專利名稱：一種利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物領(lǐng)域，更具體涉及一種利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因 組的方法。
背景技術(shù)：
植物DNA的提取與動(dòng)物不同，植物細(xì)胞與組織具有較硬的細(xì)胞壁，往往含有大量 的RNA、蛋白質(zhì)、多糖、單寧和色素等雜質(zhì)，這些問(wèn)題給DNA的提取與純化帶來(lái)許多困難。在 實(shí)際操作中，大多數(shù)蛋白質(zhì)可通過(guò)酚、氯仿等處理后變性、沉淀除去，絕大部分RNA可通過(guò) RNase A除去。但多糖類雜質(zhì)一般較難去除，這些雜質(zhì)濃度高時(shí)，常常使DNA提取物呈膠狀， 低濃度下也會(huì)干擾后續(xù)操作及分光光度法對(duì)核酸的定量分析。因此，獲得高質(zhì)量、高純度的 DNA是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。在大多數(shù)植物的DNA提取方法中，CTAB法和SDS法是目前 最為常用的兩種方法。然而不同植物由于具體內(nèi)含物含量不同，在實(shí)際操作過(guò)程中，往往要 在原有方法基礎(chǔ)上加以改進(jìn)方能得到高質(zhì)量的DNA。甘蔗是禾本科甘蔗屬植物，原產(chǎn)于熱帶、亞熱帶地區(qū)。甘蔗是一種高光效的植物， 不僅是食糖業(yè)的重要原料，而且是能源、纖維、糖基化工和飼料的原料。目前，甘蔗種質(zhì)資 源包括甘蔗原種、地方品種、雜交品種以及甘蔗的野生近緣植物、育種中間材料等。近幾十 年來(lái)由于優(yōu)良種質(zhì)的研究貧乏，可利用雜交親本少，后代都可以追朔到幾個(gè)有限的親本，所 以得到的后代親緣關(guān)系近，遺傳背景狹窄，使甘蔗育種日益面臨“瓶頸效應(yīng)”，限制了甘蔗產(chǎn) 業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，對(duì)甘蔗的研究已深入到分子水平，以PCR為 基礎(chǔ)的多種分子標(biāo)記技術(shù)如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence r印eats，SSR)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphisms, AFLP)等已經(jīng)廣泛應(yīng)用于甘蔗的遺傳多樣性、種植資源 評(píng)價(jià)、指紋圖譜建立、性狀連鎖標(biāo)記與輔助選擇等研究，而開(kāi)展這些研究的基礎(chǔ)是獲得高質(zhì) 量、高純度的DNA。由于甘蔗富含多糖、纖維、酚類、醌類、色素等物質(zhì)，所以甘蔗DNA的粗提 物中經(jīng)常出現(xiàn)蛋白質(zhì)、多糖、色素等雜質(zhì)，抽提過(guò)程褐化明顯，提取的DNA存在濃度不高、純 度低等缺陷。目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了多種提取甘蔗DNA的方法，其中，最常采用的是液氮 研磨法，在研缽中加入液氮快速研磨，由于甘蔗葉片韌度高，所以一般要加入液氮多次，直 到葉片粉末顏色出現(xiàn)由綠變白的磨碎特征為止。這個(gè)過(guò)程耗力、耗時(shí)、不經(jīng)濟(jì)又繁瑣，每天 提取的樣品數(shù)量非常有限；另外，由于一些分子分析方法如PCR對(duì)污染非常敏感，提取大批 量材料時(shí)重復(fù)使用研缽?fù)鶗?huì)引起嚴(yán)重問(wèn)題。隨著分子生物學(xué)的高速發(fā)展和適應(yīng)不同研究 目的需要，提取DNA方法向著快速、簡(jiǎn)便、高效方向發(fā)展，現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)了很多在傳統(tǒng)的SDS 法、CTAB法基礎(chǔ)上的改良方法。但是這些方法偏重于提高制備DNA樣品的質(zhì)量，效率仍然 很低，每天研磨的樣品數(shù)量有限，當(dāng)樣品量多時(shí)經(jīng)常需要數(shù)人一起操作，效率有待提高。美 國(guó)一些研究單位目前采用球磨機(jī)提取DNA方法，效率可達(dá)每人每天上百份樣品。為了克服 常規(guī)方法制備DNA模板存在的諸多不足，農(nóng)業(yè)部甘蔗遺傳改良重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室從美國(guó)引進(jìn) 了球磨機(jī)配套提取DNA方法，以期高通量制備植物組織DNA，但在使用過(guò)程中出現(xiàn)了一些問(wèn)題，主要是引進(jìn)的球磨機(jī)配套提取DNA方案剪切葉片操作不方便，剪碎的葉片常常易散落 管外；處理時(shí)間長(zhǎng)，損傷葉片易褐化；主要適用于溫室或苗圃小苗期的幼嫩葉片，對(duì)于韌度 高、代謝旺盛的成熟甘蔗葉片效果不好；球磨機(jī)配套提取DNA方案中規(guī)定的葉片重量是200 mg，但一半以上甘蔗葉片無(wú)法磨碎，降低了提取的效率；球磨機(jī)配套提取DNA方案中采用美 國(guó)Crosman公司生產(chǎn)的鋼珠，購(gòu)買(mǎi)不方便，且放置較長(zhǎng)時(shí)間后易生銹，常使DNA著色；打磨時(shí) 間2 min得到的DNA片段長(zhǎng)度短，疑與研磨時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有關(guān)。綜上所述，引進(jìn)的球磨機(jī)提取DNA配套方案可能是一種通用的植物DNA提取方案， 該方法直接應(yīng)用于甘蔗葉片基因組DNA提取時(shí)，存在不太適應(yīng)的現(xiàn)象，表現(xiàn)在上述提到的 葉片前處理、葉片用量、研磨時(shí)間、鋼珠類型等方面均存在問(wèn)題，導(dǎo)致提取的基因組DNA純 度和濃度都很低，因此，需要針對(duì)甘蔗的特殊性進(jìn)行分離技術(shù)的優(yōu)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出一種利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，針對(duì)甘蔗的特殊 性進(jìn)行分離技術(shù)的優(yōu)化，從而克服了目前制備甘蔗DNA模板存在的磨樣麻煩、提取量低、純 度不高等缺點(diǎn)。該發(fā)明的具體操作步驟為(1)根據(jù)樣品數(shù)量，往1-45個(gè)2 mL的離心管中每管 放入1粒4 mm直徑不銹鋼珠子；(2)取50_100mg的新鮮甘蔗葉片放入各離心管中，蓋緊置 于液氮中預(yù)凍30 min-45 min ；(3)取出后迅速放入_20°C預(yù)凍的球磨機(jī)配套45孔研磨支 架上，在球磨機(jī)里打磨30 s-40 s，取出離心管置于冰上；(4)往各離心管中加人1.0 mL經(jīng) 65°C預(yù)熱的2 %CTAB提取緩沖液；(5)將離心管在65°C水浴40 min,期間每隔5 min顛倒 混合一次離心管；(6)每管加入SOOyL酚氯仿異戊醇混合液(體積比25 24 1)， 顛倒混勻至乳白色，室溫靜置10 min, 12, 000 r/min離心10 min，取800 μ L上清液轉(zhuǎn)移到 新的離心管中(可重復(fù)抽提一次)；(7)加入占上清液2/3體積的-20°C預(yù)冷的異丙醇，顛倒 混合，12，000 r/min離心10 min，棄上清液，或?qū)㈦x心管置于_20°C冰柜中1 h，用干凈tip 頭或牙簽挑出絮狀DNA ； (8)加入體積濃度為75 %乙醇600-1000 μ L，顛倒清洗DNA，12，000 r/min離心2_3 min,棄上清液(重復(fù)一次);(9)DNA完全晾干后加入100 μ L雙蒸水或TE溶 解，-20°C保存?zhèn)溆?。上述所用球磨機(jī)為美國(guó)BioSpec Products, Inc.生產(chǎn)的 Mini-Beadbeater 96 或其它原理相同的通過(guò)改變磁場(chǎng)引致金屬珠子高速往復(fù)運(yùn)行的研磨儀器；所用直徑4mm不 銹鋼珠子為鋼制珠子，可以在球磨機(jī)內(nèi)高速往復(fù)運(yùn)動(dòng)；葉片用量為50-100mg，不宜太多或 太少，否則研磨不徹底或提取DNA量少；球磨機(jī)里打磨時(shí)間在30 s-40 s左右，不宜太長(zhǎng)， 否則DNA易降解，步驟4)中所添加的提取緩沖液由2 % CTAB,20 mmol/L EDTA，0. lmol/L Tris-HCl, 1. 4mol/L NaCl 組成，pH=8. 0。本發(fā)明針對(duì)甘蔗葉片的特點(diǎn)，通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)操作步驟，建立了方便、快速的球磨機(jī) 高通量提取甘蔗DNA技術(shù)，為大批量甘蔗樣品的PCR檢測(cè)、Southern雜交等提供高質(zhì)量的 DNA模板，具有以下優(yōu)點(diǎn)
1)適用范圍廣大田生長(zhǎng)的甘蔗葉片或溫室幼嫩甘蔗葉片均可用本方法提取DNA；
2)操作簡(jiǎn)便易行葉片用量是一個(gè)范圍，根據(jù)預(yù)先稱量估算出60mg-100mg葉片的大 致面積，之后帶一次性手套，直接撕下大約面積的葉片即可；3)交叉污染率低由于不需要剪碎處理，既簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)，又有效地降低或避免了交叉污 染的發(fā)生；
4)取樣量少一次取樣量不超過(guò)100毫克，對(duì)受試材料傷害很小，不會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)造成影 響，完全可以滿足受試材料活體分析的需要。5)效率高球磨機(jī)配套45孔研磨支架一般情況下配4個(gè)，還可以根據(jù)需要增加； 從帶一次性手套、撕下大約面積的葉片，到放入2 mL的離心管，整個(gè)過(guò)程不足半分鐘；所以 制一板45個(gè)樣品不足半小時(shí)；進(jìn)行液氮預(yù)凍的時(shí)間，可繼續(xù)進(jìn)行下一板45個(gè)樣品的制備； 打磨只需要30秒，即可加入提取緩沖液進(jìn)入DNA提取過(guò)程。每人每天可制備多達(dá)500份甘 蔗葉片樣品用于提取DNA ；而傳統(tǒng)手工液氮研磨提取DNA方法樣品前處理需要剪碎葉片、手 工研磨、分裝、清洗烘干研缽等步驟，手工研磨還需要多次加入液氮，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，每人每天最 多制備幾十個(gè)甘蔗葉片樣品。改進(jìn)的方法顯然大大提高了效率。


圖1，2為性能測(cè)試圖。圖1為不銹鋼珠研磨效果左圖為研磨效果，右圖為氯仿異戊醇抽提效果。圖2為DNA提取效果圖60mg甘蔗葉片DNA電泳分析，Ma :TIANGEN, D15000 ； 1,2,3,4,5,6 :DNA 樣品。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的具體實(shí)施步驟為(1)根據(jù)樣品數(shù) 量，往1-45個(gè)2 mL的離心管中每管放入1粒4 mm直徑不銹鋼珠子；(2)取50-100mg的 新鮮甘蔗葉片放入各離心管中，蓋緊置于液氮中預(yù)凍30 min-45 min ； (3)取出后迅速放 入-20°C預(yù)凍的球磨機(jī)配套45孔研磨支架上，在球磨機(jī)里打磨30 s-40 s，取出離心管置于 冰上；(4)往各離心管中加人1. 0 mL經(jīng)65°C預(yù)熱的2 %CTAB提取緩沖液；(5)65°C水浴40 min,期間每隔5 min顛倒混合一次離心管；(6)每管加入800 μ L酚氯仿異戊醇混合液 (體積比25 24 1)，顛倒混勻至乳白色，室溫靜置10 min, 12, 000 r/min離心10 min, 取800 μ L上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中(可重復(fù)抽提一次)；(7)加入2/3體積-20°C預(yù)冷的 異丙醇，顛倒混合，12，000 r/min離心10 min，棄上清液；(8)加入75 %乙醇600-1000 μ L， 顛倒清洗DNA，12，000 r/min離心2-3 min,棄上清液(重復(fù)一次)；(9) DNA完全晾干后加入 100 μ L雙蒸水或TE溶解，-20°c保存?zhèn)溆谩Ｒ韵率潜景l(fā)明根據(jù)權(quán)利要求的幾個(gè)實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但是本發(fā)明不僅 限于此。實(shí)施例1
利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的具體實(shí)施步驟為(1)根據(jù)樣品數(shù)量，往20個(gè) 2 mL的離心管中每管放入1粒4 mm直徑不銹鋼珠子；(2)取50mg的新鮮甘蔗葉片放入各 離心管中，蓋緊置于液氮中預(yù)凍30 min ；(3)取出后迅速放入-20°C預(yù)凍的球磨機(jī)配套45 孔研磨支架上，在球磨機(jī)里打磨30 s，取出離心管置于冰上；(4)往各離心管中加人1.0 mL 經(jīng)65°C預(yù)熱的2 %CTAB提取緩沖液；(5) 65°C水浴40 min,期間每隔5 min顛倒混合一次 離心管；(6)每管加入800 μ L酚氯仿異戊醇混合液(體積比25 24 1)，顛倒混勻至乳白色，室溫靜置10 min，12，000 r/min離心10 min，取800 μ L上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管 中(可重復(fù)抽提一次);(7)加入2/3體積_20°C預(yù)冷的異丙醇，顛倒混合，12，000 r/min離心 10 min，棄上清液；(8)加入75 %乙醇600 μ L，顛倒清洗DNA，12，000 r/min離心2-3 min, 棄上清液(重復(fù)一次)；(9) DNA完全晾干后加入100 μ L雙蒸水或TE溶解，_20°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例2
(1)根據(jù)樣品數(shù)量，往35個(gè)2 mL的離心管中每管放入1粒4 mm直徑不銹鋼珠子；(2) 取75mg的新鮮甘蔗葉片放入各離心管中，蓋緊置于液氮中預(yù)凍38 min ； (3)取出后迅速放 入_20°C預(yù)凍的球磨機(jī)配套45孔研磨支架上，在球磨機(jī)里打磨35s左右，取出離心管置于 冰上；(4)往各離心管中加人1. 0 mL經(jīng)65°C預(yù)熱的2 %CTAB提取緩沖液；(5)65°C水浴40 min,期間每隔5 min顛倒混合一次離心管；(6)每管加入800 μ L酚氯仿異戊醇混合液 (體積比25 24 1)，顛倒混勻至乳白色，室溫靜置10 min, 12, 000 r/min離心10 min,取 800 μ L上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中(可重復(fù)抽提一次)；(7)加入2/3體積_20°C預(yù)冷的異 丙醇，顛倒混合，12，000 r/min離心10 min,棄上清液；(8)加入75 %乙醇800 μ L，顛倒清 洗DNA，12，000 r/min離心2-3 min，棄上清液(重復(fù)一次);(9)DNA完全晾干后加入IOOyL 雙蒸水或TE溶解，_20°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例3
(1)根據(jù)樣品數(shù)量，往45個(gè)2 mL的離心管中每管放入1粒4 mm直徑不銹鋼珠子；(2) 取IOOmg的新鮮甘蔗葉片放入各離心管中，蓋緊置于液氮中預(yù)凍45 min ;(3)取出后迅速放 入_20°C預(yù)凍的球磨機(jī)配套45孔研磨支架上，在球磨機(jī)里打磨40 s左右，取出離心管置于 冰上；(4)往各離心管中加人1. 0 mL經(jīng)65°C預(yù)熱的2 %CTAB提取緩沖液；(5)65°C水浴40 min,期間每隔5 min顛倒混合一次離心管；(6)每管加入800 μ L酚氯仿異戊醇混合液 (體積比25 24 1)，顛倒混勻至乳白色，室溫靜置10 min, 12, 000 r/min離心10 min, 取800 μ L上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中(可重復(fù)抽提一次)；(7)將離心管置于-20°C冰柜中 1 h，用干凈tip頭或牙簽挑出絮狀DNA于一新的離心管中；(8)加入75 %乙醇1000 μ L， 顛倒清洗DNA，12，000 r/min離心2_3 min,棄上清液(重復(fù)一次)；(9) DNA完全晾干后加入 100 μ L雙蒸水或TE溶解，-20°c保存?zhèn)溆谩?br> 權(quán)利要求
一種利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，其特征在于具體實(shí)施步驟如下(1)根據(jù)樣品數(shù)量，往1 45個(gè)2 mL的離心管中每管放入1粒4 mm直徑不銹鋼珠子；(2)取50 100mg的新鮮甘蔗葉片放入各離心管中，蓋緊置于液氮中預(yù)凍30 min 45 min；(3)取出后迅速放入 20℃預(yù)凍的球磨機(jī)配套45孔研磨支架上，在球磨機(jī)里打磨30 s 40 s，取出離心管置于冰上；(4)往各離心管中加人1.0 mL經(jīng)65℃預(yù)熱的提取緩沖液；(5)將離心管在65℃水浴40 min，期間每隔5 min顛倒混合一次離心管；(6)每管加入800μL酚﹕氯仿﹕異戊醇混合液，三種溶劑的體積比25﹕24﹕1，顛倒混勻至乳白色，室溫靜置10 min，12,000 r/min離心10 min，取800μL上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，可重復(fù)抽提一次；(7)加入占上清液2/3體積的 20℃預(yù)冷的異丙醇，顛倒混合，12,000 r/min離心10 min，棄上清液，或?qū)㈦x心管置于 20℃冰柜中1 h，用干凈tip頭或牙簽挑出絮狀DNA；(8)加入體積濃度為75%乙醇600 1000μL，顛倒清洗DNA，12,000 r/min離心2 3 min，棄上清液，重復(fù)操作一次；(9)DNA完全晾干后加入100μL雙蒸水或TE溶解， 20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，其特征 在于所用球磨機(jī)為美國(guó)BioSpec Products, Inc.生產(chǎn)的Mini-Beadbeater 96或其它原理 相同的通過(guò)改變磁場(chǎng)引致金屬珠子高速往復(fù)運(yùn)行的研磨儀器。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，其特征 在于所用直徑4 mm不銹鋼珠子為鋼制珠子，可以在球磨機(jī)內(nèi)高速往復(fù)運(yùn)動(dòng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，其特征 在于葉片用量為50-100mg，不宜太多或太少，否則研磨不徹底或提取DNA量少。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，其特征 在于球磨機(jī)里打磨時(shí)間在30 s-40 s，不宜太長(zhǎng)，否則DNA易降解。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，其特 征在于所述步驟4)中的提取緩沖液由2 % CTAB,20 mmol/L EDTA，0. lmol/L Tris-HCl, 1. 4mol/L NaCl 組成，pH=8. 0。
全文摘要
一種利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，是針對(duì)甘蔗的特殊性利用球磨機(jī)對(duì)其葉片基因組DNA進(jìn)行分離的技術(shù)。利用球磨機(jī)改變磁場(chǎng)使金屬珠子一次對(duì)多個(gè)甘蔗葉片樣品進(jìn)行研磨的特點(diǎn)，優(yōu)化了鋼珠直徑、液氮預(yù)處理時(shí)間、葉片用量、研磨時(shí)間等參數(shù)，建立了一種適合大批量提取甘蔗葉片基因組的方法。方法的主要步驟包括取樣、預(yù)凍、研磨、化學(xué)抽提等步驟。該方法克服了目前制備甘蔗基因組DNA存在的磨樣費(fèi)時(shí)費(fèi)力、操作繁瑣、葉片用量大、交叉污染率高、效率低等缺點(diǎn)，具有適用范圍廣，簡(jiǎn)便快速、污染率低、取樣量少等優(yōu)點(diǎn)，特別適宜于大批量快速制備甘蔗葉片基因組。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101899435SQ20101026584
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月30日
發(fā)明者方靜平, 王恒波, 許莉萍, 陳如凱, 陳平華, 陳由強(qiáng) 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)