專利名稱：一種快速檢測(cè)自然水樣中赤潮藻的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)，具體的說是一種快速檢測(cè)自然水樣中赤潮藻的試劑
品.O
背景技術(shù)：
赤潮(red tide)泛指由于海洋浮游生物(主要是甲藻和硅藻)的過度繁殖造成海水變色的現(xiàn)象。赤潮從嚴(yán)格意義上講是一種自然現(xiàn)象，但自20世紀(jì)70年代后，有關(guān)赤潮的報(bào)道越來越多，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，1972 1998年我國(香港地區(qū)和臺(tái)灣省未統(tǒng)計(jì)在內(nèi))有記載的赤潮達(dá)360次。赤潮發(fā)生頻率的明顯增加，發(fā)生規(guī)模及危害程度的日益加劇，不僅使我國的海洋生態(tài)環(huán)境遭受影響，也給海洋漁業(yè)等造成巨大損失。更為嚴(yán)重的是赤潮的頻繁爆發(fā)使得赤潮藻種類在全球擴(kuò)展很快。當(dāng)前，國際上微藻鑒定的標(biāo)準(zhǔn)主要依靠細(xì)胞的形態(tài)特征和生活史，這對(duì)于準(zhǔn)確識(shí)別和定量檢測(cè)自然水體中的赤潮藻卻有很大的難度，其主要原因是形態(tài)上很相近的種類難以識(shí)別和區(qū)分，而且這些表型特征易隨生活環(huán)境的變化而變化。另外，通過傳統(tǒng)的顯微觀察法對(duì)赤潮水域的自然種群進(jìn)行鑒定就需要工作人員有豐富的分類學(xué)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)。因此很有必要發(fā)展一種準(zhǔn)確、迅速的識(shí)別方法，并將該方法也應(yīng)用于對(duì)自然水體的分析。分子生物學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)的迅速發(fā)展為赤潮藻的鑒定提供了新思路，也使得研制微藻的快速定量檢測(cè)方法成為可能。現(xiàn)在最常用的方法有RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)、RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)、FIA(Fluorescence Immunology Analysis熒光免疫分析)等。上述分子方法對(duì)于鑒定室內(nèi)培養(yǎng)的微藻材料是有用的，但應(yīng)用于自然水體中的樣品時(shí)卻有很大的局限性。免疫學(xué)的方法雖然簡(jiǎn)單、靈敏、迅速，但主要依賴檢測(cè)樣品的表型特征，這些特征又常常受環(huán)境的影響而變化，而且應(yīng)用于自然水體中時(shí)又會(huì)出交叉反應(yīng)現(xiàn)象。另外，目前應(yīng)用于其它領(lǐng)域的一些先進(jìn)的分子生物學(xué)方法也應(yīng)用于赤潮藻的快速鑒定。如全細(xì)胞雜交法(Whole-cell Hybridization), PCR-ELISA，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Real-timeFluorescence Quantitative PCR)，熒光原位雜交(Fluorescent in situhybridization, FISH)等。這些方法在赤潮藻的準(zhǔn)確定性定量研究，以及用于檢測(cè)赤潮水樣方面帶來希望。盡管上述方法有檢測(cè)自然水樣的報(bào)道，但目前尚未有便攜式的能檢測(cè)自然赤潮水樣的試劑盒的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種快速檢測(cè)自然水樣中赤潮藻的試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為—種快速檢測(cè)自然水樣中赤潮藻的試劑盒試劑盒由濾膜、試劑和待測(cè)樣品組成；所述試劑為 0. 05-0. 2mL ddH20、0. 2-0. 4mL 95 % 乙醇、1· 5-2. 5mL 20X SET buffer、 600-700 μ 1 5 X SET buffer、400-500 μ 11 X SET buffer禾口 10-15 μ 1 FITC標(biāo)記寡核苷酸探針溶液。
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所述FITC標(biāo)記寡核苷酸探針為棕囊藻轉(zhuǎn)錄單元間隔區(qū)特異區(qū)設(shè)計(jì)，序列為5 ’ -TCATCGAGACTTTGAACGCACATG-3 ’；赤潮異彎藻核糖體大亞基特異區(qū)設(shè)計(jì)，序列為5 ’ -ACGAGCTTCCAGAATGCCAA-3 ’；東海原甲藻轉(zhuǎn)錄單元間隔區(qū)特異區(qū)設(shè)計(jì)，序列為 5， -TCCTGATCGTCTCCTGCCT-3，。所述20 X SET buffer 為濃度為 3. OOmol/L 的 NaCl，濃度為 20mmol/L 的 EDTA，濃度為 0. 40mol/L 的 Tris HCl，pH7. 80 ；5XSET buffer 為濃度為 0. 75mol/L 的 NaCl，濃度為 5mmol/L 的 EDTA，濃度為 0.IOmol/L 的 Tris HCl，ρΗ7· 80 ；IXSET buffer 為濃度為 0. 15mol/L 的 NaCl，濃度為 lmmol/L 的 EDTA，濃度為 0. 02mol/L 的 Tris HCl，pH 7. 80 ；所述濾膜孔徑0. 45 μ m，直徑13mm?？焖贆z測(cè)自然水樣中赤潮藻的試劑盒的使用方法1)藻細(xì)胞的固定按照上述比例將ddH20、95%乙醇、20XSET buffer,5XSET buffer和待測(cè)樣品顛倒混勻，室溫靜置30-45Min，待用；2)藻細(xì)胞的過濾將上述固定后的藻細(xì)胞于濾膜上過濾，待用；同時(shí)將過濾后濾膜用5 X SET buffer溶液清洗，待用；3)雜交液的準(zhǔn)備取上述比例的FITC標(biāo)記寡核苷酸探針溶液和5 X SETbuffer溶液混合均勻作為雜交液；4)雜交在上述濾膜上滴加150-200 μ 1雜交液，于40-50°C雜交0.5-1. 5h，即可
檢測(cè)待測(cè)溶液中赤潮藻。5)雜交后洗滌雜交完后，用吸水紙吸凈雜交液，在濾膜上滴加 200-300 μ IlXSET buffer溶液，洗滌時(shí)間3min，溫度50°C，重復(fù)2次。所述FITC標(biāo)記寡核苷酸探針為棕囊藻轉(zhuǎn)錄單元間隔區(qū)特異區(qū)設(shè)計(jì)，序列為5 ’ -TCATCGAGACTTTGAACGCACATG-3 ’；赤潮異彎藻核糖體大亞基特異區(qū)設(shè)計(jì)，序列為5 ’ -ACGAGCTTCCAGAATGCCAA-3 ’；東海原甲藻轉(zhuǎn)錄單元間隔區(qū)特異區(qū)設(shè)計(jì)，序列為 5， -TCCTGATCGTCTCCTGCCT-3，。所述20 X SET buffer 為濃度為 3. OOmol/L 的 NaCl，濃度為 20mmol/L 的 EDTA，濃度為 0. 40mol/L 的 Tris HCl，pH 7. 80 ；5X SET buffer 為濃度為 0. 75mol/L 的 NaCl，濃度為 5mmol/L 的 EDTA，濃度為 0. 10mol/L 的 Tris HCl，pH 7. 80 ；IX SET buffer 為濃度為 0. 15mol/L 的 NaCl，濃度為 lmmol/L 的 EDTA，濃度為 0. 02mol/L 的 Tris HCl，pH 7. 80 ；所述濾膜孔徑0. 45 μ m,直徑13mm。所述雜交后的膜可直接進(jìn)行熒光顯微鏡觀察或置于濕盒中避光保存于4°C ；熒光顯微鏡觀察用495nm激發(fā)濾光，DM500 二相分光鏡，520nm波長(zhǎng)的濾過器。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明試劑盒攜帶方便，并且能夠攜帶到船上隨時(shí)檢測(cè)自然水樣中的赤潮藻，同時(shí)本發(fā)明試劑盒操作步驟簡(jiǎn)單且非常省時(shí)、快捷，具有良好的應(yīng)用和市場(chǎng)要求。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1檢測(cè)出東海原甲藻經(jīng)熒光顯微鏡在40X倍下效果圖。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例1檢測(cè)出赤潮異彎藻經(jīng)熒光顯微鏡下效果圖。
具體實(shí)施例實(shí)施例1檢測(cè)待測(cè)水樣中的東海原甲藻試劑盒試劑盒由濾膜、試劑和待測(cè)樣品組成；所述試劑為0. ImlddH2O^O. 3ml 95% 乙醇、2. Iml 20 X SET buffer,600 μ 1 5 X SETbuffer、400 μ 1 IXSET buffer 禾口 10μ1 FITC標(biāo)記寡核苷酸探針溶液；2. 5ml待測(cè)樣品。FITC標(biāo)記寡核苷酸探針是根據(jù)東海原甲藻ITS區(qū)的特異序列設(shè)計(jì)，序列為 5， -TCCTGATCGTCTCCTGCCT-3，。試劑盒使用方法(1)藻細(xì)胞的固定在5ml滅菌離心管中加入0. Iml ddH20,0. 3ml 95%乙醇和 2. Iml的20XSET buffer并混勻，加入采自東海赤潮爆發(fā)區(qū)的自然待測(cè)樣品水樣2. 5ml于 Eppendorf離心管，顛倒混勻，室溫靜置30min ；(2)藻細(xì)胞的過濾用5ml —次性滅菌針頭吸凈上述混合液，將孔徑0. 45 μ m,直徑 13mm的濾膜安置于過濾器上，對(duì)混合液進(jìn)行過濾；(3)雜交前洗膜小心地將濾膜用5 X SET buffer溶液洗滌2次，避免藻細(xì)胞被沖洗掉；(4)雜交液的準(zhǔn)備首先將探針(由生物公司按上述序列合成并用FITC標(biāo)記的序列)用0. lmol/L Tris-HCKpH 7. 5)溶解為 100 μ M 的濃度，然后取 10 μ 1 與 200 μ 1 5 X SET buffer混合均勻作為雜交液；(5)雜交將濾膜貼附在潔凈的載玻片上，在濾膜上滴加200 μ 1雜交液，保持濕潤，雜交時(shí)間為lh，溫度為45°C，即可檢測(cè)待測(cè)溶液中東海原甲藻；(6)雜交后洗膜雜交完后，用吸水紙吸凈雜交液，在濾膜上滴加400 μ 1的1 X SET buffer，洗滌時(shí)間3min，溫度50°C，重復(fù)2次；(7)熒光觀察雜交后的膜可直接進(jìn)行熒光顯微鏡觀察或置于濕盒中避光保存于 40C (參見圖1)。雜交后在顯微鏡下觀察，到目標(biāo)藻即東海原甲藻藻體均顯示綠色熒光(即FITC的熒光)，其中可能存在其它的藻稍稍顯示綠色的熒光，但是通過雜交洗膜步驟可將此現(xiàn)象去除，僅保留目標(biāo)藻整個(gè)藻體呈現(xiàn)綠色熒光?？梢姳景l(fā)明試劑盒特異性強(qiáng)，檢測(cè)靈敏。實(shí)施例2檢測(cè)待測(cè)水樣中的赤潮異彎藻試劑盒試劑盒由濾膜、試劑和待測(cè)樣品組成；所述試劑為0. 05mlddH20、0. 2ml 95% 乙醇、1.5ml 20 X SET buffe Γ、700μ1 5 X SETbuffer、500 μ 1 IXSET buffer 禾口 12 μ 1 FITC標(biāo)記寡核苷酸探針溶液；2. 5ml待測(cè)樣品。FITC標(biāo)記寡核苷酸探針是根據(jù)赤潮異彎藻核糖體大亞基特異區(qū)設(shè)計(jì)，序列為 5， -ACGAGCTTCCAGAATGCCAA-3，。使用方法(1)藻細(xì)胞的固定在5ml滅菌離心管中加入0. 05ml ddH20、0. 2ml為95%乙醇和1. 5ml的20 X SET buffer并混勻，加入采自東海赤潮爆發(fā)區(qū)自然水樣濃縮2_3倍后，取待測(cè)樣品水樣2. 5ml于Eppendorf離心管，顛倒混勻，室溫靜置40min ；(2)藻細(xì)胞的過濾用5ml —次性滅菌針頭吸凈上述混合液，將孔徑0. 45 μ m,直徑 13mm的濾膜安置于過濾器上，對(duì)混合液進(jìn)行過濾；(3)雜交前洗膜小心地將濾膜用5 X SET buffer溶液洗滌2次，避免藻細(xì)胞被沖洗掉；(4)雜交液的準(zhǔn)備首先將探針(由生物公司按上述序列合成并用FITC標(biāo)記的序列)用0. lmol/L Tris-HCKpH 7. 5)溶解為 100 μ M 的濃度，然后取 12 μ 1 與 200 μ 1 5 X SET buffer混合均勻作為雜交液；(5)雜交將濾膜貼附在潔凈的載玻片上，在濾膜上滴加150 μ 1雜交液，保持濕潤，雜交時(shí)間為0.證，溫度為40°C，即可檢測(cè)待測(cè)溶液中赤潮異彎藻；(6)雜交后洗膜雜交完后，用吸水紙吸凈雜交液，在濾膜上滴加500 μ 1的1 X SET buffer，洗滌時(shí)間3min，溫度50°C，重復(fù)2次；(7)熒光觀察雜交后的膜可直接進(jìn)行熒光顯微鏡觀察或置于濕盒中避光保存于 40C (參見圖2)。雜交后在顯微鏡下觀察到目標(biāo)藻即赤潮異彎藻整個(gè)藻體均顯示綠色熒光(即 FITC的熒光)，其中可能存在其它的藻稍稍顯示綠色的熒光，但是通過雜交洗膜步驟可將此現(xiàn)象去除，僅保留目標(biāo)藻整個(gè)藻體呈現(xiàn)綠色熒光?？梢姳景l(fā)明試劑盒特異性強(qiáng)，檢測(cè)靈敏。實(shí)施例3檢測(cè)待測(cè)水樣中的棕囊藻試劑盒試劑盒由濾膜、試劑和待測(cè)樣品組成；所述試劑為0. 2mlddH20,0. 4ml 95% 乙醇、2.5ml 20 X SET buffer,650 μ 1 5 X SETbuffer、450 μ 1 IXSET buffer 禾口 15μ1 FITC標(biāo)記寡核苷酸探針；1. 9ml待測(cè)樣品。FITC標(biāo)記寡核苷酸探針溶液是根據(jù)棕囊藻ITS區(qū)的特異區(qū)設(shè)計(jì)，序列為 5， -TCATCGAGACTTTGAACGCACATG-3’ )(1)藻細(xì)胞的固定在5ml滅菌離心管中加入0. 2ml ddH20、0· 4ml體積百分比為 95%乙醇和2. 5ml的20 X SET buffer并混勻，加入采自東海赤潮爆發(fā)區(qū)自然水樣濃縮2_3 倍后，取待測(cè)樣品水樣1. 9ml于Eppendorf離心管，顛倒混勻，室溫靜置45min ；(2)藻細(xì)胞的過濾用5ml —次性滅菌針頭吸凈上述混合液，將孔徑0. 45 μ m,直徑 13mm的濾膜安置于過濾器上，對(duì)混合液進(jìn)行過濾；(3)雜交前洗膜小心地將濾膜用5 X SET buffer溶液洗滌2次，避免藻細(xì)胞被沖洗掉；(4)雜交液的準(zhǔn)備首先將探針(由生物公司按上述序列合成并用FITC標(biāo)記的序列)用0. lmol/L Tris-HCKpH 7. 5)溶解為 100 μ M 的濃度，然后取 15 μ 1 與 200 μ 1 5 X SET buffer混合均勻作為雜交液；(5)雜交將濾膜貼附在潔凈的載玻片上，在濾膜上滴加200 μ 1雜交液，保持濕潤，雜交時(shí)間為lh，溫度為45°C，即可檢測(cè)待測(cè)溶液中赤潮異彎藻；(6)雜交后洗膜雜交完后，用吸水紙吸凈雜交液，在濾膜上滴加450 μ 1的1 X SETbuffer，洗滌時(shí)間3min，溫度50°C，重復(fù)2次； (7)熒光觀察雜交后的膜可直接進(jìn)行熒光顯微鏡觀察或置于濕盒中避光保存于 4°C。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測(cè)自然水樣中赤潮藻的試劑盒，其特征在于試劑盒由濾膜、試劑和待測(cè)樣品組成；所述試劑為 0. 05-0. 2mL ddH20、0. 2-0. 4mL95% 乙醇、1. 5-2. 5mL 20XSET buffer,600-700 μ 1 5 X SET buffer、400-500 μ 1 IXSET buffer 禾口 10-15 μ 1 FITC標(biāo)記寡核苷酸探針溶液。
2.按權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)自然水樣中赤潮藻的試劑盒，其特征在于所述FITC標(biāo)記寡核苷酸探針為棕囊藻轉(zhuǎn)錄單元間隔區(qū)特異區(qū)設(shè)計(jì)，序列為 5 ’ -TCATCGAGACTTTGAACGCACATG-3 ’；赤潮異彎藻核糖體大亞基特異區(qū)設(shè)計(jì)，序列為 5’ -ACGAGCTTCCAGAATGCCAA-3’ ；東海原甲藻轉(zhuǎn)錄單元間隔區(qū)特異區(qū)設(shè)計(jì)，序列為 5， -TCCTGATCGTCTCCTGCCT-3，。
3.按權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)自然水樣中赤潮藻的試劑盒，其特征在于所述 20 X SET buffer 為濃度為 3. OOmol/L 的 NaCl，濃度為 20mmol/L 的 EDTA，濃度為 0. 40mo 1/ L 的 Tris HCl，pH 7. 80 ；5 X SET buffer 為濃度為 0. 75mol/L 的 NaCl，濃度為 5mmol/L 的 EDTA，濃度為 0. IOmol/ L 的 Tris HCl，pH 7. 80 ；IXSET buffer 為濃度為 0. 15mol/L 的 NaCl，濃度為 lmmol/L 的 EDTA，濃度為 0. 02mol/ L 的 Tris HCl，pH 7. 80 ；所述濾膜孔徑0. 45 μ m,直徑13mm。
4.一種按權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)自然水樣中赤潮藻的試劑盒的使用方法，其特征在于1)藻細(xì)胞的固定按照上述比例將ddH20、95%乙醇、20XSETbuffer,5XSET buffer 和待測(cè)樣品顛倒混勻，室溫靜置30-45Min，待用；2)藻細(xì)胞的過濾將上述固定后的藻細(xì)胞于濾膜上過濾，待用；同時(shí)將過濾后濾膜用 5 X SET buffer溶液清洗，待用；3)雜交液的準(zhǔn)備取上述比例的FITC標(biāo)記寡核苷酸探針溶液和5X SETbuffer溶液混合均勻作為雜交液；4)雜交在上述濾膜上滴加150-200μ 1雜交液，于40-50°C雜交0. 5-1. 5h，即可檢測(cè)待測(cè)溶液中赤潮藻。5)雜交后洗滌雜交完后，用吸水紙吸凈雜交液，在濾膜上滴加400-500μ IlXSET buffer溶液，洗滌時(shí)間3min，溫度50°C，重復(fù)2次。
5.按權(quán)利要求4所述的快速檢測(cè)自然水樣中赤潮藻的試劑盒的使用方法，其特征在于所述FITC標(biāo)記寡核苷酸探針為棕囊藻轉(zhuǎn)錄單元間隔區(qū)特異區(qū)設(shè)計(jì)，序列為5 ’ -TCATCGAGACTTTGAACGCACATG-3，；赤潮異彎藻核糖體大亞基特異區(qū)設(shè)計(jì)，序列為5 ’ -ACGAGCTTCCAGAATGCCAA-3 ’；東海原甲藻轉(zhuǎn)錄單元間隔區(qū)特異區(qū)設(shè)計(jì)，序列為 5， -TCCTGATCGTCTCCTGCCT-3，。
6.按權(quán)利要求4所述的快速檢測(cè)自然水樣中赤潮藻的試劑盒的使用方法，其特征在于所述20XSET buffer為濃度為3. OOmol/L的NaCl，濃度為20mmol/L的EDTA，濃度為 0. 40mol/L 的 Tris HCl，pH 7. 80 ；5XSETbuffer 為濃度為 0. 75mol/L 的 NaCl，濃度為 5mmol/L 的 EDTA，濃度為 0. 10mol/L 的 Tris HCl，pH 7. 80 ；IX SET buffer 為濃度為 0. 15mol/L 的 NaCl，濃度為 lmmol/L 的 EDTA，濃度為 0. 02mol/L 的 Tris HCl，pH 7. 80 ；所述濾膜孔徑0. 45 μ m,直徑13mm。
7.按權(quán)利要求4所述的快速檢測(cè)自然水樣中赤潮藻的試劑盒的使用方法，其特征在于所述雜交后的膜可直接進(jìn)行熒光顯微鏡觀察或置于濕盒中避光保存于4°C;熒光顯微鏡觀察用495nm激發(fā)濾光，DM500 二相分光鏡，520nm波長(zhǎng)的濾過器。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)，具體的說是一種快速檢測(cè)自然水樣中赤潮藻的試劑盒及其使用方法。試劑盒由濾膜、試劑和待測(cè)樣品組成；所述試劑為0.05-0.2mL ddH2O、0.2-0.4mL 95％乙醇、1.5-2.5mL 20×SETbuffer、600-700μl 5×SET buffer、400-500μl 1×SET buffer和10-15μl FITC標(biāo)記寡核苷酸探針溶液。本發(fā)明試劑盒攜帶方便，并且能夠攜帶到船上隨時(shí)檢測(cè)自然水樣中的赤潮藻，同時(shí)本發(fā)明試劑盒操作步驟簡(jiǎn)單且非常省時(shí)、快捷，具有良好的應(yīng)用和市場(chǎng)要求。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102373271SQ20101026180
公開日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2010年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月20日
發(fā)明者張寶玉, 王廣策, 陳國福 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院海洋研究所