專利名稱：牡蠣酶解物的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備一種具備延緩衰老活性的牡蠣蛋白酶解物的方法，可以作為抗氧 化、延緩衰老營養(yǎng)素或藥物添加，屬于海洋生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
牡蠣，俗稱海蠣子、蠔，是世界上第一大養(yǎng)殖貝類，也是我國四大養(yǎng)殖貝類之一，廣 泛分布于我國遼寧、山東、福建及廣東沿海等地。牡蠣肉嫩味鮮，藥食兼用，在我國已有幾百 年的歷史，素有“海中牛奶”的美稱，是我國首批列為藥食同源的保健療效食品之一。牡蠣 的蛋白質(zhì)含量可高達50 %，且氨基酸組成完全。牡蠣肉中還含有豐富的糖原、二十二碳六烯 酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)等不飽和脂肪酸、維生素以及硒和鋅等礦物質(zhì)。近十年來， 酶制劑在海洋貝類資源加工過程中得到了普遍的應(yīng)用，貝類蛋白酶解工藝及其酶解物功效 的研究不斷進展。目前，酶解技術(shù)已經(jīng)成為海洋貝類蛋白資源高值化、資源化、生態(tài)化開發(fā) 利用的重要手段。但是，如何借鑒和突破傳統(tǒng)酶解技術(shù)與工藝，對海洋貝類蛋白資源的綠色 高值化開發(fā)，仍是我國貝類資源綜合利用中一個重要的研究領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以牡蠣粉為原料，采用組合酶解技術(shù)獲得牡蠣酶解物，顯著優(yōu)于各種單一 酶水解的效果。通過各種抗氧化檢測體系確證了牡蠣組合酶解物具有顯著的抗氧化活性； 并采用果蠅生存實驗、小鼠肝組織中過氧化脂質(zhì)含量和抗氧化酶活性等指標的測定，確證 牡蠣組合酶解物具有顯著的延緩衰老活性。選擇此新工藝制備的酶解物具有的顯著生物活 性，可實現(xiàn)牡蠣的高值化利用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)手段實現(xiàn)的，組合酶解工藝以牡蠣粉于水中配成蛋白質(zhì) 量分數(shù)為2%的水溶液，反應(yīng)器中52. 5°C _55°C水浴浸泡30分鐘，然后先后或同時加入組 合蛋白酶進行水解；各蛋白酶的加酶量為6000-8000U/g底物蛋白，用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH 6. 0-7. 0，反應(yīng)溫度為52. 5-55°C的條件下水解2小時，煮沸IOmin滅酶；離心各酶解液，取 上清液用截留分子量為IkDa的超濾膜超濾，截留液進行噴霧干燥，獲得牡蠣酶解物；其中 所述的組合蛋白酶為中性蛋白酶與復(fù)合風味酶。優(yōu)選在溫度55°C，pH6. 0，同時加入兩種酶 量為6000U/g底物蛋白的中性蛋白酶與復(fù)合風味酶。上述牡蠣酶解物的應(yīng)用之一，以其清除DPPH ·、· 0H、超氧陰離子自由基作用及其 還原能力為依據(jù)，結(jié)合小鼠肝勻漿檢測體系測定，證明了牡蠣酶解物具有較強的體外抗氧 化活性，可以制備具有抗氧化活性的食品、食品配料或保健品。上述牡蠣酶解物的應(yīng)用之二，經(jīng)延緩衰老評價，以果蠅的生存試驗、過氧化脂質(zhì)含 量測定和抗氧化酶活力測定三個方面為評價指標，確證了牡蠣酶解物提高果蠅的平均壽命 及最高壽命；提高小鼠體內(nèi)SOD活性，降低小鼠體內(nèi)MDA的含量，具有延緩衰老的作用，可以 制備具有延緩衰老作用的營養(yǎng)食品。本發(fā)明的有益效果牡蠣粉經(jīng)組合蛋白酶酶解后，其肽得率與抗氧化活性都得以提高，并具備明顯的延緩衰老的作用。本發(fā)明具有原料來源廣泛、制作成本低、制備工藝簡單、效率高、無污染等優(yōu)點，符 合大規(guī)模生產(chǎn)要求，容易實施。所制牡蠣酶解物既可以作為具有延緩衰老的營養(yǎng)食品直接 食用，也可以作為食品配料或保健品。


圖1是本發(fā)明的工藝流程圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步闡述本發(fā)明中使用的蛋白酶，包括中性蛋白酶(酶活力為16.0萬U/g)、堿性蛋白酶 (酶活力為154. 64萬U/mL)、復(fù)合風味酶(酶活力為6. 9萬U/g)由無錫杰能科酶制劑有限 公司提供；胰蛋白酶(酶活力為26. 26萬U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力為4. 96萬U/g)和胃 蛋白酶(酶活力為1.6萬U/g)由上?；瘜W(xué)試劑公司提供。對比例1牡蠣中性蛋白酶酶解物的制備準確稱取干燥的牡蠣粉，加水配成蛋白質(zhì)量分數(shù)為2%的水溶液，放入反應(yīng)器中， 55°C水浴浸泡30分鐘，按照酶與底物蛋白質(zhì)量比為8000U/g的量加入中性蛋白酶，用磷酸 緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH至7. 0 ；置于恒溫水浴鍋中55°C下酶解2小時，酶解物加熱煮沸10分 鐘滅酶，6000r/min離心15分鐘，上清液用截留分子量IkDa的超濾膜超濾、脫鹽，截留液 進行濃縮、噴霧干燥，獲牡蠣酶解物。水解牡蠣粉的肽得率為46. 8%，羥自由基清除率為 90. 9%。對比例2牡蠣復(fù)合風味酶酶解物的制備準確稱取干燥的牡蠣粉，加水配成蛋白質(zhì)量分數(shù)為2%的水溶液，放入反應(yīng)器中， 50°C水浴浸泡30分鐘，按照酶與底物蛋白質(zhì)量比為8000U/g的量加入復(fù)合風味酶，用磷酸 緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH至6. 0 ；置于恒溫水浴鍋中50°C下酶解2小時，酶解液加熱煮沸10分 鐘滅酶，6000r/min離心15分鐘，上清液用截留分子量IkDa的超濾膜超濾、脫鹽，截留液 進行濃縮、噴霧干燥，獲得牡蠣酶解物。水解牡蠣粉的肽得率為42.2%，羥自由基清除率為 88. 6%。實施例3牡蠣組合酶解物的制備準確稱取干燥的牡蠣粉，加水配成蛋白質(zhì)量濃度為2%水溶液，55°C水浴浸泡30 分鐘，先按酶與底物蛋白質(zhì)量比為8000U/g加入中性蛋白酶，用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH 7.0，置 于恒溫水浴鍋中55°C下酶解水解120min ；再加入8000U/g的復(fù)合風味酶，在溫度50°C、pH 6. 0，水解120min。酶解物加熱煮沸10分鐘滅酶，6000r/min離心15分鐘，上清液用截留分 子量IkDa的超濾膜超濾、脫鹽，截留液進行濃縮、噴霧干燥，獲得牡蠣酶解物。水解牡蠣粉 的肽得率為53. 6%，羥自由基清除率為98. 2%。實施例4
4
牡蠣組合酶解物的制備準確稱取干燥的牡蠣粉，加水配成蛋白質(zhì)量濃度為2%水溶液，55°C水浴浸泡30 分鐘，先按酶與底物蛋白質(zhì)量比為8000U/g加入復(fù)合風味酶，用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH 6.0，置 于恒溫水浴鍋中50°C下酶解水解120min ；再加入8000U/g的中性蛋白酶，在溫度55°C、pH 7. 0，水解120min。酶解物加熱煮沸10分鐘滅酶，6000r/min離心15分鐘，上清液用截留分 子量IkDa的超濾膜超濾、脫鹽，截留液進行濃縮、噴霧干燥，獲得牡蠣酶解物。水解牡蠣粉 的肽得率為49. 1 %，羥自由基清除率為98. 4%。實施例5牡蠣組合酶解物的制備準確稱取干燥的牡蠣粉，加水配成蛋白質(zhì)量濃度2%水溶液，放入反應(yīng)器中， 52. 5°C水浴浸泡30分鐘，按每種酶與底物蛋白質(zhì)量比為6000U/g底物蛋白的加酶量，同 時加入中性蛋白酶和復(fù)合風味酶，用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)溶液PH至6.0;置于恒溫水浴鍋中 52. 5°C下酶解2小時，酶解物煮沸10分鐘滅酶活，6000r/min離心15分鐘，上清液用截留分 子量IkDa的超濾膜超濾、脫鹽，截留液進行濃縮、噴霧干燥，獲牡蠣酶解物。水解牡蠣粉的 肽得率為92. 7%，羥自由基清除率為99. 8%。實施例6牡蠣組合酶解物的制備準確稱取干燥的牡蠣粉，加水配成濃度2%水溶液，放入反應(yīng)器中，52. 5°C水浴浸 泡30分鐘，按每種酶與底物蛋白質(zhì)量比為6000U/g底物蛋白的加酶量，同時加入中性蛋白 酶和復(fù)合風味酶，用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH至7. 0 ；置于恒溫水浴鍋中52. 5°C下酶解2小 時，酶解物煮沸10分鐘滅酶活，6000r/min離心15分鐘，上清液用截留分子量IkDa的超濾 膜超濾、脫鹽，截留液進行濃縮、噴霧干燥，獲牡蠣酶解物。水解牡蠣粉的肽得率為90. 3%, 羥自由基清除率為91.8%。酶解物活性試驗舉例(以測定實施例5中制備的材料為例)。試驗1 清除DPPH自由基(DPPH ·)試驗取實施例5所制備得到的牡蠣酶解物，配制濃度為1. 0mg/mL、2. 0mg/mL、3. Omg/ mL、4. 0mg/mL、6. Omg/mL的溶液，DPPH溶液濃度為0. 04g/L,溶劑為無水乙醇，檢測波長為 517nm。清除率計算公式為K = [1-(Ai-Aj) /A0] X 100式中K為對DPPH自由基的清除率，％ ；A0為2mL的DPPH無水乙醇溶液加2mL無 水乙醇的吸光值A(chǔ)i為2mL的DPPH無水乙醇溶液加2mL水解蛋白溶液的吸光值；Aj為2mL 無水乙醇加2mL水解蛋白溶液的吸光值。每個樣品重復(fù)測定三次求平均值。由試驗結(jié)果(見表1)可知，當牡蠣酶解物濃度為6. Omg/mL時，其對DPPH ·的清除 率達到了 92. 3%，說明酶解物對DPPH自由基有較強的清除能力。試驗2 清除羥自由基(· OH)的試驗取實施例5所制備得到的牡蠣酶解物，配制濃度分別為1. Omg/mL,2. Omg/mL、 3. Omg/mL,4. Omg/mL,6. Omg/mL。各取2mL上述濃度的水解溶液，依次加入2mL 6mmol/L 的FeS04、2mL 6mmol/L的H2O2，混勻后靜置lOmin，再加入2mL 6mmol/L水楊酸，混勻，靜置 30min，在510nm處測其吸光值記為Ai,當用雙蒸水代替水楊酸時的吸光值記為A」?？瞻讓φ战M以雙蒸水代替水解蛋白溶液，吸光值記為K00按照下式計算水解蛋白對羥自由基的清 除率K K = [1-(Ai-Aj) /A0] X 100由表1的結(jié)果可知，牡蠣酶解物具有較強的清除羥自由基的能力，其對·0Η自由基 的最大清除率可達95.4%。試驗3 清除超氧陰離子(· 02_)的試驗取實施例5所制備得到的牡蠣酶解物，配制濃度分別為1. 0mg/mL、2. Omg/mL、 3. Omg/mL,4. Omg/mL,6. Omg/mL 的樣品溶液。取 4. 50ml 濃度為 0. lmol/L 的 Tris-HCl 緩沖 溶液(pH8. 2)于試管中，在25°C水浴中預(yù)熱20min，加入Iml待測樣品溶液，0. 5mL濃度為 2. 5mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻后，在25°C水浴中準確反應(yīng)4min后，立即加入lOmol/L的 HCl溶液0. ImL終止反應(yīng)，以pH 8. 2的Tris-HCl緩沖液調(diào)零，在波長325nm下測定吸光值。
對照組用0. 5mL蒸餾水代替鄰苯三酚溶液，同時設(shè)立試劑空白管。清除率計算公式為
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權(quán)利要求
牡蠣酶解物的制備方法，其特征在于采用組合酶解工藝，包括以下步驟以牡蠣粉于水中配成蛋白質(zhì)量分數(shù)為2％的水溶液，反應(yīng)器中52.5℃ 55℃水浴浸泡30分鐘，然后先后或同時加入組合蛋白酶進行水解；各蛋白酶的加酶量為6000 8000U/g底物蛋白，用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH 6.0 7.0，反應(yīng)溫度為52.5 55℃的條件下水解2小時，煮沸10min滅酶；離心各酶解液，取上清液用截留分子量為1kDa的超濾膜超濾，截留液進行噴霧干燥，獲得牡蠣酶解物；其中所述的組合蛋白酶為中性蛋白酶與復(fù)合風味酶。
2.權(quán)利要求1所述的牡蠣酶解物的制備方法，其特征在于在溫度55°C，pH6.0，同時加 入兩種酶量為6000U/g底物蛋白的中性蛋白酶與復(fù)合風味酶進行酶解。
3.權(quán)利要求1或2所述的牡蠣酶解物的應(yīng)用，可以制備具有抗氧化活性的食品、食品配 料或保健品。
4.權(quán)利要求1或2所述的牡蠣酶解物的應(yīng)用，可以制備具有延緩衰老的營養(yǎng)食品或保 健品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備具有抗氧化和延緩衰老活性的牡蠣酶解物的方法及應(yīng)用，包括以下步驟以干燥的牡蠣粉為原料，配成蛋白質(zhì)量分數(shù)為2％的水溶液，52.5-55℃水浴浸泡30分鐘，然后以組合蛋白酶先后或同時水解；各蛋白酶的加酶量為6000-8000U/g底物蛋白，調(diào)pH 6.0-7.0，溫度為52.5-55℃下水解2小時，酶解液離心后，上清液用截留分子量為1kDa的超濾膜超濾；截留液進行噴霧干燥，獲得牡蠣酶解物?？梢杂脕碇苽渚哂锌寡趸钚缘氖称诽砑觿┗蛘呔哂醒泳徦ダ系臓I養(yǎng)食品。本發(fā)明具有原料來源廣泛、制備工藝簡單、效率高、無污染等優(yōu)點；酶解物具有較強的抗氧化活性及明顯的延緩衰老作用。
文檔編號A23L1/29GK101972004SQ20101026870
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月1日
發(fā)明者周越, 孫芳芳, 董英 申請人:江蘇大學(xué)