專利名稱：玉米低氮逆境下高籽粒數(shù)目優(yōu)異等位基因功能分子標(biāo)記開發(fā)與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及玉米低氮逆境下高籽粒數(shù)目優(yōu)異等位基因功能分子標(biāo)記開發(fā)與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
玉米是重要的糧食、飼料和工業(yè)原料作物，在國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有重要地位。我國 自2007年以來，玉米已是播種面積上的第一大作物。氮肥是玉米產(chǎn)量的重要的限制因素。 然而，氮肥施用量上升的幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于玉米增產(chǎn)的幅度，我國玉米生產(chǎn)對氮肥的依賴強(qiáng)，氮 肥利用效率低，玉米等禾谷類作物氮利用效率平均僅約為33%。大量施用氮肥，還引起地下 水硝酸鹽含量超標(biāo)、地表水體富營養(yǎng)化等面源污染。因此，玉米氮利用效率與耐低氮相關(guān)的 基礎(chǔ)與應(yīng)用研究是我國當(dāng)前農(nóng)業(yè)科研領(lǐng)域的重大需求，具有十分重要的意義。當(dāng)前，玉米品 種增產(chǎn)的主要途徑是進(jìn)一步增加播種密度，隨著密度的上升，玉米植株之間對環(huán)境養(yǎng)分的 競爭將進(jìn)一步加劇。因此，氮高效與耐低氮玉米品種選育是未來商業(yè)玉米育種中品種培育 與遺傳改良的重要方向。由于氮高效利用等復(fù)雜農(nóng)藝性狀往往受多基因位點(diǎn)控制和環(huán)境影響等原因，常規(guī) 篩選很難收到理想效果。谷氨酰胺合成酶是玉米等禾谷類作物氮利用效率相關(guān)的氮同化、 活化、轉(zhuǎn)運(yùn)與再同化途徑的代謝中樞酶，是氮同化及氮利用效率的關(guān)鍵基因，也是了解玉米 等禾谷類作物氮利用效率的重要切入點(diǎn)。研究也表明，低氮情況下籽粒數(shù)的高低對產(chǎn)量的 影響最大，因此，提高低氮逆境下玉米穗部籽粒數(shù)，是耐低氮品種改良與選擇的重要方向。育種材料選育過程中，雜交、回交或自交過程中均是人工授粉，授粉質(zhì)量直接決定 了籽粒數(shù)與結(jié)實(shí)性，待選育材料的籽粒數(shù)并不是基因效應(yīng)的體現(xiàn)。同時，籽粒數(shù)還受復(fù)雜的 環(huán)境效應(yīng)影響。因此，材料選擇過程中，常規(guī)育種方法無法對玉米籽粒數(shù)性狀進(jìn)行選擇。也 即通常所說的，育種過程中性狀對選擇不會響應(yīng)。此外，研究低氮逆境下育種材料的產(chǎn)量對 低氮處理的表現(xiàn)，需要建立貧瘠試驗(yàn)條件。發(fā)展一種普通條件下依據(jù)基因型選擇的技術(shù)可 以有效的解決上述兩個問題，具有重要的開發(fā)與利用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供玉米低氮逆境下高籽粒數(shù)目優(yōu)異等位基因功能分子標(biāo)記開 發(fā)與應(yīng)用，具體設(shè)計(jì)一種12bp的標(biāo)記，基于該標(biāo)記的引物對及其在輔助鑒別在低氮環(huán)境下 具有不同單株籽粒數(shù)目性狀的玉米中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了輔助鑒別在低氮環(huán)境下具有不同單株籽粒數(shù)目性狀玉米的引物對， 是序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對。所述引物對可用于輔助鑒別在低氮環(huán)境下具有不同單株籽粒數(shù)目性狀的玉米。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒別在低氮環(huán)境下具有不同單株籽粒數(shù)目性狀玉米的方 法，包括如下步驟以待測玉米的基因組DNA為模板，用所述引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為一種，且大小為329bp，待測玉米為插入純合型；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一種，且大小為317bp，待測玉米為缺失純合型；缺失純合型(優(yōu)良基因型)玉米在低氮環(huán)境下的單株 籽粒數(shù)目高于插入純合型(非優(yōu)良基因型)玉米在低氮環(huán)境下的單株籽粒數(shù)目。如果PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為兩種，大小分別為329bp和317bp，待測玉米為插入/缺失雜合型，可以其后代 中，分離得到缺失純合型(優(yōu)良基因型)。本發(fā)明還保護(hù)一種玉米育種方法，是選擇所述方法鑒別出的缺失純合型玉米進(jìn)行 育種。本發(fā)明還保護(hù)另一種玉米育種方法，包括如下步驟將供體親本與受體親本雜交 得到Fl代，將Fl代自交，得到F2代；以F2代玉米的基因組DNA為模板，用所述引物對進(jìn)行 PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一種且大小為317bp的F2代玉米為選育得到的玉米；所述供體親 本為采用所述方法鑒別出的缺失純合型玉米，所述受體親本為采用所述方法鑒別出的插入 純合型玉米。所述供體親本具體可為玉米品種CA156，所述受體親本具體可為玉米品種武314。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可采用聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染法或瓊脂糖凝膠電脈溴化乙錠 (EB)進(jìn)行檢測。所述引物對可用于制備輔助鑒別在低氮環(huán)境下具有不同單株籽粒數(shù)目性狀玉米 的試劑盒。本發(fā)明還保護(hù)序列表的序列4所示的DNA，即12bp的缺失區(qū)域，該區(qū)域可以作為分 子標(biāo)記，用于輔助鑒別在低氮環(huán)境下具有不同單株籽粒數(shù)目性狀的玉米，進(jìn)而用于玉米育 種。以上所述低氮環(huán)境均指全氮量低于0. 4% (質(zhì)量百分含量)的土壤。耐氮貧瘠穩(wěn)產(chǎn)品種是發(fā)展方向，選擇低氮逆境下高籽粒數(shù)是重要的選擇性狀。本 發(fā)明的方法可用于選擇低氮逆境下具有高籽粒數(shù)性狀的玉米品種，將其用于育種。本發(fā)明 的方法可以在早期種子(取部分胚乳不影響播種后種子活力)或幼苗階段篩選，受體可以 是已知的常用的玉米育種親本，也可以是未知材料，如自交系、雜交種、地方品種、開放授粉 群體等種質(zhì)資源，獲得含有目標(biāo)基因型的個體，對培育高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、抗逆的玉米品種具有重 要指導(dǎo)作用，是針對基因的選擇，加快育種速度，降低育種成本，并具有操作簡單，成本低 廉，周期短的優(yōu)點(diǎn)，適于推廣應(yīng)用，為玉米種質(zhì)的鑒定提供了一種快捷的選擇方法，具有很 高的開發(fā)價(jià)值。


圖1為兩年低氮環(huán)境下各性狀對產(chǎn)量性狀及性狀之間的作用的通徑分析；葉綠素 含量以SPAD計(jì)測定大喇叭口期相對葉綠素含量值；生物量以GreenSeeker測定的大喇 叭口期相對生物量NDVI值；# φ = 0. 01水平顯著；ns 不顯著。圖2為實(shí)施例5中F2代植株的鑒定電泳圖；size 分子量marker ；I 純合插 入(Insertion)基因型；D 純合缺失(Deletion)基因型；C 插入/缺失雜合的共顯性 (Co-dominant)基因型。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)
4方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。 實(shí)施例1中用于優(yōu)異等位基因鑒定的180個玉米自交系(見表1)均為我國玉米 育種當(dāng)前經(jīng)常應(yīng)用的親本自交系；公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。各個自 交系的遺傳背景分析結(jié)果參見(Chuanxiao Xie, Shihuang Zhang,Minshun Li,Xinhai Li, Zhuanfang Hao,Li Bai,Degui Zhang,Yehong Liang. (2007)Inferring genome ancestry and estimating molecular relatedness among 187 Chinese maize inbredlines. J. Genet. & Genomics 34(8) :738_748)，并作為主要遺傳類群的依據(jù)。
表1關(guān)聯(lián)性分析自然群體自交系及其系譜來源
權(quán)利要求
輔助鑒別在低氮環(huán)境下具有不同單株籽粒數(shù)目性狀玉米的引物對，是序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對。
2.權(quán)利要求1所述引物對在輔助鑒別在低氮環(huán)境下具有不同單株籽粒數(shù)目性狀玉米 中的應(yīng)用。
3.一種輔助鑒別在低氮環(huán)境下具有不同單株籽粒數(shù)目性狀玉米的方法，包括如下步 驟以待測玉米的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1所述引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物為一種，且大小為329bp，待測玉米為插入純合型；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一種，且大小 為317bp，待測玉米為缺失純合型；缺失純合型玉米在低氮環(huán)境下的單株籽粒數(shù)目高于插 入純合型玉米在低氮環(huán)境下的單株籽粒數(shù)目。
4.一種玉米育種方法，是選擇權(quán)利要求3所述方法鑒別出的缺失純合型玉米進(jìn)行育種。
5.一種玉米育種方法，包括如下步驟將供體親本與受體親本雜交得到Fl代，將Fl代 自交，得到F2代；以F2代玉米的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1所述引物對進(jìn)行PCR擴(kuò) 增；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一種且大小為317bp的F2代玉米為選育得到的玉米；所述供體親本為 采用權(quán)利要求3所述方法鑒別出的缺失純合型玉米，所述受體親本為采用權(quán)利要求3所述 方法鑒別出的插入純合型玉米。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述供體親本為玉米品種CA156，所述受體 親本為玉米品種武314。
7.權(quán)利要求1所述引物對在制備輔助鑒別在低氮環(huán)境下具有不同單株籽粒數(shù)目性狀 玉米的試劑盒中的應(yīng)用。
8.序列表的序列4所示的DNA。
9.權(quán)利要求8所述DNA在輔助鑒別在低氮環(huán)境下具有不同單株籽粒數(shù)目性狀玉米中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求8所述DNA在玉米育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種玉米低氮逆境下高籽粒數(shù)目優(yōu)異等位基因功能分子標(biāo)記開發(fā)與應(yīng)用。本發(fā)明提供分子標(biāo)記是序列表的序列4所示的DNA?；谠摌?biāo)記，本發(fā)明提供了序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對。所述分子標(biāo)記和所述引物對可用于輔助鑒別在低氮環(huán)境下具有不同單株籽粒數(shù)目性狀玉米，進(jìn)而用于玉米育種。本發(fā)明的方法可以在早期種子或幼苗階段篩選，對培育高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、抗逆的玉米品種具有重要指導(dǎo)作用，可以加快育種速度，降低育種成本，并具有操作簡單，成本低廉，周期短的優(yōu)點(diǎn)，適于推廣應(yīng)用，為玉米種質(zhì)的鑒定提供了一種快捷的選擇方法，具有很高的開發(fā)價(jià)值。
文檔編號C12N15/11GK101942512SQ201010263549
公開日2011年1月12日 申請日期2010年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月25日
發(fā)明者吳永升, 張世煌, 張德貴, 李新海, 李明順, 白麗, 翁建峰, 謝傳曉, 郝轉(zhuǎn)芳, 陳現(xiàn)平 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所