專利名稱：一種魚類rf神經(jīng)肽基因、編碼的蛋白質(zhì)及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種魚類RF神經(jīng)肽基因、編碼的蛋白質(zhì)及其 應(yīng)用。
背景技術(shù)：
RF神經(jīng)肽是一類碳末端為Arg-Phe_NH2 (RF-amide)的短肽，它們首先在軟體動物 中發(fā)現(xiàn)并證明在無脊椎動物中大量存在。而在脊椎動物中僅存在五種RF神經(jīng)肽編碼基因 PrRP、NPFF(PQRP)、LPXRFa、Kisspeptin和26RFa。這些神經(jīng)肽具有廣泛的功能，其中包括 調(diào)節(jié)肌肉的收縮以及心血管功能、水分平衡代謝、神經(jīng)內(nèi)分泌等作用。隨著對RF神經(jīng)肽家 族研究的進(jìn)一步深入，現(xiàn)在認(rèn)為這一神經(jīng)肽家族在調(diào)節(jié)攝食和能量代謝方面具有重要的功 能。2003年，人們首先從食用蛙(Rana esculenta)腦勻漿液中分離純化了 26RFa并在 哺乳類中克隆了編碼26RFa蛋白前體序列。2006年，在小鼠腦勻漿液中分離得到了另一種 形式的成熟肽，命名為QRFP。26RFa和QRFP是由蛋白酶在不同的位置切割26RFa/QRFP前 體而產(chǎn)生的。26RFa/QRFP激活G蛋白偶聯(lián)的受體GPR103。大鼠26RFa/QRFP及其受體主要 在下丘腦的側(cè)結(jié)核和背腹核團(tuán)中表達(dá)。這些核團(tuán)在控制攝食行為和調(diào)節(jié)能量代謝扮演重要 角色。在缺失瘦素(ob/ob)或瘦素受體(db/db)小鼠，下丘腦中26RFa/QRFP基因的表達(dá)量 顯著上升。大鼠禁食48小時后，26RFa/QRFP基因在下丘腦的表達(dá)也會顯著上升。腦室注 射26RFa/QRFP能以劑量依存的方式促進(jìn)大鼠攝食；連續(xù)注射QRFP兩周能夠增強(qiáng)大鼠攝食 欲望，增加大鼠體重。用26RFa孵育大鼠腦垂體，第二信使cAMP的含量顯著升高。離體和 在體研究表明，26RFa/QRFP能夠刺激雌性大鼠LH的釋放。因此，26RFa/QRFP在控制攝食行 為和調(diào)節(jié)腦垂體激素的釋放有重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可以調(diào)控魚類生殖的魚類RF 神經(jīng)肽基因。本發(fā)明另一目的在于提供上述魚類RF神經(jīng)肽基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明另一目的在于提供上述魚類RF神經(jīng)肽基因的應(yīng)用。本發(fā)明還有一個目的在于提供上述魚類RF神經(jīng)肽基因編碼的蛋白質(zhì)的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)通過分析魚類基因組和EST數(shù)據(jù)庫，我們在多種魚類中發(fā)現(xiàn)編碼26RFa蛋白前體 序列。根據(jù)這些序列設(shè)計(jì)簡并引物，結(jié)合RACE技術(shù)，我們在金魚中分離得到26RFa cDNA序 列。金魚26RFa cDNA全長862bp，其核苷酸序列如SEQID NO :1所示，其中開放讀碼框?yàn)?507bp,5'非翻譯區(qū)為123bp，3'非翻譯區(qū)為232bp。它編碼的26RFa蛋白前體為168個氨 基酸，等電點(diǎn)為6. 53，分子量為28. 31千道爾頓，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，其中 N-端信號肽由30個氨基酸組成，成熟肽26RFa和7RFa位于蛋白前體的C-端，其氨基酸序列分別如SEQID NO :3 4所示。序列比對分析表明，26RFa蛋白前體在不同脊椎動物中序列變異較大，成熟肽和蛋 白前體斷裂識別位點(diǎn)的氨基酸序列相對來說較為保守。從不同的斷裂識別位點(diǎn)剪切蛋白前 體可能產(chǎn)生不同的成熟肽。在金魚，斷裂26RFa蛋白前體產(chǎn)生26RFa和7RFa兩種成熟肽。 不同物種26RFa蛋白前體產(chǎn)生的成熟肽C-末端都存在保守的GGFXFRF-amide (X = G，S，A or N)結(jié)構(gòu)，表明這些氨基酸可能是成熟肽發(fā)揮功能的核心序列。采用Real-time PCR檢測金魚26RFa在各種組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示26RFa在下 丘腦、視頂蓋-丘腦及精巢中表達(dá)最高，在端腦、小腦、延腦、腎臟、肝臟、垂體和心臟等組織 也有表達(dá)，而在卵巢和脂肪組織中沒有表達(dá)。本發(fā)明魚類RF神經(jīng)肽基因可以用于魚類生殖調(diào)控。用Real-time PCR檢測金魚26RFa基因在饑餓狀態(tài)下的變化，結(jié)果表明在饑餓四 天后，下丘腦中26RFa基因的表達(dá)量也顯著高于對照組(P<0.05)。采用腹腔注射方式研 究化學(xué)合成的金魚26RFa對金魚攝食的影響，結(jié)果表明100ng/gBW和500ng/gBW 26RFa注 射組能夠增加金魚的在注射后1小時的攝食量。因此，本發(fā)明魚類RF神經(jīng)肽基因編碼的蛋白質(zhì)可以用于調(diào)節(jié)魚類攝食或制作魚 類人工飼料。用不同濃度的26RFa在體腹腔注射雌性成熟金魚，結(jié)果顯示lug/gBW26RFa注射 組和lOOng/gBW 7RFa注射組血清中促性腺激素LH(促性腺激素是魚類生殖的重要調(diào)控激 素)的含量在處理后1小時顯著高于對照組(P < 0. 05)，而在處理后3小時和6小時無明
顯差異。因此，本發(fā)明魚類RF神經(jīng)肽基因可以用于魚類生殖調(diào)控。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明魚類RF神經(jīng)肽基因在魚類下丘腦中大量表達(dá)，該基因產(chǎn)生的成熟肽具有 調(diào)節(jié)魚類攝食的功能，可以通過化學(xué)合成的方法進(jìn)行開發(fā)利用，使用方便，效果顯著，具有 廣泛的應(yīng)用價值。


圖1是本發(fā)明魚類RF神經(jīng)肽的序列比對分析；圖2是本發(fā)明魚類RF神經(jīng)肽基因在各個組織的表達(dá)分析；圖3是本發(fā)明魚類RF神經(jīng)肽基因在饑餓過程的表達(dá)變化；圖4是本發(fā)明魚類RF神經(jīng)肽腹腔注射對金魚攝食的影響；圖5是本發(fā)明魚類RF神經(jīng)肽腹腔注射成熟期雌性金魚LH釋放的影響。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例11.金魚腦總RNA的提取取健康金魚，解剖后立即分離出腦組織。采用Trizol試劑法提取獲得金魚腦總RNA，其0D26(1/28(1 = 1.85,電泳結(jié)果顯示，28S rRNA, 18S rRNA條帶清晰，28S條帶亮度為18S 的兩倍，表明所得總RNA未被蛋白質(zhì)、酚和基因組DNA污染，純度高。2. cDNA第一鏈的合成取5iig金魚腦總RNA樣品進(jìn)行DNA酶處理以去除基因組DNA的污染，與RNA Oligo dT(序列如SEQ ID N0:5所示)混合，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所得產(chǎn)物置于_20°C保存?zhèn)溆谩?.引物設(shè)計(jì)通過分析魚類基因組和EST數(shù)據(jù)庫，我們在斑馬魚(zebrafish，Danio rerio)、 胄f將(medaka, Oryzias latipes) >(three-sp ined stickleback, Gasterosteus aculeatus)、紅_東方魚屯(fugu, Takifugu rubripes)以及黑青斑夕可魚屯(green spotted puffer, Tetraodon nigroviridis)中發(fā)現(xiàn)編碼26RFa蛋白前體序列。根據(jù)這些序列設(shè)計(jì) 簡并引物，利用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對，確定保守區(qū)，根據(jù)所確定保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并 引物，擴(kuò)增片段大小約為300bp。引物序列為F :5_-CTCAC (T/C) TCCAT (T/C) GC (A/C) GGAGG_3_R5_-GCTTTCG(A/C)TTTGG(C/G)AGGAAG-3。4.金魚26RFa基因cDNA全序列的克隆以合成的第一鏈cDNA作為模板，以簡并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物上樣至 1.8wt%瓊脂糖凝膠，以低電壓電泳分離DNA片段，從凝膠中純化回收目的產(chǎn)物。將純化后 的目的產(chǎn)物連接至pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化DH5ci大腸桿菌，挑選陽性克隆測序。Blast 同源分析表明，目的產(chǎn)物為MHC II B基因的中間片段。根據(jù)已得到的cDNA片段序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù) (Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)對目的基因的 3‘-和 5'-末端進(jìn)行 PCR擴(kuò)
+飽
+曰o按照RACE試劑盒GeneRacerTM Kit說明書對金魚腦總RNA進(jìn)行去磷酸，去mRNA 5'帽子結(jié)構(gòu)，與RNA Oligo連接，最終通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。用金魚26RFa cDNA 的 3'-和 5' -RACE 特異引物(MHC-F2，MHC-F3 和 MHC-R2，MHC-R3)和 GeneRacerTM Kit 的通用引物，以GeneRacerTM Kit反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為第一輪PCR模板，以稀釋的 第一輪PCR產(chǎn)物為第二輪PCR模板，擴(kuò)增金魚26RFa cDNA 3'端和5'端片段，對所得到的 PCR產(chǎn)物的回收純化、連接T載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、陽性克隆鑒定及DNA測序。測序所得序列 再與簡并引物擴(kuò)增所得的序列利用Clustal X軟件進(jìn)行拼接。特異引物序列如SEQ ID NO :6 7所示。實(shí)施例2魚類RF神經(jīng)肽的序列比對分析通過序列比對分析，26RFa蛋白前體在不同脊椎動物中序列變異較大，成熟肽和蛋 白前體斷裂識別位點(diǎn)的氨基酸序列相對來說較為保守。從不同的斷裂識別位點(diǎn)剪切蛋白前 體可能產(chǎn)生不同的成熟肽。在金魚，斷裂26RFa蛋白前體產(chǎn)生26RFa和7RFa兩種成熟肽。 不同物種26RFa蛋白前體產(chǎn)生的成熟肽C-末端都存在保守的GGFXFRF-amide (X = G，S，A or N)結(jié)構(gòu)，表明這些氨基酸可能是成熟肽發(fā)揮功能的核心序列(圖1)。 實(shí)施例3金魚26RFa的組織表達(dá) 采用Real-time PCR檢測金魚26RFa在各種組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示26RFa在下 丘腦、視頂蓋-丘腦及精巢中表達(dá)最高，在端腦、小腦、延腦、腎臟、肝臟、垂體和心臟等組織也有表達(dá)，而在卵巢和脂肪組織中沒有表達(dá)(圖2)。實(shí)施例4金魚26RFa/QRFP在饑餓過程的表達(dá)變化將體重60士 10g的金魚隨機(jī)分配到兩個玻璃缸中(分別為對照組和饑餓組)，平均 每個缸8條金魚。金魚每天定時(下午3點(diǎn)左右)投喂一次，食物投喂量約為體重的3%。 馴養(yǎng)兩周后，實(shí)驗(yàn)正式開始。對照組的金魚每天正常投喂，饑餓組的金魚在實(shí)驗(yàn)開始后停止 投喂。在饑餓組停止投喂4天后，分別將實(shí)驗(yàn)組和對照組的金魚用MS-222麻醉，經(jīng)處死收 集下丘腦樣品，液氮速凍處理，存放于-80°C超低溫冰箱備用。通過熒光定量PCR檢測金魚 下丘腦中26RFa基因在對照組和饑餓組的表達(dá)量變化，結(jié)果表明在饑餓四天后，下丘腦中 26RFa基因的表達(dá)量顯著高于對照組(P < 0. 05)(圖3)。實(shí)施例5金魚26RFa/QRFP在饑餓過程的表達(dá)變化將體重60士 10g的金魚隨機(jī)分配到四個玻璃缸中，平均每個缸8條金魚。金魚每 天定時(下午3點(diǎn)左右)投喂一次，食物投喂量約為體重的3%。馴養(yǎng)兩周后開始正式實(shí) 驗(yàn)。金魚用MS-222麻醉后，稱量每組中個體體重(body weight，BW)，根據(jù)體重分別由腹腔 注射 0.7%魚類生理鹽水(對照組)、10ng/gBW 26RFa、100ng/gBW和 500ng/gBW 26RFa。15 分鐘后，分別向每組金魚投喂固定重量的食物，讓每組金魚自由攝食1小時。同時將等量的 食物放入水中，以計(jì)算食物在水中1小時中的重量變化。將各組剩余的食物分別收集并烘 干，根據(jù)剩余的食物的重量計(jì)算各組中單位體重金魚的攝食量。采用腹腔注射方式研究化學(xué)合成的金魚26RFa對金魚攝食的影響(圖3_6)，結(jié)果 表明100ng/gBW和500ng/gBW 26RFa注射組能夠增加金魚的在注射后1小時的攝食量，而 10ng/gBff 26RFa注射組與對照組的攝食量相當(dāng)(圖4)。實(shí)施例6金魚26RFa對LH釋放的影響將性腺發(fā)育成熟的雌性金魚(體重120克左右)分成六組，每組7-9條魚。在實(shí) 驗(yàn)前馴養(yǎng)一周。實(shí)驗(yàn)開始時，先將金魚用MS-222麻醉后，稱量每組中個體體重。根據(jù)體重 分別由腹腔注入0. 7%魚類生理鹽水(對照組)或lng/gBW-1000ng/gBW 26RFa和100ng/g Bff 7RFa。分別在注射后lh、3h和6h從尾椎靜脈采血，每次采血0.6ml。將采集的血液樣品 裝入1. 5ml離心管中，在冰上放置4 6h后，于4°C 12，000X g離心15min，取血清，采用放 射免疫測定方法檢測LH濃度(圖5)。
權(quán)利要求
一種魚類RF神經(jīng)肽基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述魚類RF神經(jīng)肽基因，其特征在于所述基因是從金魚中分離得到。
3.權(quán)利要求1或2所述魚類RF神經(jīng)肽基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)的等 電點(diǎn)為6. 53，分子量為28. 31千道爾頓，其氨基酸序列如SEQ IDN0 :2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述魚類RF神經(jīng)肽基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于當(dāng)魚類RF神經(jīng) 肽基因是從金魚中分離得到時，該基因編碼的蛋白質(zhì)經(jīng)斷裂產(chǎn)生26RFa和7RFa兩種成熟 肽，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO :3 4所示。
5.權(quán)利要求1或2所述魚類RF神經(jīng)肽基因在魚類生殖調(diào)控中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求4所述魚類RF神經(jīng)肽基因編碼的蛋白質(zhì)在魚類攝食調(diào)節(jié)中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求4所述魚類RF神經(jīng)肽基因編碼的蛋白質(zhì)在魚類人工飼料中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種魚類RF神經(jīng)肽基因、編碼的蛋白質(zhì)及應(yīng)用。本發(fā)明魚類RF神經(jīng)肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。所述魚類RF神經(jīng)肽基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。本發(fā)明魚類RF神經(jīng)肽基因在魚類下丘腦中大量表達(dá)，該基因產(chǎn)生的成熟肽具有調(diào)節(jié)魚類攝食和調(diào)控魚類生殖的功能，可以通過化學(xué)合成的方法進(jìn)行開發(fā)利用，使用方便，效果顯著。
文檔編號C12N15/12GK101948838SQ20101026293
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月24日
發(fā)明者劉云, 劉曉春, 盧丹琪, 張勇, 張海發(fā), 李水生, 林浩然, 舒琥, 蒙子寧 申請人:中山大學(xué)