAGAAGAAC TTCGTCATCAACGTGGTCAACAGGCTGGGTGCCATCGCTAAGGACCCCAAGTCCGAGACAGGGACGCGTGTGGGCGT GGTGCAGTACAGCCACGAGGGCACCTTTGAGGCCATCCAGCTGGACGACGAACGTATCGACTCCCTGTCGAGCTTCA AGGAGGCTGTCAAGAACII.將克隆得到的溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因經(jīng)過ECORI和MlI限制 性酶處理后并連入表達質(zhì)粒pET-32a，獲得重組載體(如圖2)(1)用Omega公司的質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒載體pET_32a，用限性內(nèi)切酶ECORI 和分別對純化好的溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因和質(zhì)粒載體PET-3M進行雙 酶切。溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因雙酶切反應(yīng)體系是溶水性VI型人膠原蛋 白多肽目的基因 30 μ L，10XPS buffer 5 μ L, EC0RI2. 5 μ L, Sail 2. 5 μ L, ddH20 10 μ L，總 體積50μ L，37°C酶切5h。質(zhì)粒載體雙酶切反應(yīng)體系是pET-3h 30 μ L，10 X PS buffer5 μ L, ECORI 2. 5 μ L，Sail 2. 5 μ L, ddH20 10 μ L，總體積 50 μ L，37°C酶切 5h。反應(yīng)結(jié)束，用Omega純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物，分別用20mL的ddH20回溶。(2)將克隆得到的溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因與質(zhì)粒pET-3h連接，用 TAKARA的E. coli DNA Ligase連接酶在16°C水浴中反應(yīng)lh，得到重組載體。III.將重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌宿主菌中篩選陽性克隆和測序鑒定；將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，轉(zhuǎn)化方法如下將重組載體15 μ L加入 至密度為lX105/ml的大腸桿菌DH5 α感受態(tài)菌100 μ L中，混勻，冰浴30min ；然后42°C熱休 克90s，再迅速轉(zhuǎn)移至冰上2min，然后升溫至37°C ；將反應(yīng)菌液涂在含有氨芐抗生素的LB固 體培養(yǎng)基上，恒溫37°C培養(yǎng)8小時；挑選陽性克隆至含有氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中， 370C，200rmp過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，送測序公司進行測序，測序結(jié)果分析顯示，插入片段的氨 基酸序列與Genebank上收錄的C0LVIA2mRNA氨基酸序列完全一致。
IV.轉(zhuǎn)染大腸桿菌宿主細胞后誘導(dǎo)表達和分析取測序后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21 (DE3)，涂布含有氨芐的LB固體培養(yǎng)基 中，37°C培養(yǎng)8小時，隨機挑取單菌落轉(zhuǎn)至含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D600 為0. 6 0. 7時，加異丙基硫代β -半乳糖苷(IPTG)至終濃度為lmm0l/LJ8°C誘導(dǎo)后 收集菌液進行SDS-PAGE電泳分析(SDS-PAGE為十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法) (如圖3)，結(jié)果表明在相對分子量46kDa處均有明顯特異性條帶，與預(yù)期的VI型人膠原蛋 白多肽相對分子量相符，并且該蛋白為水溶性蛋白。VI型人膠原蛋白多肽序列如下GNK GAK GDR GLP GPR GPQ GAL GEP GKQ GSR GDP GDA GPR GDS GQP GPKGDP GRP GFS YPG PRG APG EKG EPG PRG PEG GRG DFG LKG EPG RKG EKGEPA DPG PPG EPG PRG PRG VPG PEG EPG PPG DPG LTE CDV MTY VRE TCGCCG SEV SPV PPD DPA TPP DCE KRC GAL DVV FVI DSS ESI GYT NFT LEKNFV INV VNR LGA IAK DPK SET GTR VGV VQY SHE GTF EAI QLD DER IDSLSS FKE AVK NVI型人膠原蛋白多肽分子量為46kDa，氨基酸組成為250個，線性多肽單鏈。V.重組表達載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌宿主細胞后得到工程菌，工程菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條 件培養(yǎng)基成份為酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH6. 5-7. 0。培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度37°C，pH 6.8,轉(zhuǎn)速為150r/min，接種量為每IOOmL的LB液 體培養(yǎng)基接種4mL菌液，氨芐青霉素(ampicillin) 100 μ g/mL，培養(yǎng)至0D600為0. 6 0. 7 時，加異丙基硫代β-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為lmmol/LJ8°C條件下誘導(dǎo)幾后收集菌 液。VI.水溶性VI型人膠原蛋白多肽的純化條件(1)把步驟V收集的菌液，按每IOOmL培養(yǎng)基所得菌體加入4mL緩沖液，緩沖液與 培養(yǎng)基的體積比為1 25，重懸于冰浴預(yù)冷的IX結(jié)合緩沖液，將重懸菌液進行超聲波破 碎。(2)在13000r/min條件下，4°C離心20分鐘，上清為澄清的細胞粗提物。蛋白電泳 顯示型人膠原多肽的蛋白溶于上清液中，該粗提物經(jīng)鎳柱親和層析，然后冷凍干燥，收集水 溶性VI型人膠原蛋白多肽。純化所用的緩沖液為Novagen公司Ni-NTA緩沖液試劑盒(Ni-NTABuffer Kit)提{共。VII.用免疫印跡法分析純化的可溶性VI型人膠原蛋白多肽的特異性取純化后的可溶性VI型人膠原蛋白多肽，進行Wfestern-blotting檢測，結(jié)果如圖 4，在46KDa處左右出現(xiàn)一條蛋白染色帶，證明VI型人膠原蛋白多肽得到表達，且具有良好 的特異性和免疫反應(yīng)性。用MTT法檢測純化的VI型人膠原蛋白多肽對人胚皮膚成纖維細胞(HSF)的細胞 增殖的影響。取對數(shù)生長期的人胚皮膚成纖維細胞(HSF)，胰酶消化后，制備細胞懸浮液調(diào)整濃 度為2 X 105/mL,每孔200 μ L加入到96孔培養(yǎng)板中，在37°C，5 % CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，吸棄每孔的培養(yǎng)上清液，用D-Hanks液清洗兩遍，并在其中加入100 μ L的D-Hanks 液，將其置于UVA紫外光源下照射，照射劑量為8J/cm2 ；照射結(jié)束立即吸棄D-Hanks液，加入 新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，并在孔中加入2 μ L，4 μ L，6 μ L，8 μ L不同劑量的VI型人膠原蛋 白多肽(CW)，每個實驗組設(shè)3個重復(fù)孔，將96孔培養(yǎng)板置于37°C，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)M小時后，進行MTT實驗，在酶標儀490nm處測定光密度值0D，觀測細胞增殖變化結(jié) 果見表1。 表1 mtt實驗結(jié)果實驗組ODl0D20D3OD平均值
空白0. 6710. 6830. 6510.668333333
照射UVB0. 4780. 4650. 4190. 454
2 μ 1 的 CW0. 4740. 4570. 4360. 455666667
4 μ 1 的 CW0. 4810. 5090. 4770. 489
6 μ 1 的 CW0. 5240. 5660. 5080.532666667
8 μ 1 的 CW0. 580. 6080. 5910. 593結(jié)果顯示，VI型人膠原蛋白多肽(CW)能促進UVA照射的人胚皮膚成纖維細胞 (HSF)的增殖，減輕對細胞增殖活性的損傷，劑量越大作用越強。實施例2 —種溶水性VI型人膠原蛋白多肽的制備方法，所述的步驟II的(2)將 溶水性VI型人膠原蛋白目的基因與質(zhì)粒pET-3^i連接，用TAKARA的E. coli DNA Ligase 連接酶在16°C水浴中反應(yīng)池，得到重組載體；其余的步驟和條件同實施例1。實施例3 —種溶水性VI型人膠原蛋白多肽的制備方法，所述的步驟II的(2)將 溶水性VI型人膠原蛋白目的基因與質(zhì)粒pET-3^i連接，用TAKARA的E. coli DNA Ligase 連接酶在16°C水浴中反應(yīng)池，得到重組載體；其余的步驟和條件同實施例1。實施例4一種溶水性VI型人膠原蛋白多肽的制備方法，所述的步驟所述的步驟VI 的(2)在13000r/min條件下，4°C離心30分鐘；其余的步驟和條件同實施例1。
權(quán)利要求
1. 一種溶水性VI型人膠原蛋白多肽的制備方法，其特征在于，步驟和條件如下I.以含有人C0LVIA2mRNA基因序列的質(zhì)粒PCMV-SP0RT6為模板，應(yīng)用PCR克隆出溶水 性VI型人膠原蛋白多肽目的基因(1)從含有質(zhì)粒PCMV-SP0RT6的大腸桿菌中制備質(zhì)粒DNA遵循Omega公司的質(zhì)粒提取 試劑盒的說明書來提取制備；(2)根據(jù)基因庫編號BC065509.1的人類膠原蛋白VIA2型全長mRNA序列，設(shè)計帶酶切 位點ECORI, SalI的上下游引物如下Pl C0L6A2EC0RI 為 5' atcGAATTCGGCAACAAAGGAGCCAAG3‘P2 C0L6A2SalI 為 5， atcGTCGACGTTCTTGACAGCCTCCTT3，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共30 個循環(huán)，72 °C再延伸7min ；PCR 反應(yīng)體系為5XPS buffer 10 μ L ；dNTP 2 μ L，其中，dATP、dGTP、dTTP、dCTP 的濃 度均為 2.5mM;Pl 1口1^，其濃度為10口] 丨2 1 μ L，其濃度為 10 μ M ;Taq DNA polymerase 2U ；C0LVIA2 mRNA200ng ；加水至反應(yīng)總體積為50 μ L ；其中，iTaq DNA Polymerase簡稱Taq酶，是TAKARA的DNA聚合酶；dNTP為三磷酸脫氧 核糖核苷，包括 dATP，dGTP, dTTP, dCTP ；所用試劑為TAKARA的DNA Polymerase試劑盒里的試劑；經(jīng)PCR獲得目的基因，用1. 2% (g/mL)濃度的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并分離，利用DNA凝 膠回收試劑盒純化后得到溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因；上述含有人C0LVIA2 mRNA氨基酸序列的質(zhì)粒pCMV_SP0RT6為_80°C條件下保存；克隆得到的溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因序列如下GGCAACAAAGGAGCCAAGGGAGACCGAGGCTTGCCTGGACCCAGAGGCCCCCAGGGAGCTCTTGGGGAGCCC GGAAAGCAGGGATCTCGGGGAGACCCCGGTGATGCAGGACCCCGTGGAGACTCAGGACAGCCAGGCCCCAAGGGAGA CCCCGGCAGGCCTGGATTCAGCTACCCAGGACCCCGAGGAGCACCCGGAGAAAAAGGCGAGCCCGGCCCACGCGGCC CCGAGGGAGGCCGAGGCGACTTTGGCTTGAAAGGAGAACCTGGGAGGAAAGGAGAGAAAGGAGAGCCTGCGGATCCT GGTCCCCCTGGTGAGCCAGGCCCTCGGGGGCCAAGAGGAGTCCCAGGACCCGAGGGTGAGCCCGGCCCCCCTGGAGA CCCCGGTCTCACGGAGTGTGACGTCATGACCTACGTGAGGGAGACCTGCGGGTGCTGCGACTGTGAGAAGCGCTGTG GCGCCCTGGACGTGGTCTTCGTCATCGACAGCTCCGAGAGCATTGGGTACACCAACTTCACACTGGAGAAGAACTTC GTCATCAACGTGGTCAACAGGCTGGGTGCCATCGCTAAGGACCCCAAGTCCGAGACAGGGACGCGTGTGGGCGTGGT GCAGTACAGCCACGAGGGCACCTTTGAGGCCATCCAGCTGGACGACGAACGTATCGACTCCCTGTCGAGCTTCAAGG AGGCTGTCAAGAACII.將克隆得到的溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因經(jīng)過ECORI和MlI限制性酶 處理后并連入表達質(zhì)粒pET-32a，獲得重組載體(1)用Omega公司的質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒載體pET_32a，用限性內(nèi)切酶ECORI和 SalI分別對純化好的溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因和質(zhì)粒載體pET-3h進行雙酶 切；溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因雙酶切反應(yīng)體系是溶水性VI型人膠原蛋白多 肽目的基因 30 μ L, 10XPS buffer 5 μ L, EC0RI2. 5 μ L, Sail 2. 5 μ L, ddH20 10 μ L,總體積 50μ L，37°C酶切 5h ；質(zhì)粒載體雙酶切反應(yīng)體系是pET-32a 30μ L, 10XPS buffer5 μ L, ECORI 2. 5 μ L, Sail 2. 5 μ L，ddH20 10 μ L,總體積 50 μ L, 37°C酶切 5h ；反應(yīng)結(jié)束，用Omega純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物，分別用20mL的(MH2O回溶； (2)將克隆得到的溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因與質(zhì)粒pET-3h連接，用 TAKARA的E. coli DNA Ligase連接酶在16°C水浴中反應(yīng)1至3h，得到重組載體；III.將重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌宿主菌中篩選陽性克隆和測序鑒定將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，轉(zhuǎn)化方法如下將重組載體15 μ L加入到大 腸桿菌DH5 α感受態(tài)菌μ L中，混勻，冰浴30min ；然后42°C熱休克90s，再迅速轉(zhuǎn)移至冰上 2min，然后升溫至37°C ；將反應(yīng)菌液涂在含有氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，恒溫37°C條 件下培養(yǎng)8小時；挑選陽性克隆至含有氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200rmp過夜 培養(yǎng)；然后提取質(zhì)粒，送測序公司進行測序，測序結(jié)果分析顯示，插入片段的氨基酸序列與 Genebank上收錄的C0LVIA2 mRNA氨基酸序列完全一致；IV.轉(zhuǎn)染大腸桿菌宿主細胞后誘導(dǎo)表達和分析取測序后正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21 (DE3)，涂布含有氨芐的LB固體培養(yǎng)基中 37°C培養(yǎng)8h，隨機挑取單菌落轉(zhuǎn)至氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)至0D600為0. 6 0. 7時，加異丙基硫代β -半乳糖苷至終濃度為lmmol/L，下誘導(dǎo)幾后收集菌液進行 SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果表明在相對分子量46kDa處有明顯特異性條帶，與預(yù)期的VI型人 膠原蛋白多肽相對分子量相符，并且該蛋白為水溶性蛋白； VI型人膠原蛋白多肽序列如下GNK GAK GDR GLP GPR GPQ GAL GEP GKQ GSR GDP GDA GPR GDS GQP GPK GDP GRP GFS YPG PRG APG EKG EPG PRG PEG GRG DFG LKG EPG RKG EKG EPA DPG PPG EPG PRG PRG VPG PEG EPG PPG DPG LTE CDV MTY VRE TCG CCG SEV SPV PPD DPA TPP DCE KRC GAL DVV FVI DSS ESI GYT NFT LEK NFV INV VNR LGA IAK DPK SET GTR VGV VQY SHE GTF EAI QLD DER IDS LSS FKE AVK N所述的VI型人膠原蛋白多肽，其分子量為46kDa，氨基酸組成為250個，線性多肽單鏈；V.重組表達載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌宿主細胞后得到工程菌，工程菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基成份為酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH6. 5-7. 0 ；培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度37°C，pH 6. 8，轉(zhuǎn)速為150r/min，接種量為每IOOmL的LB液體培 養(yǎng)基接種4mL菌液，氨芐青霉素100 μ g/mL，培養(yǎng)至0D600為0. 6 0. 7時，加異丙基硫代 β -半乳糖苷至終濃度為lmmol/L，條件下誘導(dǎo)幾后收集菌液；VI.水溶性VI型人膠原蛋白多肽的純化條件(1)把步驟V收集的菌液，按每IOOmL培養(yǎng)基所得菌體加入4mL緩沖液，緩沖液與培養(yǎng) 基的體積比為1 25，重懸于冰浴預(yù)冷的IX結(jié)合緩沖液，將重懸菌液進行超聲波破碎；(2)在13000r/min條件下，4°C離心20分鐘，上清為澄清的細胞粗提物，蛋白電泳顯示 VI型人膠原多肽的蛋白溶于上清液中，該粗提物經(jīng)鎳柱親和層析，然后冷凍干燥，收集水溶 性VI型人膠原蛋白多肽；純化所用的緩沖液為Novagen公司Ni-NTA緩沖液試劑盒(Ni-NTABuffer Kit)提供；VII.用免疫印跡法分析純化的可溶性VI型人膠原蛋白多肽的特異性取純化后的可溶性VI型人膠原蛋白多肽，進行Wfestern-blotting檢測，在46KDa處左 右出現(xiàn)一條蛋白染色帶，證明VI型人膠原蛋白多肽得到表達，且具有良好的特異性和免疫 反應(yīng)性。
2.如權(quán)利要求1所述的一種溶水性VI型人膠原蛋白多肽的制備方法，其特征在于，所 述的步驟II的(2)將克隆得到的溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因與質(zhì)粒pET-3h連 接，用TAKARA的E. coli DNA Ligase連接酶在16°C水浴中反應(yīng)池，得到重組載體；其余的 步驟和條件同權(quán)利要求1。
3.如權(quán)利要求1所述的一種溶水性VI型人膠原蛋白多肽的制備方法，其特征在于，所 述的步驟II的(2)將克隆得到的溶水性VI型人膠原蛋白多肽目的基因與質(zhì)粒PET-3M連 接，用TAKARA的E. coli DNA Ligase連接酶在16°C水浴中反應(yīng)池，得到重組載體；其余的 步驟和條件同權(quán)利要求1。
4.如權(quán)利要求1所述的一種溶水性VI型人膠原蛋白多肽的制備方法，其特征在于，所 述的步驟VI的(2)在13000r/min條件下，4°C離心30分鐘；其余的步驟和條件同權(quán)利要求 1。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種溶水性VI型人膠原蛋白多肽的制備方法。將VI人膠原蛋白多肽編碼基因連入克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸肝菌，構(gòu)建工程菌，誘導(dǎo)工程菌表達VI人膠原蛋白多肽，分別建立工程菌發(fā)酵和目的蛋白純化工藝。經(jīng)過蛋白質(zhì)電泳分析和活性鑒定后，表明VI型人膠原蛋白多肽分子量為46kDa，可溶于上清，具有良好的水溶性，以單體或多聚物形式存在；在體外能保護細胞免受紫外線傷害，消炎及滋潤保濕作用。本發(fā)明實現(xiàn)了規(guī)模制備一種溶水性VI人膠原蛋白多肽的基因工程制備方法。
文檔編號C12N15/70GK102061296SQ20101025824
公開日2011年5月18日 申請日期2010年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月20日
發(fā)明者吳銘, 孫孫旸, 王剛, 陳 光 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)