專利名稱：一種提取棉花線粒體及其rna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)，具體涉及一種提取棉花線粒體及其RNA的方法。
背景技術(shù)：
線粒體(mitochondria)是高等生物最重要的細胞器，是細胞質(zhì)半自主的遺傳系統(tǒng)之一。線粒體是生物進行呼吸的重要細胞器，具有相對獨立的遺傳物質(zhì)，同時受到細胞核基因的調(diào)控。植物細胞中，線粒體RNA僅占總RNA的約1%。因此，分離出高純度的線粒體 RNA(mtRNA)，對于構(gòu)建線粒體的cDNA文庫、研究線粒體的轉(zhuǎn)錄本等都是必需的。棉花組織細胞富含棉酚、丹寧等次生代謝產(chǎn)物，極易被氧化；在其組織細胞破碎時這些次生代謝產(chǎn)物能與DNA或RNA結(jié)合形成穩(wěn)定的粘稠褐色復(fù)合物。因此，和其他一些作物相比，棉花線粒體DNA和線粒體RNA的提取都較為困難，目前還沒有關(guān)于棉花mtRNA提取方法的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提取棉花線粒體及其RNA的方法。本發(fā)明提供的提取棉花線粒體的方法，包括如下步驟(1)將棉花黃化苗的根進行液氮研磨，然后加入4°C預(yù)冷的溶液甲，振蕩混勻，冰上靜置2-30min ；溶液甲由溶液A和蛋白酶K組成，蛋白酶K的濃度為0. 01-lmg/mL ；(2)4 °C、500-2000Xg 離心 5_40min，取上清液；然后 4 °C、1000-4000Xg 離心 5-40min，取上清液；然后4°C、8000-30000 X g離心15_120min，取沉淀物；(3)用溶液A洗滌重懸沉淀物，8000-30000Xg離心15-120min，收集沉淀物，即為線粒體；所述步驟(1)和步驟(3)中的溶液A 由 NaCl、Tris-HCl、EDTA-Na2, DEPC 水、 PVP-40、BSA和β -巰基乙醇組成；溶液A中，NaCl的濃度為0. 5-2. Omol/L，Tris-HCl的濃度為 0. 01-1. OOmol/L5EDTA-Na2 的濃度為 0. 5_4mmol/L，PVP-40 的濃度為 0. 5-5% (體積百分含量)，BSA的濃度為0. 05-0. 5% (體積百分含量)，β -巰基乙醇的濃度為1-lOmmol/L。所述步驟(1)中，冰上靜置的時間為2-5min或5-30min，優(yōu)選為5min ；所述步驟 (3)中的離心條件為 8000-16000 X g 離心 15_40min 或 16000-30000 X g 離心 40_120min，優(yōu)選為16000父8離心40111土11 ；所述步驟(2)為:4°C、500_1000 X g離心5-lOmin，取上清液；然后 4°C、1000-2600Xg 離心 5_15min，取上清液；然后 4°C、8000_16000Xg 離心 15_40min， 取沉淀物；或所述步驟O)為4°C、1000-2000Xg離心10-40min，取上清液；然后4°C、 2600-4000 Xg 離心 15-40min，取上清液；然后 4°C、16000-30000 X g 離心 40_120min，取沉淀物；所述步驟(2)優(yōu)選為4°C、1000Xg離心lOmin，取上清液；然后4°C、2600Xg離心 15min,取上清液；然后4°C、16000 X g離心40min，取沉淀物。所述棉花黃化苗的根、所述溶液甲和所述溶液A的配比為5-10克棉花黃化苗的根5-45ml溶液甲5-50ml溶液A。所述棉花黃化苗的根、所述溶液甲和所述溶液A的配比為5-10克棉花黃化苗的根5-30ml溶液甲5_20ml溶液A ；或所述棉花黃化苗的根、 所述溶液甲和所述溶液A的配比為5-10克棉花黃化苗的根30-45ml溶液甲20_50ml 溶液A ；所述棉花黃化苗的根、所述溶液甲和所述溶液A的配比優(yōu)選為5克棉花黃化苗的根30ml溶液甲20ml溶液A。所述溶液A中，NaCl 的濃度為 0. 5-1. ^nol/L或 1. 2-2. Omol/L,Tris-HCl 的濃度為 0. 01-0. 05mol/L 或 0. 05-lmol/L, EDTA-Na2 的濃度為 0. 5_2mmol/L 或 2_4mmol/L，PVP-40 的濃度為0. 5-2.5% (體積百分含量)或2. 5-5% (體積百分含量)，BSA的濃度為0. 05-0. 1% (體積百分含量)或0. 1-0.5% (體積百分含量)，β-巰基乙醇的濃度為l-5mmol/L或 5-lOmmol/L ；所述溶液甲中，蛋白酶K的濃度為0.01-0. lmg/mL或0. 1-lmg/mL ；所述溶液A 中，NaCl的濃度優(yōu)選為1. 2mol/L, Tris-HCl的濃度優(yōu)選為0. 05mol/L, EDTA-Na2的濃度優(yōu)選為2mmol/L，PVP-40的濃度優(yōu)選為2. 5% (體積百分含量)，BSA的濃度優(yōu)選為0. (體積百分含量)，β -巰基乙醇的濃度優(yōu)選為5mmol/L ；所述溶液甲中，蛋白酶K的濃度優(yōu)選為 0. lmg/mL。所述棉花為陸地棉鄂抗棉12或中棉所12。本發(fā)明還保護一種提取棉花線粒體RNA的方法，是將以上所述方法得到的棉花線粒體提取RNA，得到棉花線粒體RNA。所述提取RNA的方法為如下(a)或(b)(a)包括如下步驟①加入2-20ml (如2_5ml或5_20ml)溶液B懸浮所述棉花線粒體，65 V水浴 5-40min (如 5_10min 或 10_40min)裂解；②加入0. 05-1. Omg(如 0. 05-0. 5mg 或 0. 5-1. Omg)蛋白酶 K，37°C水浴 2_15min， 冰浴 2-20min (如 2_5min 或 5_20min)；③加入與步驟②的溶液等體積的水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液混勻， 8000-30000Xg(如 8000-18514Xg 或 18514-30000Xg)離心 5_30min(如 5_15min 或 15-30min)，取上層水相；④加入與水相等體積的氯仿-異戊醇溶液混勻，8000-30000 X g (如 8000-18514Xg 或 18514-30000X g)離心 5_30min (如 5-10min 或 10_30min)，取上層水相 600-800 μ 1 (如 600-700 μ 1 或 700-800 μ 1)； ⑤加入體積為水相體積1/4的IOM LiCl水溶液，混勻，4°C靜置；⑥4 °C、8000-30000Xg(如 8000-14000 Xg 或 14000-30000 X g)離心 15-120min (如 15_40min 或 40_120min)，取沉淀；⑦加入700μ1 0.5% (質(zhì)量百分含量)SDS水溶液，冰浴5min;加入700μ1氯仿-異戊醇溶液，混勻，4"C、8000-30000 X g (如 8000-14000 X g 或 14000-30000 X g)離心 5-40min (如 5_20min 或 20_40min)，取上清液；⑧加入2倍體積無水乙醇，-70°C靜置15-120min (如15_40min或40_120min)。⑨4 °C、8000-30000Xg(如 8000-20000 Xg 或 20000-30000 X g)離心 15-120min (如 15_40min 或 40_120min)，取沉淀；⑩70 % (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀，8000_30000Xg(如 8000-20000Xg 或 20000-30000Xg)離心 5_60min(如 5-lOmin 或 10_60min)，收集沉淀即為棉花線粒體RNA ；(b)包括如下步驟①加入2-20ml (如2_5ml或5_20ml)溶液B懸浮所述棉花線粒體，65 V水浴 5-40min (如 5_10min 或 10_40min)裂解；②加入0. 05-1. Omg(如 0. 05-0. 5mg 或 0. 5-1. Omg)蛋白酶 K，37°C水浴 2_15min， 冰浴 2-20min (如 2_5min 或 5_20min)；③加入與步驟②的溶液等體積的水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液混勻， 8000-30000Xg(如 8000-18514Xg 或 18514-30000Xg)離心 5_30min(如 5-lOmin 或 10-30min)，取上層水相；④加入與水相等體積的氯仿-異戊醇溶液，8000-30000Xg(如8000-18514Xg或 18514-30000 Xg)離心 5_30min (如 5-10min 或 10_30min)，取上層水相；⑤加入1-6M(如1-3M或3_6M)pH5. 2乙酸鈉水溶液，乙酸鈉水溶液的體積為水相體積的十分之一，混勻后再加入2-2. 5倍體積無水乙醇，_20°C靜置；⑥40C >8000-30000 X g (如 8000-20000 X g 或 20000-30000 X g)離心 5_60min (如 5-30min 或 30_60min)，取沉淀；⑦70 % (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀，8000_30000Xg(如 8000-20000Xg 或 20000-30000Xg)離心 5_60min(如 5-lOmin 或 10_60min)，收集沉淀即為棉花線粒體RNA ；所述(a)和(b)中，所述溶液B由1~1^8-!1(1丄01六-恥2、07^、妝(1、亞精胺、？￥ -40、 DEPC水和β-巰基乙醇組成；所述溶液B中，Tris-HCl的濃度為20-200mmol/L，EDTA-Na2 的濃度為5-50mmol/L，CTAB的濃度為0. 05-1. Og/L, NaCl的濃度為0. 5_5mol/L，亞精胺的濃度為0. 1-1. 0g/L，PVP-40的濃度為5-30g/L，β -巰基乙醇的濃度為0. 5-15mmol/L ；所述
(a)和(b)中，所述氯仿-異戊醇溶液由M體積份氯仿與1體積份異戊醇組成；所述(a)和
(b)中，所述水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液由25體積份水飽和酚、M體積份氯仿和1體積份異戊醇組成。所述提取RNA的方法具體為如下(a)或(b)(a)包括如下步驟①加入5ml溶液B懸浮所述棉花線粒體，65°C水浴IOmin裂解；②加入0. 5mg蛋白酶K，37°C水浴2min，冰浴5min ；③加入與步驟②的溶液等體積的水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液混勻，18514Xg離心15min，取上層水相； ④加入與水相等體積的氯仿-異戊醇溶液輕輕混勻，18514 X g離心lOmin，取上層水相700ml ；⑤加入體積為水相體積1/4的IOM LiCl水溶液，混勻，4°C靜置；⑥4°C、14000 X g 離心 40min，取沉淀；⑦加入700μ1 0.5% (質(zhì)量百分含量)SDS水溶液，冰浴5min;加入700μ1氯仿-異戊醇溶液，混勻，40C、14000 X g離心20min，取上清液；⑧加入2倍體積無水乙醇，_70°C靜置40min。⑨4°C、20000Xg 離心 40min，取沉淀；
⑩70% (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀，20000Xg離心lOmin，收集沉淀即為棉花線粒體RNA ；(b)包括如下步驟①加入5ml溶液B懸浮所述棉花線粒體，65°C水浴IOmin裂解；②加入0. 5mg蛋白酶K，37°C水浴2min，冰浴5min ；③加入與步驟②的溶液等體積的水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液混勻，18514Xg離心lOmin，取上層水相；④加入與水相等體積的氯仿-異戊醇溶液，18514Xg離心lOmin，取上層水相；⑤加入3M pH5. 2乙酸鈉水溶液，乙酸鈉水溶液的體積為水相體積的十分之一，混勻后再加入2-2. 5倍體積無水乙醇，-20°C靜置；⑥4°C、20000Xg 離心 30min，取沉淀；⑦70% (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀，20000Xg離心lOmin，收集沉淀即為棉花線粒體RNA ；所述(a)和(b)中，所述溶液B由1~1^8-!1(1丄01六-恥2、07^、妝(1、亞精胺、？￥ -40、 DEPC水和β-巰基乙醇組成；所述溶液B中，Tris-HCl的濃度為20-200mmol/L，EDTA-Na2 的濃度為5-50mmol/L，CTAB的濃度為0. 05-1. Og/L, NaCl的濃度為0. 5_5mol/L，亞精胺的濃度為0. 1-1. 0g/L，PVP-40的濃度為5-30g/L，β -巰基乙醇的濃度為0. 5-15mmol/L ；所述
(a)和(b)中，所述氯仿-異戊醇溶液由M體積份氯仿與1體積份異戊醇組成；所述(a)和
(b)中，所述水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液由25體積份水飽和酚、M體積份氯仿和1體積份異戊醇組成。所述溶液B 中，Tris-HCl 的濃度為 20-100mmol/L 或 100-200mmol/L，EDTA-Na2 的濃度為 5-25mmol/L 或 25_50mmol/L，CTAB 的濃度為 0. 05-0. 2g/L 或 0. 2-1. Og/L, NaCl 的濃度為 0. 5-2. Omol/L 或 2. 0_5mol/L，亞精胺的濃度為 0. 1-0. 5g/L 或 0. 5-1. 0g/L，PVP_40 的濃度為5-20g/L或20-30g/L，β -巰基乙醇的濃度為0. 5-5mmol/L或5-15mmol/L ；所述溶液B中，Tris-HCl的濃度優(yōu)選為100mmol/L，EDTA-Na2的濃度優(yōu)選為25mmol/L，CTAB的濃度優(yōu)選為0. 2g/L,NaCl的濃度優(yōu)選為2. Omol/L，亞精胺的濃度優(yōu)選為0. 5g/L，PVP_40的濃度優(yōu)選為20g/L，β -巰基乙醇的濃度優(yōu)選為5mmol/L。本發(fā)明的創(chuàng)新點如下(1)材料選擇為棉花的黃化幼苗，以最大限度地減少葉綠體RNA的污染；( 溶液A中加入了一定量的PVP-40、β -巰基乙醇和BSA，三者的結(jié)合可以有效地減少棉酚、丹寧等特殊物質(zhì)對線粒體及mtRNA質(zhì)量的影響(PVP-40是一種酚結(jié)合劑，能有效地結(jié)合棉苗中的酚類物質(zhì)；β-巰基乙醇能抗酚類物質(zhì)氧化；BSA是一種起保護作用的環(huán)境介質(zhì))，有效地抑制棉花線粒體的氧化；(3)提取線粒體和裂解線粒體時，在溶液A和溶液B中加入蛋白酶K，使得mtRNA完全從蛋白復(fù)合體中釋放出來，便于mtRNA抽提， 提高了提取效率并減少蛋白質(zhì)污染，可分離出更高濃度、含完整線粒體的水相和盡可能多的mtRNA ； (4)mtRNA抽提時避免用到水和飽和酚，一定程度上降低了對mtRNA的損害。本發(fā)明可解決現(xiàn)在棉花線粒體研究技術(shù)難題，有效地從棉花線粒體中得到高質(zhì)量的線粒體RNA(mtRNA)。提取的mtRNA適用于相關(guān)分子生物學(xué)實驗，如PCR反應(yīng)、Northern blot、cDNA及microRNA等文庫的構(gòu)建。


圖1為實施例1的步驟二的(二)中棉花mtDNA電泳圖，其中第1_4泳道為步驟 2的沉淀的效果，5和6泳道為步驟1的沉淀的效果。圖2為實施例1的步驟二的(二)的1中，采用本發(fā)明提取的棉花mtDNA，用隨機引物翻轉(zhuǎn)錄后的線粒體cDNA為模板，用細胞色素c氧化酶第I亞基(coxl)全基因設(shè)計不同引物擴增結(jié)果圖，第一泳道為Marker II。圖3為實施例2的步驟二的(二)的1中棉花mtDNA電泳圖。圖4為實施例2的步驟二的(二)的2中棉花mtDNA電泳圖。圖5為實施例3的步驟二的(二)的1中棉花mtDNA電泳圖。圖6為實施例3的步驟二的(二)的2中棉花mtDNA電泳圖。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。所用試劑和器皿需提前兩天進行RNase-free處理，mtRNA 的分離過程盡量保持在低溫條件下進行。PVP-40即聚乙烯吡咯烷酮；BSA即牛血清白蛋白； CTAB即十六烷基三甲基溴化銨。陸地棉鄂抗棉12購買自湖北省種子集團公司。DEPC水是用DEPCWiethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理過并經(jīng)高溫高壓消毒的MiliQ純水，不含RNase、DNase和proteinase。DEPC水的制備方法如下在MiliQ純水中加入DEPC，使其質(zhì)量百分含量為0. 1%，兩天后高壓滅菌，以使DEPC分解，即為DEPC水。實施例1、棉花線粒體RNA的提取一、溶液的制備溶液A 將 NaCl、Tris-HCUEDTA-Na2 和 DEPC 水混合，121°C滅菌 40min，冷卻后加入PVP-40和BSA，使用前加入β-巰基乙醇，即為溶液A ；溶液A中，NaCl的濃度為1. aiiol/ L, Tris-HCl 的濃度為 0. 05mol/L,EDTA-Na2 的濃度為 2mmol/L，PVP-40 的濃度為 2. 5% (體積百分含量)，BSA的濃度為0.1% (體積百分含量)，β-巰基乙醇的濃度為5mmol/L。溶液B 將 Tris-HCl、EDTA-N￡i2、CTAB、NaCl、亞精胺、PVP-40 和 DEPC 水混合，室溫 2 天后121°C滅菌40min，使用前加入β -巰基乙醇，即為溶液B ；溶液B中，Tris-HCl的濃度為 IOOmmol/L,EDTA-Nei2 的濃度為 25mmol/L，CTAB 的濃度為 0. 2g/L，NaCl 的濃度為 2. Omol/ L，亞精胺的濃度為0. 5g/L，PVP-40的濃度為20g/L，β -巰基乙醇的濃度為5mmol/L。溶液甲在溶液A中加入蛋白酶K，使蛋白酶K的濃度為0. lmg/mL。氯仿-異戊醇溶液 體積份氯仿與1體積份異戊醇混合。水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液25體積份水飽和酚、M體積份氯仿和1體積份異戊醇混合。二、棉花線粒體RNA的提取(一 )線粒體的提取1、取5克陸地棉鄂抗棉12黃化幼苗的根，加入液氮充分研磨后裝于50ml離心管中，加入30ml 4°C預(yù)冷的溶液甲，劇烈振蕩混勻，冰上靜置5min ；2、4°C、1000Xg離心lOmin，取上清液(去除大分子物質(zhì))；
3、4°C、2600Xg離心15min，取上清液(去除大分子物質(zhì))；4、4°C、16000Xg離心40min，取沉淀物(沉淀物即線粒體)；5、用20ml溶液A洗滌重懸沉淀物，16000 X g離心40min，收集沉淀物(線粒體)。
(二)線粒體的裂解和RNA的提取1、無水乙醇沉淀法①加入5ml溶液B懸浮步驟(一)得到的沉淀物，65°C水浴IOmin裂解；②加入0. 5mg蛋白酶K，37°C水浴2min，冰浴5min ；③加入與步驟②的溶液等體積的等體積的水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液輕輕混勻，18514 Xg離心lOmin，輕輕吸取上層水相；④加入與水相等體積的氯仿-異戊醇溶液，18514Xg離心lOmin，取上層水相(可重復(fù)本步驟1-2次)；⑤加入3M乙酸鈉水溶液(pH = 5. 2)，乙酸鈉水溶液的體積為水相體積的十分之一，混勻后再加入2-2. 5倍體積冰冷的無水乙醇，_20°C靜置過夜；⑥4°C、20000Xg 離心 30min，取沉淀；⑦70% (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀1-2次，20000Xg離心IOmin收集沉淀(mtRNA)；⑧無菌超凈臺吹干(2-5min)，加入50 μ 1 DEPC水溶解mtRNA，_80°C冰箱保存?zhèn)溆?(線粒體RNA溶液)。線粒體RNA 得率(168. 7ng/ul X 20ul) /5gX 100 % = 6. 75Χ1(Γ5%。線粒體RNA的電泳圖見圖1 (1 μ 1 mtRNA+2 μ 1 Loading Buffer)中的泳道5和泳道6。將線粒體RNA用隨機引物翻轉(zhuǎn)錄后為cDNA，將cDNA作為模板，用細胞色素c氧化酶第I亞基(coxl)全基因設(shè)計不同引物擴增，結(jié)果見圖2，第一泳道為Marker II。第二泳道對應(yīng)的PCR引物對如下R :5，-cgtctaagcccacagtaa-3，；F :5，_tggaggagcagttgattt_3，。第三泳道對應(yīng)的PCR引物對如下R :5，-gaagaaacaacaaatccc-3，；F :5，_atctttggtcggacatac_3，。第四泳道對應(yīng)的PCR引物對如下F :5，-AGAAACAACAAATCCCAACTAC-3，；R :5，-CGTGGACCTGGAATGACTA-3，。2、LiCl 沉淀①加入5ml溶液B懸浮步驟(一)得到的沉淀物，65°C水浴IOmin裂解；②加入0. 5mg蛋白酶K，37°C水浴2min，冰浴5min ；③加入與步驟②的溶液等體積的水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液輕輕混勻， 18514 Xg離心15min，輕輕吸取上層水相；④加入與水相等體積的氯仿-異戊醇溶液輕輕混勻，18514Xg離心lOmin，輕輕吸取上層水相(可重復(fù)本步驟1-2次)；⑤水相分裝在幾個1. 5ml離心管中，每個離心管700μ 1，加入體積為水相體積1/4 的IOM LiCl水溶液，輕輕混勻，4°C靜置過夜。⑥4°C、14000 X g 離心 40min，取沉淀。
⑦每個離心管加入700 μ 1 0. 5% (質(zhì)量百分含量)SDS水溶液溶解，冰浴5min，加入700 μ 1氯仿-異戊醇溶液，輕輕混勻，4°C、14000Xg離心20min。⑧取上清于另一個離心管中，加入2倍體積無水乙醇，-70°C靜置40min ；⑨4°C、20000Xg離心40min，取沉淀；70% (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀 1-2 次，20000 Xg 離心 lOmin，收集沉淀(mtRNA)；⑩無菌超凈臺吹干(2-5min)，加入50 μ 1 DEPC水溶解mtRNA，_80°C冰箱保存?zhèn)溆?(線粒體RNA溶液)。線粒體RNA 得率(133. lng/ul X 20ul) /5gX 100 % = 5. 32Χ1(Γ5%。線粒體RNA的電泳圖見圖1 (1 μ 1 mtRNA+2 μ 1 Loading Buffer)的泳道1至泳道 4。結(jié)果表明無水乙醇沉淀之后的得率較高，且能沉淀小分子RNA，適合于研究小分子RNA的實驗；LiCl沉淀得率稍低，但LiCl只選擇性的沉淀RNA，所以DNA和蛋白的污染較少，適合于研究cDNA等RNA純度要求較高的實驗。實施例2、棉花線粒體RNA的提取一、溶液的制備溶液A 將 NaCl、Tris-HCUEDTA-Na2 和 DEPC 水混合，121°C滅菌 40min，冷卻后加入PVP-40和BSA，使用前加入β-巰基乙醇，即為溶液A ；溶液A中，NaCl的濃度為0. 5mol/ L, Tris-HCl 的濃度為 0. 01mol/L, EDTA-Na2 的濃度為 0. 5mmol/L, PVP-40 的濃度為 0. 5% ) (體積百分含量)，BSA的濃度為0. 05% (體積百分含量)，β-巰基乙醇的濃度為lmmol/ L0溶液B 將 Tris-HCl、EDTA-Na2、CTAB、NaCl、亞精胺、PVP-40 和 DEPC 水混合，室溫 2 天后121°C滅菌40min，使用前加入β -巰基乙醇，即為溶液B ；溶液B中，Tris-HCl的濃度為 20mmol/L，EDTA-Na2 的濃度為 5mmol/L，CTAB 的濃度為 0. 05g/L, NaCl 的濃度為 0. 5mol/ L，亞精胺的濃度為0. lg/L，PVP-40的濃度為5g/L，β -巰基乙醇的濃度為0. 5mmol/L。溶液甲在溶液A中加入蛋白酶K，使蛋白酶K的濃度為0.01mg/mL。氯仿-異戊醇溶液 體積份氯仿與1體積份異戊醇混合。水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液25體積份水飽和酚、M體積份氯仿和1體積份異戊醇混合。二、棉花線粒體RNA的提取(一)線粒體的提取1、取10克棉花(品種名稱中棉所12 ；購白河南安陽中棉種業(yè)有限公司)黃化幼苗的根，加入液氮充分研磨后裝于50ml離心管中，加入5ml 4°C預(yù)冷的溶液甲，劇烈振蕩混勻，冰上靜置anin ；2、4°C、500Xg離心5min，取上清液(去除大分子物質(zhì))；3、4°〇、1000\8離心51^11，取上清液(去除大分子物質(zhì))；4、4°C、8000Xg離心15min，取沉淀物(沉淀物即線粒體)；5、用5ml溶液A洗滌重懸沉淀物，8000 X g離心15min，收集沉淀物(線粒體)。(二)線粒體的裂解和RNA的提取1、無水乙醇沉淀法
①加入2ml溶液B懸浮步驟(一)得到的沉淀物，65°C水浴5min裂解；②加入0. 05mg蛋白酶K，37°C水浴2min，冰浴2min ；③加入與步驟②的溶液等體積的水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液輕輕混勻，8000 X g 離心5min，輕輕吸取上層水相；④加入與水相等體積的氯仿-異戊醇溶液，8000 X g離心5min，取上層水相(可重復(fù)本步驟1-2次)；⑤加入IM乙酸鈉水溶液(pH = 5. 2)，乙酸鈉水溶液的體積為水相體積的十分之一，混勻后再加入2-2. 5倍體積冰冷的無水乙醇，_20°C靜置過夜；⑥4°C、8000Xg 離心 5min，取沉淀；⑦70% (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀1-2次，8000 Xg離心5min收集沉淀(mtRNA)；⑧無菌超凈臺吹干(2-5min)，加入50 μ 1 DEPC水溶解mtRNA，_80°C冰箱保存?zhèn)溆?(線粒體RNA溶液)。線粒體RNA 得率(213. 4ng/ul X 40ul)/10. Og X 100 % = 8. 54 X 10_5%。線粒體RNA 的電泳圖見圖 3(1 μ 1 mtRNA+2 μ 1 Loading Buffer)。2、LiCl 沉淀①加入2ml溶液B懸浮步驟(一)得到的沉淀物，65°C水浴5min裂解；②加入0. 05mg蛋白酶K，37°C水浴2min，冰浴^iiin ；③加入與步驟②的溶液等體積的水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液輕輕混勻，8000 X g 離心5min，輕輕吸取上層水相；④加入與水相等體積的氯仿-異戊醇溶液輕輕混勻，8000 X g離心5min，輕輕吸取上層水相(可重復(fù)本步驟1-2次)；⑤水相分裝在幾個1. 5ml離心管中，每個離心管600 μ 1，加入體積為水相體積1/4 的IOM LiCl水溶液，輕輕混勻，4°C靜置過夜。⑥4°C、8000Xg 離心 15min，取沉淀。⑦每個離心管加入700 μ 1 0. 5% (質(zhì)量百分含量)SDS水溶液溶解，冰浴5min，加入700 μ 1氯仿-異戊醇溶液，輕輕混勻，4°C、8000Xg離心5min。⑧取上清于另一個離心管中，加入2倍體積無水乙醇，-70°C靜置15min。⑨4°C、8000Xg離心15min，取沉淀；70% (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀 1-2 次，8000 X g 離心 5min,收集沉淀(mtRNA)；⑩無菌超凈臺吹干(2-5min)，加入50 μ 1 DEPC水溶解mtRNA，_80°C冰箱保存?zhèn)溆?(線粒體RNA溶液)。線粒體RNA 得率(151. 3ng/ulX40ul)/IOgX 100%= 6. 05X 1(Γ5%。線粒體RNA 的電泳圖見圖 4(1 μ 1 mtRNA+2 μ 1 Loading Buffer)。實施例3、棉花線粒體RNA的提取一、溶液的制備溶液A 將 NaCl、Tris-HCUEDTA-Na2 和 DEPC 水混合，121°C滅菌 40min，冷卻后加入PVP-40和BSA，使用前加入β-巰基乙醇，即為溶液A ；溶液A中，NaCl的濃度為2. Omol/ L, Tris-HCl 的濃度為 1. OOmo 1/L,EDTA-Na2 的濃度為 4mmol/L，PVP-40 的濃度為 5% (體積百分含量)，BSA的濃度為0. 5% (體積百分含量)，β -巰基乙醇的濃度為lOmmol/L。溶液B 將 Tris-HCl、EDTA-Na2、CTAB, NaCl、亞精胺、PVP-40 和 DEPC 水混合，室溫 2天后121°C滅菌40min，使用前加入β -巰基乙醇，即為溶液B ；溶液B中，Tris-HCl的濃度為 200mmol/L,EDTA-Nei2 的濃度為 50mmol/L，CTAB 的濃度為 1. 0g/L,NaCl 的濃度為 5mol/ L，亞精胺的濃度為1. Og/L，PVP-40的濃度為30g/L，β -巰基乙醇的濃度為15mmol/L。溶液甲在溶液A中加入蛋白酶K，使蛋白酶K的濃度為lmg/mL。氯仿-異戊醇溶液 體積份氯仿與1體積份異戊醇混合。水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液25體積份水飽和酚、M體積份氯仿和1體積份異戊醇混合。二、棉花線粒體RNA的提取(一)線粒體的提取1、取5克棉花(品種名稱中棉所1 黃化幼苗的根，加入液氮充分研磨后裝于 50ml離心管中，加入45ml 4°C預(yù)冷的溶液甲，劇烈振蕩混勻，冰上靜置30min ；2、41、2000\8離心401^11，取上清液(去除大分子物質(zhì))；3、41、4000\8離心401^11，取上清液(去除大分子物質(zhì))；4、4°C、30000Xg離心120min，取沉淀物(沉淀物即線粒體)；5、用50ml溶液A洗滌重懸沉淀物，30000 X g離心120min，收集沉淀物(線粒體)。(二)線粒體的裂解和RNA的提取1、無水乙醇沉淀法①加入20ml溶液B懸浮步驟(一)得到的沉淀物，65°C水浴40min裂解；②加入1. Omg蛋白酶K，37°C水浴15min，冰浴20min ；③加入與步驟②的溶液等體積的水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液輕輕混勻， 30000 X g離心30min，輕輕吸取上層水相；④加入與水相等體積的氯仿-異戊醇溶液輕輕混勻，30000 X g離心30min，取上層水相(可重復(fù)本步驟1-2次)；⑤加入6M乙酸鈉水溶液(pH = 5. 2)，乙酸鈉水溶液的體積為水相體積的十分之一，混勻后再加入2-2. 5倍體積冰冷的無水乙醇，_20°C靜置過夜；⑥4°C、30000Xg 離心 60min，取沉淀；⑦70% (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀1-2次，30000Xg離心60min收集沉淀(mtRNA)；⑧無菌超凈臺吹干(2-5min)，加入50 μ 1 DEPC水溶解mtRNA，_80°C冰箱保存?zhèn)溆?(線粒體RNA溶液)。線粒體RNA 得率(159. 6ng/ul X 20ul) /5gX 100%= 6. 38X W5%0線粒體RNA 的電泳圖見圖 5(1 μ 1 mtRNA+2 μ 1 Loading Buffer)。2、LiCl 沉淀①加入20ml溶液B懸浮步驟(一)得到的沉淀物，65°C水浴40min裂解；②加入1. Omg蛋白酶K，37°C水浴15min，冰浴20min ；③加入與步驟②的溶液等體積的水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液輕輕混勻， 30000 X g離心30min，輕輕吸取上層水相；
④加入與水相等體積的氯仿-異戊醇溶液輕輕混勻，30000 X g離心30min，輕輕吸取上層水相(可重復(fù)本步驟1-2次)；⑤水相分裝在幾個1. 5ml離心管中，每個離心管800 μ 1，加入體積為水相體積1/4 的IOM LiCl水溶液，輕輕混勻，4°C靜置過夜。⑥4°C、30000 Xg 離心 120min，取沉淀。⑦每個離心管加入700 μ 1 0. 5% (質(zhì)量百分含量)SDS水溶液溶解，冰浴5min，加 Λ 700 μ 1氯仿-異戊醇溶液，輕輕混勻，4°C、30000Xg離心40min。⑧取上清于另一個離心管中，加入2倍體積無水乙醇，-70°C靜置120min。⑨4°C、30000Xg離心120min，取沉淀；70% (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀 1-2 次，30000 X g 離心 60min,收集沉淀(mtRNA)；⑩無菌超凈臺吹干(2-5min)，加入50 μ 1 DEPC水溶解mtRNA，_80°C冰箱保存?zhèn)溆?(線粒體RNA溶液)。線粒體RNA 得率(145. 8ng/ul X 20ul) /5gX 100 % = 5. 83Χ1(Γ5%。線粒體RNA 的電泳圖見圖 6(1 μ 1 mtRNA+2 μ 1 Loading Buffer)。
權(quán)利要求
1.提取棉花線粒體的方法，包括如下步驟(1)將棉花黃化苗的根進行液氮研磨，然后加入4°c預(yù)冷的溶液甲，振蕩混勻，冰上靜置2-30min ；溶液甲由溶液A和蛋白酶K組成，蛋白酶K的濃度為0. 01-lmg/mL ；(2)4°C、500-2000 Xg 離心 5_40min，取上清液；然后 4°C、1000-4000 X g 離心 5_40min， 取上清液；然后4°C、8000-30000Xg離心15_120min，取沉淀物；(3)用溶液A洗滌重懸沉淀物，8000-30000Xg離心15-120min，收集沉淀物，即為線粒體；所述步驟(1)和步驟(3)中的溶液 A 由 NaCl, Tris-HCl, EDTA-Na2, DEPC 水、PVP-40、 BSA和β -巰基乙醇組成；溶液A中，NaCl的濃度為0. 5-2. Omo 1/L, Tris-HCl的濃度為 0. 01-1. OOmol/LjEDTA-Na2 的濃度為 0. 5_4mmol/L，PVP-40 的濃度為 0. 5-5% (體積百分含量)，BSA的濃度為0. 05-0. 5% (體積百分含量)，β-巰基乙醇的濃度為1-lOmmol/L。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中，冰上靜置的時間為2-5min 或5-30min，優(yōu)選為5min ；所述步驟(3)中的離心條件為8000-16000Xg離心15_40min 或 16000-30000Xg 離心 40-120min，優(yōu)選為 16000X g 離心 40min ；所述步驟(2)為4°C、 500-1000 X g離心5-10min,取上清液；然后4°C、1000-2600 X g離心5_15min，取上清液；然后 4°C、8000-16000Xg 離心 15_40min，取沉淀物；或所述步驟(2)為:4"C、1000-2000Xg 離心10-40min,取上清液；然后4°C、2600-4000 X g離心15-40min,取上清液；然后4°C、 16000-30000 X g離心40-120min，取沉淀物；所述步驟⑵優(yōu)選為4 °C、1000 X g離心 IOmin,取上清液；然后40C >2600 X g離心15min,取上清液；然后4°C、16000 X g離心40min, 取沉淀物。
3.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述棉花黃化苗的根、所述溶液甲和所述溶液A的配比為5-10克棉花黃化苗的根5-45ml溶液甲5_50ml溶液A。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述棉花黃化苗的根、所述溶液甲和所述溶液A的配比為5-10克棉花黃化苗的根5-30ml溶液甲5_20ml溶液A ；或所述棉花黃化苗的根、所述溶液甲和所述溶液A的配比為5-10克棉花黃化苗的根30-45ml溶液甲20-50ml溶液A ；所述棉花黃化苗的根、所述溶液甲和所述溶液A的配比優(yōu)選為5克棉花黃化苗的根30ml溶液甲20ml溶液A。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述溶液A中，NaCl的濃度為 0. 5-1. 2mol/L 或 1. 2-2. Omol/L，Tris-HCl 的濃度為 0. 01-0. 05mol/L 或 0. 05-lmol/L， EDTA-Na2 的濃度為 0. 5_2mmol/L 或 2_4mmol/L，PVP-40 的濃度為 0. 5-2. 5% (體積百分含量)或2. 5-5% (體積百分含量)，BSA的濃度為0. 05-0. 1% (體積百分含量)或0. 1-0.5% (體積百分含量)，β-巰基乙醇的濃度為l-5mmol/L或5-lOmmol/L;所述溶液甲中，蛋白酶K的濃度為0. 01-0. lmg/mL或0. 1-lmg/mL ；所述溶液A中，NaCl的濃度優(yōu)選為1. 2mol/ L，Tris-HCl的濃度優(yōu)選為0. 05mol/L, EDTA-Na2的濃度優(yōu)選為2mmol/L，PVP-40的濃度優(yōu)選為2.5% (體積百分含量)，BSA的濃度優(yōu)選為0. (體積百分含量)，β-巰基乙醇的濃度優(yōu)選為5mmol/L ；所述溶液甲中，蛋白酶K的濃度優(yōu)選為0. lmg/mL。
6.如權(quán)利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于所述棉花為陸地棉鄂抗棉12或中棉所12。
7.一種提取棉花線粒體RNA的方法，是將權(quán)利要求1至6中任一所述方法得到的棉花線粒體提取RNA，得到棉花線粒體RNA。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述提取RNA的方法為如下(a)或(b)(a)包括如下步驟①加入2-20ml溶液B懸浮所述棉花線粒體，65°C水浴5-40min裂解；②加入0. 05-1. Omg 蛋白酶 K, 37°C水浴 2_15min，冰浴 2_20min ；③加入與步驟②的溶液等體積的水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液混勻，8000-30000Xg離心5-30min，取上層水相；④加入與水相等體積的氯仿-異戊醇溶液混勻，8000-30000Xg離心5-30min，取上層水相 600-800 μ 1 ；⑤加入體積為水相體積1/4的IOMLiCl水溶液，混勻，4°C靜置；⑥4°C、8000-30000Xg 離心 15_120min，取沉淀；⑦加入700μ 1 0.5% (質(zhì)量百分含量)SDS水溶液，冰浴5min ；加入700 μ 1氯仿-異戊醇溶液，混勻，4°C、8000-30000Xg離心5_40min，取上清液；⑧加入2倍體積無水乙醇，_70°C靜置15-120min。⑨4°C、8000-30000Xg 離心 15_120min，取沉淀；⑩70%(體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀，8000-30000 Xg離心5-60min，收集沉淀即為棉花線粒體RNA;(b)包括如下步驟①加入2-20ml溶液B懸浮所述棉花線粒體，65°C水浴5-40min裂解；②加入0. 05-1. Omg 蛋白酶 K, 37°C水浴 2_15min，冰浴 2_20min ；③加入與步驟②的溶液等體積的水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液混勻，8000-30000Xg離心5-30min，取上層水相；④加入與水相等體積的氯仿-異戊醇溶液，8000-30000X g離心5-30min，取上層水相；⑤加入1-6MpH5. 2乙酸鈉水溶液，乙酸鈉水溶液的體積為水相體積的十分之一，混勻后再加入2-2. 5倍體積無水乙醇，-20°C靜置；⑥4°C、8000-30000Xg 離心 5_60min，取沉淀；⑦70%(體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀，8000-30000 Xg離心5-60min，收集沉淀即為棉花線粒體RNA;所述(a)和(b)中，所述溶液 B 由 Tris-HCl, EDTA-Na2, CTAB, NaCl、亞精胺、PVP-40、 DEPC水和β-巰基乙醇組成；所述溶液B中，Tris-HCl的濃度為20-200mmol/L，EDTA-Na2 的濃度為5-50mmol/L，CTAB的濃度為0. 05-1. Og/L, NaCl的濃度為0. 5_5mol/L，亞精胺的濃度為0. 1-1. 0g/L，PVP-40的濃度為5-30g/L，β -巰基乙醇的濃度為0. 5-15mmol/L ；所述(a)和(b)中，所述氯仿-異戊醇溶液由M體積份氯仿與1體積份異戊醇組成；所述(a)和(b)中，所述水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液由25體積份水飽和酚、M體積份氯仿和1體積份異戊醇組成。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述提取RNA的方法為如下(a)或(b) (a)包括如下步驟①加入5ml溶液B懸浮所述棉花線粒體，65°C水浴IOmin裂解；②加入0.5mg蛋白酶K，37°C水浴2min，冰浴5min ；③加入與步驟②的溶液等體積的水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液混勻，18514Xg離心 15min，取上層水相；④加入與水相等體積的氯仿-異戊醇溶液輕輕混勻，18514X g離心lOmin，取上層水相 700 μ 1 ；⑤加入體積為水相體積1/4的IOMLiCl水溶液，混勻，4°C靜置；⑥40C、14000X g離心40min,取沉淀；⑦加入700μ 1 0.5% (質(zhì)量百分含量)SDS水溶液，冰浴5min ；加入700 μ 1氯仿-異戊醇溶液，混勻，40C、14000 X g離心20min，取上清液；⑧加入2倍體積無水乙醇，-70°C靜置40min。⑨4°C、20000Xg離心40min，取沉淀；⑩70%(體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀，20000Xg離心lOmin，收集沉淀即為棉花線粒體RNA ；(b)包括如下步驟①加入5ml溶液B懸浮所述棉花線粒體，65°C水浴IOmin裂解；②加入0.5mg蛋白酶K，37°C水浴2min，冰浴5min ；③加入與步驟②的溶液等體積的水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液混勻，18514Xg離心 lOmin，取上層水相；④加入與水相等體積的氯仿-異戊醇溶液，18514Xg離心lOmin，取上層水相；⑤加入3MpH5. 2乙酸鈉水溶液，乙酸鈉水溶液的體積為水相體積的十分之一，混勻后再加入2-2. 5倍體積無水乙醇，-20°C靜置；⑥4°C、20000Xg離心30min，取沉淀；⑦70%(體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀，20000Xg離心lOmin，收集沉淀即為棉花線粒體RNA ；所述(a)禾Π (b)中，所述溶液 B 由 Tris-HCl、EDTA-Na2, CTAB, NaCl、亞精胺、PVP-40、 DEPC水和β-巰基乙醇組成；所述溶液B中，Tris-HCl的濃度為20-200mmol/L，EDTA-Na2 的濃度為5-50mmol/L，CTAB的濃度為0. 05-1. Og/L, NaCl的濃度為0. 5_5mol/L，亞精胺的濃度為0. 1-1. 0g/L，PVP-40的濃度為5-30g/L，β -巰基乙醇的濃度為0. 5-15mmol/L ；所述(a)和(b)中，所述氯仿-異戊醇溶液由M體積份氯仿與1體積份異戊醇組成；所述(a)和(b)中，所述水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液由25體積份水飽和酚、M體積份氯仿和1體積份異戊醇組成。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述溶液B中，Tris-HCl的濃度為 20-100mmol/L 或 100-200mmol/L，EDTA-Na2 的濃度為 5_25mmol/L 或 25_50mmol/L，CTAB 的濃度為 0. 05-0. 2g/L 或 0. 2-1. Og/L, NaCl 的濃度為 0. 5-2. Omol/L 或 2. 0-5mol/L,亞精胺的濃度為 0. 1-0. 5g/L 或 0. 5-1. 0g/L，PVP-40 的濃度為 5_20g/L 或 20_30g/L，β -巰基乙醇的濃度為0. 5-5mmol/L或5_15mmol/L ；所述溶液B中，Tris-HCl的濃度優(yōu)選為100mmol/L， EDTA-Na2的濃度優(yōu)選為25mmol/L，CTAB的濃度優(yōu)選為0. 2g/L，NaCl的濃度優(yōu)選為2. Omol/ L,亞精胺的濃度優(yōu)選為0. 5g/L，PVP-40的濃度優(yōu)選為20g/L，β -巰基乙醇的濃度優(yōu)選為 5mmol/L0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提取棉花線粒體及其RNA的方法。本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)將棉花黃化苗的根進行液氮研磨，加入4℃溶液甲，振蕩混勻，冰上靜置2-30min；溶液甲由溶液A和蛋白酶K組成，蛋白酶K的濃度為0.01-1mg/mL；(2)4℃、500-2000×g離心5-40min，取上清液；4℃、1000-4000×g離心5-40min，取上清液；4℃、8000-30000×g離心15-120min，取沉淀物；(3)用溶液A洗滌重懸沉淀物，8000-30000×g離心15-120min，收集沉淀物，即為線粒體。本發(fā)明可解決現(xiàn)在棉花線粒體研究技術(shù)難題，有效地從棉花線粒體中得到高質(zhì)量的線粒體RNA(mtRNA)。提取的mtRNA適用于相關(guān)分子生物學(xué)實驗。
文檔編號C12N5/04GK102382793SQ201010268760
公開日2012年3月21日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者華金平, 李雙雙, 熊敏, 王玉美, 蘇愛國, 雷彬彬 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)