專利名稱：生物芯片及其制備方法
生物芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物芯片及其制備方法。背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的用于制備生物芯片的載體主要有玻片、硅片、金屬片、尼龍膜等，硅片、金屬 片和尼龍膜芯片價格昂貴，普通芯片的載體常用玻璃芯片，但玻璃芯片易碎且包被的有機(jī) 薄膜容易脫落，探針分子不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容基于此，有必要提供一種固定的探針分子穩(wěn)定的生物芯片。同時，還有必要提供一種固定的探針分子穩(wěn)定的生物芯片制備方法。一種生物芯片，應(yīng)用多微孔板作為芯片載體，多微孔板的孔底固著有包被層，包被 層上固定有與待測物雜交的探針。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，包被層為多聚-L-賴氨酸層、金黃色葡萄球菌A蛋白層、鏈 霉親和素層、谷胱甘肽層、戊二醛修飾層或次氨基三乙酸_鎳離子層。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，探針以點(diǎn)陣列的形式固定在包被層上，其中，探針的固定方 式為隨機(jī)共價固定或定向固定。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，探針為基因類探針或蛋白類探針，蛋白類探針為抗體、融合 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽的重組蛋白、融合多聚組氨酸標(biāo)簽(His-tag)的重組蛋白、 生物素化的蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，多微孔板為96微孔板，96微孔板包括12個可拆卸的8孔 條，外部尺寸為128mmX86mm，96孔排列成12X8的陣列，96微孔板為聚苯乙烯、聚丙烯、丙 烯腈_苯乙烯_ 丁二烯共聚物或聚氯乙烯。一種生物芯片的制備方法，包括如下步驟S1.用酸液和乙醇對多微孔板進(jìn)行浸 泡清洗，并將浸泡清洗后的多微孔板進(jìn)行干燥處理；S2.生物芯片的包被及活化將多微孔 板放入包被液中浸泡后取出，干燥后制得固著有包被層的多微孔板，再將固著有包被層的 多微孔板放入與包被層物質(zhì)匹配的活化液中對包被層進(jìn)行活化處理；S3.探針的固定將 設(shè)計(jì)好的探針以點(diǎn)陣列的形式固定在包被層上。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，包被液是濃度為0. 01-0. 5%的多聚-L-賴氨酸去離子水溶 液或濃度為0. 01-0. 5%、pH為7. 4的多聚-L-賴氨酸的磷酸鹽溶液；對應(yīng)的活化液是濃度 為78. 8%的二甲基甲酰胺、11% N-羥基琥珀酰亞胺、10. 2%無水吡啶的混合液。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，包被液是濃度為0. 03%、pH為7. 4的金黃色葡萄球菌A蛋 白的磷酸鹽溶液或濃度為0. 03%, pH為7. 4的鏈霉親和素的磷酸鹽溶液或濃度為25%的 戊二醛溶液。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，包被液是濃度為2%的牛血紅蛋白磷酸鹽溶液、0. 1-1. OmM 的璜基琥珀酰亞胺酰-4-對馬來酰亞胺苯基丁酸鹽溶液及10-50mM的還原型谷胱甘肽磷酸鹽溶液；其中，牛血紅蛋白磷酸鹽溶液的PH為7. 4，璜基琥珀酰亞胺酰-4-對馬來酰亞胺苯 基丁酸鹽溶液的PH為7. 4，還原型谷胱甘肽磷酸鹽溶液的pH為6. 7。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，包被液是濃度為2%的牛血紅蛋白磷酸鹽溶液、50mM次氨 基三乙酸鈉的碳酸鈉溶液及200mM的硫酸鎳水溶液；其中，牛血紅蛋白磷酸鹽溶液的pH為 7. 4，次氨基三乙酸鈉的碳酸鈉溶液的pH為9. 6。通過將多微孔板塑料孔底固著包被層，再在所述包被層上點(diǎn)置探針分子，較傳統(tǒng) 的玻璃材料生物芯片，由于塑料與包被層吸附性好，則與包被層緊密結(jié)合的探針分子不易 脫落，性質(zhì)穩(wěn)定；同時由于塑料芯片不易破碎，待測樣品也不易丟失，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠、穩(wěn)定。探針分子的固定方式可選，通用的為隨機(jī)共價固定方式，優(yōu)選的為定向固定方式， 該方式可使固定化探針具有更好的均一性，且能最大程度地保持探針分子的生物活性。由 于普通ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶聯(lián)免疫吸附測定)96微孔板已被廣 泛使用，操作簡單、方便，且使用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測設(shè)備即可進(jìn)行檢測，檢測成本低，有利于大 范圍的推廣應(yīng)用。上述幾種包被液形成的包被層與多微孔板孔底具有良好的附著效果，從而固定的 探針分子性質(zhì)穩(wěn)定。

圖1為本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的生物芯片的俯視圖。圖2為生物芯片的制備方法流程圖。圖3為探針固著效果檢測結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式下面主要結(jié)合附圖和具體實(shí)施例說明生物芯片的結(jié)構(gòu)和制備方法。通過在ELISA用的多微孔板(如12、24、48、96、384微孔板等)孔底固著包被層， 再在所述包被層上點(diǎn)置探針分子，較傳統(tǒng)的玻璃材料生物芯片，由于塑料與包被層吸附性 好，探針分子不易脫落，同時由于塑料芯片不易破碎，待測樣品也不易丟失，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加
可靠、穩(wěn)定。如圖1所示為優(yōu)選的實(shí)施方式中生物芯片俯視圖，所用的多微孔板，與實(shí)驗(yàn)室常 用的標(biāo)準(zhǔn)ELISA多微孔板規(guī)格一致，如96微孔板外部尺寸為128mmX86mm，96個微孔每個 孔均為一芯片，一共排列成12X8陣列的芯片條，芯片條上每8個芯片孔為一組，可拆卸組 成12X8的陣列，每孔芯片上探針點(diǎn)置的陣列數(shù)可根據(jù)目標(biāo)物的數(shù)目進(jìn)行點(diǎn)置。微孔包括 芯片載體(圖中未示)、反應(yīng)框110、包被層120和探針130，所述反應(yīng)框110與孔底的芯片 載體一體設(shè)計(jì)，反應(yīng)框110為圓柱形，包被層120均勻覆蓋在芯片載體上方，包被層上固定 有探針130。優(yōu)選的，芯片載體與反應(yīng)框110為聚苯乙烯、聚丙烯、丙烯腈-苯乙烯-丁二 烯共聚物或聚氯乙烯材質(zhì)；芯片載體上可包被多聚-L-賴氨酸包被層，A蛋白層、谷胱甘肽 層、戊二醛包被層，鏈霉親和素包被層、次氨基三乙酸-鎳離子層，進(jìn)一步優(yōu)選鏈霉親和素 包被層120 ；探針130以點(diǎn)陣列的形式點(diǎn)置在所述包被層120上，包括基因類探針或蛋白類 探針，其中，蛋白類探針可以為抗體、融合GST標(biāo)簽的重組蛋白、融合His-tag的重組蛋白、生物素化的蛋白質(zhì)等。如圖2所示為生物芯片的制備方法流程，以包被層為鏈霉親和素的生物芯片為 例，具體制備過程如下S210，生物芯片的預(yù)處理首先將多微孔板用稀酸溶液和乙醇溶液浸泡清洗，清洗 后干燥待用。優(yōu)選的，稀酸溶液為10A的HCl溶液，乙醇選用70%的乙醇溶液。S220，生物芯片的包被準(zhǔn)備鏈霉親和素(140μΜ)的磷酸鹽溶液到芯片孔中，加 入EDC (碳二亞胺)和NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)(EDC NHS 鏈霉親和素=1. 2 1. 2 1， 摩爾比)，孵育1. 5小時后用蒸餾水沖洗芯片3遍，然后再用氮?dú)獯蹈尚酒砻婕纯捎糜邳c(diǎn) 置探針。S230，探針的固定將設(shè)計(jì)好的探針分子以點(diǎn)陣列的形式固定在包被層上。所述點(diǎn) 陣列可以為4Χ4、5Χ5等多種形式。此外，對于包被層為多聚-L-賴氨酸的生物芯片將多微孔板放入多聚-L-賴氨酸 溶液及活化液中浸泡后取出干燥即制得包被有多聚-L-賴氨酸層的多微孔板；其中，包被 液是濃度為0. 01-0. 5%的多聚-L-賴氨酸去離子水溶液或濃度為0. 01-0. 5%、ρΗ為7. 4的 多聚-L-賴氨酸的磷酸鹽溶液；活化液是濃度為78. 8%的二甲基甲酰胺、11% N-羥基琥珀 酰亞胺、10. 2 %無水吡啶的混合液。對于包被層為A蛋白的生物芯片將多微孔板放入A蛋白的磷酸鹽溶液浸泡后取 出干燥即制得包被有A蛋白層的多微孔板；其中，包被液是濃度為0. 03%、ρΗ為7. 4的A蛋 白磷酸鹽溶液，探針固定前無需活化過程。對于包被層為谷胱甘肽的生物芯片將多微孔板放入牛血紅蛋白磷酸鹽溶 液浸泡后，放入璜基琥珀酰亞胺酰-4-對馬來酰亞胺苯基丁酸鹽溶液中浸泡，取出后 再放入還原型谷胱甘肽的磷酸鹽溶液浸泡，干燥后即制得包被有谷胱甘肽層的多微 孔板；其中，包被溶液是濃度為2 %、ρΗ為7.4的牛血紅蛋白磷酸鹽溶液，0. 1-l.OmM PH為7.4的璜基琥珀酰亞胺酰-4-對馬來酰亞胺苯基丁酸鹽(sulphosuccinimidyl 4- (p-maleimidophenyl) -butyrate, SSMPB)溶液及 10_50mMpH 為 6. 7 的還原型谷胱甘肽磷 酸鹽溶液；探針固定前無需活化過程。對于包被層是戊二醛修飾的生物芯片將多微孔板 放入25%的戊二醛溶液浸泡，干燥后即得戊二醛修飾層的多微孔板；其中，包被液為25% 的戊二醛溶液；戊二醛溶液為市售商品化戊二醛試劑，無需調(diào)節(jié)PH ；探針固定前無需活化 過程；對于包被層是次氨基三乙酸_鎳離子的生物芯片將多微孔板放入牛血紅蛋白磷 酸鹽溶液浸泡后，放入次氨基三乙酸鈉的磷酸鹽溶液浸泡，取出再放入硫酸鎳溶液中浸泡， 取出干燥后即制得次氨基三乙酸-鎳離子層的多微孔板；其中，包被液是濃度為2%、pH為 7. 4的牛血紅蛋白磷酸鹽溶液，50mM ρΗ為9. 6次氨基三乙酸鈉的碳酸鈉溶液及200mM的硫 酸鎳水溶液；探針固定前無需活化過程。下面通過具體實(shí)驗(yàn)檢測多微孔板上探針的固著效果，以96微孔板為例。1).探針設(shè)計(jì)及合成本實(shí)施例中選擇志賀氏桿菌作為探針設(shè)計(jì)的來源，將志賀 氏桿菌DNA序列保守區(qū)域中的一段長約19bp的序列作為該實(shí)施例中用以固著的探針，序列 為5’ -ACGTGAAGTGGTCAGAAGC-3’ ；同時為了使探針分子在芯片上伸展開來，利于探針與目標(biāo)物擴(kuò)增序列的雜交，在探針5’端加上15個胸腺嘧啶T。按照上述設(shè)計(jì)的探針分子結(jié)構(gòu)， 在上海生物工程公司合成探針。2).點(diǎn)置前的探針準(zhǔn)備將步驟4)合成的探針分子溶解在雙蒸水中，最終濃度定 為20 μ M，取5 μ L上述探針溶液以及5 μ , 2x晶芯@基因芯片點(diǎn)樣液(北京博奧生物芯片 有限責(zé)任公司，產(chǎn)品目錄號440010)，并用移液器充分混合后，所得混合液即可用于生物芯 片的點(diǎn)樣。3).探針固定檢測實(shí)驗(yàn)用的生物芯片包括探針點(diǎn)和雜交質(zhì)控點(diǎn)，探針點(diǎn)用于與 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，雜交質(zhì)控點(diǎn)用于檢測雜交實(shí)驗(yàn)的成功與否。探針點(diǎn)和雜交質(zhì)控點(diǎn)以點(diǎn)陣 列的形式分布在芯片上，每個芯片包括4個雜交質(zhì)控點(diǎn)和1個探針點(diǎn)，4個雜交質(zhì)控點(diǎn)所采 用的探針為一段人工合成的寡核苷酸序列，雜交反應(yīng)液中含有其互補(bǔ)鏈，雜交反應(yīng)時該互 補(bǔ)鏈會與上述寡核苷酸序列結(jié)合，再經(jīng)后續(xù)的呈色反應(yīng)用以檢驗(yàn)雜交過程是否正確。雜交 質(zhì)控物探針及其互補(bǔ)鏈在上海生物工程公司合成。本實(shí)施例中共點(diǎn)置了四孔芯片，每孔芯 片的點(diǎn)陣皆相同，用以做比較，若四孔反應(yīng)結(jié)果皆相同，則表示結(jié)果準(zhǔn)確，若有不相同的孔 出現(xiàn)，則需重做實(shí)驗(yàn)。探針固定是用博奧生物有限公司生產(chǎn)的晶S SmartArrayerTM48微 陣列芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)按點(diǎn)樣步驟將上述已準(zhǔn)備好的探針混合液點(diǎn)置到已包被鏈霉親和素的 96微孔板片基上。點(diǎn)好樣的芯片37°C水合過夜，去離子水清洗2遍，將芯片放入硼酸鹽溶 液(1. Og NaBH4+300mL PBS+100mL無水乙醇)中孵育5分鐘，去離子水清洗2遍，空氣中干 燥后，即得到檢測用的芯片。4). PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的引物設(shè)計(jì)按照步驟4)設(shè)計(jì)探針的方法，同樣在志賀氏桿菌的 保守區(qū)域設(shè)計(jì)了一段長約619bp的序列作為PCR擴(kuò)增的區(qū)域，并據(jù)此設(shè)計(jì)出上下游引物，上 游引物為5’ -TAGAAGGCAGAGATGGAAGAGTT-3，，下游引物為5’ -GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAG TAC-3’。同時在引物標(biāo)記上生物素，用于后續(xù)的呈色反應(yīng)，引物及引物標(biāo)記在上海生物工程 公司合成及標(biāo)記。5).核酸提取核酸提取采用北京天恩澤基因科技有限公司的柱式細(xì)菌DNA提取 試劑盒提取(產(chǎn)品編號60802-50)，51).取1只1. 5mL離心管，于離心管內(nèi)加入ImL過夜培養(yǎng)的志賀氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)樣品， 8，000g/min離心5分鐘。52).去除上層液，加入0.3mL溶液A于管內(nèi)，吹打均勻，加入150yL溶液B，顛倒 混勻，加入0. 2mL自備氯仿，震蕩混勻半分鐘，室溫13，000g/min離心2分鐘。53).轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管中，加入1.5倍體積(約0.7mL)的溶液C+溶液D 的新鮮混合液，顛倒混勻后全部轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。54).室溫放置至少2分鐘后轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，離心1分鐘。55).用通用洗柱液洗1-2次后，加50-100 μ L通用洗脫液，室溫離心1分鐘即得樣 品DNA溶液。6).取200 μ L的PCR管兩只，于每管中加入上下游引物各0. 05 μ L, IOXPCRbuffer 5 μ L，MgCl2 (25mM) 5 μ L, d-NTPs (IOmM) 1 μ L,無菌水補(bǔ)水至 41. 5 μ L,然后加入 0. 5 μ L DNA 聚合酶，8 μ L志賀桿菌樣品核酸。依照下列條件設(shè)定PCR反應(yīng)程序先95°C 5分鐘，然后 95 0C 30秒，56 0C 30秒，72 V 30秒，35個循環(huán)，最后72 °C 5分鐘。
7).根據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原則，在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下，帶有生物素標(biāo)記的PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物與芯片上的互補(bǔ)探針結(jié)合形成穩(wěn)定的雙鏈，再與標(biāo)記有堿性磷酸酶的鏈霉親和素 反應(yīng)，通過鏈霉親和素與生物素的親和作用將堿性磷酸酶連接到芯片上，最后加入堿性磷 酸酶的底物 NBT/BCIP(NBT =Tetranitroblue tetrazolium chloride,四唑硝基藍(lán)；BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate, 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽)進(jìn)行氧化還 原反應(yīng)，反應(yīng)可產(chǎn)生肉眼可見的深藍(lán)色沉淀物質(zhì)，從而根據(jù)芯片上點(diǎn)陣的顏色對芯片的雜 交結(jié)果進(jìn)行判讀。具體方法如下將上述步驟6)中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于PCR儀器上加熱至95°C 5分鐘變性后，取出立 即置于冰上1分鐘，即得到PCR變性液；取出已點(diǎn)置完探針的96微孔板，于每孔內(nèi)加入上 述PCR變性液20 μ L，雜交反應(yīng)液200 μ L，共有四孔，故需PCR變性液80 μ L，雜交反應(yīng)液 800 μ L ；貼上膠膜，放入雜交箱內(nèi)，45°C雜交2小時，使樣品與探針充分反應(yīng)。雜交反應(yīng)液具 體配方為98. 9g 葡聚糖硫酸鈉(Dextran Sulfate Sodium)，1. 99g 馬來酸(Maleic acid), 2. Ig Na0H，0. 87gNaCl，6. 5g 硼酸(Boric acid)，IOg BSA (Bovine Serum Albumin，牛血清 蛋白)，溶于IOOOmL蒸餾水中。8).芯片呈色上述步驟7)雜交反應(yīng)結(jié)束后，撕開膠膜，將反應(yīng)液倒出。81).于每孔中加入200 μ L雙蒸水，用手來回震蕩微孔板20秒(以孔內(nèi)液體不溢 出為限)，然后用力甩干孔中的水分。82).于每孔中加入雜交洗滌緩沖液200 μ L，用手來回震蕩微孔板20秒(以孔內(nèi) 液體不溢出為限)，然后用力甩干孔中的水分，如上操作3遍。所述雜交洗滌緩沖液具體配 方為0.6g NaCl, 0. 7g NaH2PO4 · 2H20，8. 9g SDS (Sodium Dodecyl Sulfate，十二燒基硫酸 鈉)，IOOmL 20XSSC，溶于 IOOOmL蒸餾水中。所述20XSSC配制方法為175. 3g NaCl,88. 2g Na3C6H5O7 · 2H20(檸檬酸鈉，Sodium Citrate)，溶于 IOOOmL DEPC 水中，HCl 調(diào)節(jié) pH 至 7. 0， 高壓滅菌備用。83).于每孔中加入200 μ L類二次抗體混合液，類二次抗體混合液中含有標(biāo)記堿 性磷酸酶的鏈霉親和素(Str印tavidin-Alkaline phosphatase, Str印_Ap)，功能類似二 次抗體，同時還具有阻斷非特異性結(jié)合的作用。標(biāo)記堿性磷酸酶的鏈霉親和素會與標(biāo)記有 生物素的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行親和作用，使堿性磷酸酶能連接于芯片上。類二次抗體混合液 為類二次抗體原液與類二次抗體稀釋液混合所得。類二次抗體稀釋液具體配方為3. Ilg NaOH, 150mL 0. 1 % Tween-20, IOg BSA，溶于 IOOOmL 蒸餾水中；類二次抗體原液為 Str印-AP 的1000倍濃縮液，使用前與類二次抗體稀釋液以1 1000的比例混合，即得類二次抗體混 合液。84).于每孔中加入呈色原劑混合液200 μ L，混合液中含有NBT/BCIP，可與堿性 磷酸酶進(jìn)行氧化及還原反應(yīng)，反應(yīng)同時可產(chǎn)生肉眼可見的深藍(lán)色沉淀物質(zhì)。呈色原劑混 合液為呈色原劑原液與呈色原劑稀釋液混合所得。呈色原劑稀釋液具體配方為1.23g MgCl2 · 6H20,1. 32g NaCl，0. 8g HCl 溶于 IOOOmL 蒸餾水中；呈色原劑原液(NBT/BCIP)為 2. 4g NBT, 0. 5g BCIP，溶于IOOmLDMSO (二甲基亞砜)水溶液中，使用前與呈色原劑稀釋液 以1 50的比例混合，即得到呈色原劑混合液。9).結(jié)果分析
實(shí)驗(yàn)同時對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做了電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在設(shè)定的PCR條件下可以進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，這就確保了與已點(diǎn)置探針的芯片雜交的溶液里含有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若點(diǎn)陣上出現(xiàn) 顏色則表示固定有探針分子，反之則無。檢測結(jié)果如圖3所示，4個芯片上均在相同位置出現(xiàn)顏色，說明包被有鏈霉親和素 層的96微孔板固定生物探針效果良好。通過將多微孔板塑料孔底修飾包被層，再在所述包被層上點(diǎn)置探針分子，較傳統(tǒng) 的玻璃材料生物芯片，由于塑料與包被層吸附性好，則與包被層緊密結(jié)合的探針分子不易 脫落，性質(zhì)穩(wěn)定；同時由于塑料芯片不易破碎，待測樣品也不易丟失，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠、穩(wěn) 定；由于普通ELISA 96微孔板已被廣泛使用，操作簡單、方便，且使用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測設(shè)備 即可進(jìn)行檢測，檢測成本低，有利于大范圍的推廣應(yīng)用。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
一種生物芯片，其特征在于，應(yīng)用多微孔板作為芯片載體，所述多微孔板的孔底固著有包被層，所述包被層上固定有與待測物雜交的探針。
2.如權(quán)利要求1所述的生物芯片，其特征在于，所述包被層為多聚-L-賴氨酸層、金黃 色葡萄球菌A蛋白層、鏈霉親和素層、谷胱甘肽層、戊二醛修飾層或次氨基三乙酸-鎳離子層。
3.如權(quán)利要求1所述的生物芯片，其特征在于，所述探針以點(diǎn)陣列的形式固定在所述 包被層上，其中，探針的固定方式為隨機(jī)共價固定或定向固定。
4.如權(quán)利要求1或3所述的生物芯片，其特征在于，所述探針為基因類探針或蛋白類探 針，所述蛋白類探針為抗體、融合谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽的重組蛋白、融合多聚組氨酸標(biāo) 簽的重組蛋白或生物素化的蛋白質(zhì)。
5.如權(quán)利要求1所述的生物芯片，其特征在于，所述多微孔板為96微孔板，所述96微 孔板包括12個可拆卸的8孔條，外部尺寸為128mmX86mm，96孔排列成12X8的陣列，所述 96微孔板為聚苯乙烯、聚丙烯、丙烯腈-苯乙烯-丁二烯共聚物或聚氯乙烯。
6.一種生物芯片的制備方法，其特征在于，包括如下步驟51.用酸液和乙醇對多微孔板進(jìn)行浸泡清洗，并將浸泡清洗后的多微孔板進(jìn)行干燥處理；52.生物芯片的包被及活化將多微孔板放入包被液中浸泡后取出，干燥后制得固著 有包被層的多微孔板，再將固著有包被層的多微孔板放入與包被層物質(zhì)匹配的活化液中對 包被層進(jìn)行活化處理；53.探針的固定將設(shè)計(jì)好的探針以點(diǎn)陣列的形式固定在所述包被層上。
7.如權(quán)利要求6所述的生物芯片的制備方法，其特征在于，所述包被液是濃度為 0. 01-0. 5%的多聚-L-賴氨酸去離子水溶液或濃度為0. 01-0. 5%、pH為7. 4的多聚-L-賴 氨酸的磷酸鹽溶液；對應(yīng)的所述活化液是濃度為78. 8%的二甲基甲酰胺、11% N-羥基琥珀 酰亞胺、10. 2 %無水吡啶的混合液。
8.如權(quán)利要求6所述的生物芯片的制備方法，其特征在于，所述包被液是濃度為 0. 03%,pH為7. 4的金黃色葡萄球菌A蛋白的磷酸鹽溶液或濃度為0. 03%,pH為7. 4的鏈 霉親和素的磷酸鹽溶液或濃度為25%的戊二醛溶液。
9.如權(quán)利要求6所述的生物芯片的制備方法，其特征在于，所述包被液是濃度為2%的 牛血紅蛋白磷酸鹽溶液、0. 1-1. OmM的璜基琥珀酰亞胺酰-4-對馬來酰亞胺苯基丁酸鹽溶 液及10_50mM的還原型谷胱甘肽磷酸鹽溶液；其中，牛血紅蛋白磷酸鹽溶液的pH為7. 4，璜 基琥珀酰亞胺酰-4-對馬來酰亞胺苯基丁酸鹽溶液的pH為7. 4，還原型谷胱甘肽磷酸鹽溶 液的PH為6. 7。
10.如權(quán)利要求6所述的生物芯片的制備方法，其特征在于，所述包被液是濃度為2% 的牛血紅蛋白磷酸鹽溶液、50mM次氨基三乙酸鈉的碳酸鈉溶液及200mM的硫酸鎳水溶液； 其中，所述牛血紅蛋白磷酸鹽溶液的PH為7. 4，所述次氨基三乙酸鈉的碳酸鈉溶液的pH為 9. 6。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物芯片及其制備方法，所述芯片應(yīng)用多微孔板作為芯片載體，多微孔板的每個孔底包被有包被層，包被層上固定有與待測物雜交的探針。通過在ELISA用的多微孔板塑料孔底固著包被層，再在所述包被層上點(diǎn)置探針分子，較傳統(tǒng)的玻璃材料生物芯片，由于塑料與包被層吸附性好，探針分子不易脫落，同時芯片不易破碎，待測樣品也不易丟失，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠、穩(wěn)定。
文檔編號C12Q1/68GK101942513SQ201010267019
公開日2011年1月12日 申請日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者莊衛(wèi)東, 張巍, 李永進(jìn), 楊澤, 顧大勇 申請人:深圳博爾美生物科技有限公司