專利名稱：紅假單胞菌菌株及其液體菌劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于利用生物降解化學(xué)農(nóng)藥殘留物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種紅假單胞菌及 其菌劑及相應(yīng)的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
化學(xué)農(nóng)藥中化學(xué)除草劑的使用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中挽回了大量因草害引起的損失，同 時極大地提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的勞動效率和機(jī)械化程度，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的現(xiàn)代化進(jìn)程中起了不可 估量的作用。但是，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的化學(xué)除草劑，其在環(huán)境中的殘留不僅嚴(yán)重污染了 環(huán)境，而且造成了農(nóng)產(chǎn)品中化學(xué)除草劑殘留物的超標(biāo)，嚴(yán)重影響了農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量和品質(zhì)；而 且，化學(xué)除草劑選擇性強(qiáng)，對不同作物的敏感性差異很大，土壤中少量的殘留量即可對后茬 敏感作物產(chǎn)生藥害，因此該類除草劑在土壤中的殘留物對后茬作物的安全性等問題引起了 人們的普遍關(guān)注。許多國家和地區(qū)目前不得不暫時禁用某些殘留期長的除草劑。目前，由于我國從事農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的勞動力的減少，我國農(nóng)業(yè)發(fā)展的趨勢是大規(guī)模機(jī) 械化生產(chǎn)，不使用化學(xué)除草劑，無法解決因草害引起的經(jīng)濟(jì)損失以及由此引起的農(nóng)作物 (特別是糧食作物)品級的降低。因此，在現(xiàn)有植保水平下除草劑還將繼續(xù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā) 揮巨大作用。然而，隨著人們生活水平的提高和環(huán)境保護(hù)意識的增強(qiáng)，人們越來越關(guān)注農(nóng)產(chǎn) 品中的農(nóng)藥殘留物所帶來的危害問題。如何協(xié)調(diào)解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的這個兩難問題就成為各 個學(xué)科的研究熱點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)室和實(shí)際應(yīng)用研究均表明利用微生物來消除化學(xué)農(nóng)藥的殘留物， 具有環(huán)保、實(shí)用、操作簡便等特點(diǎn)，目前已成為去除農(nóng)藥殘留物污染的一種重要方法，但該 方法成本相對較高，去除效果還有待進(jìn)一步加強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種生產(chǎn)成本小、使用方 便、農(nóng)藥降解效果好的紅假單胞菌菌株及利用該菌株制得的液體菌劑，同時還相應(yīng)提供一 種前述液體菌劑的制備方法，以及前述菌株及液體菌劑在降解除草劑吡嘧磺隆殘留物中的 應(yīng)用，以解決土壤中的化學(xué)除草劑殘留物對后茬作物的安全性問題，也可應(yīng)用于含高濃度 農(nóng)藥的農(nóng)業(yè)廢水的處理。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種紅假單胞菌菌株，所述紅假 單胞菌菌株的保藏名稱為紅假單胞菌S8_i (Rhodopseudomonas sphaeroides S8J，保藏單位 為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2010144。上述本發(fā)明的紅假單胞菌菌株屬革蘭氏陰性菌，經(jīng)鑒定為紅假單胞菌 (Rhodopseudomonas sphaeroides)，其主要生物學(xué)特征為雙層固體平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 5d 7d，形成紅色的圓形菌落，邊緣整齊光滑，菌落直徑0. 45mm 1. 05mm。液體培養(yǎng)基中 培養(yǎng)6d呈深紅色。菌體G_，光學(xué)顯微鏡觀察呈球形或卵狀，能在厭氧或微好氧條件下生長； 該菌體超薄切片電鏡觀察菌體切片形態(tài)多變，從球形、卵球到短桿形不等。以二分裂增殖， 極生鞭毛，菌體大小(0. 7 1. 2) μπιΧ (0. 8 2. 5) μ m，光合內(nèi)膜結(jié)構(gòu)為片層狀，位于質(zhì)膜之下并與質(zhì)膜平行。生理生化特性V-P反應(yīng)、甲基紅反應(yīng)、吲哚試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)均陰性；H2S 反應(yīng)、明膠液化、接觸酶試驗(yàn)均陽性，3% NaCl中能生長，能利用淀粉，最適生長溫度30°C 35°C，pH 7.0 7. 2，能以吡嘧磺隆為唯一的碳源和氮源生長。菌體細(xì)胞的特征吸收峰為 310nm、585nm、809nm、865nm。菌體 16S rDNA 序列長度為 1430bp，在 GenBank 中的登錄號為 EU004438。作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種含上述紅假單胞菌菌株的液體菌劑， 在該液體菌劑中，所述紅假單胞菌Sp1的菌體濃度達(dá)到10億個/ml以上。作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述的紅假單胞菌菌株的液體菌劑的 制備方法，包括以下步驟(1)活化將所述紅假單胞菌Sp1接種于雙層夾心固體培養(yǎng)基平板中進(jìn)行活化，所 述活化過程中，控制固體培養(yǎng)基的pH值為7. 0 7. 2，活化溫度控制在30°C 35°C，活化時 的光照強(qiáng)度控制在45001UX 75001UX，活化培養(yǎng)至紅色菌落出現(xiàn)；(2)種子培養(yǎng)將上述活化后的紅假單胞菌S8_i菌種接種于種子液體培養(yǎng)基中，種 子培養(yǎng)時的溫度控制在30°C 35°C，光照強(qiáng)度控制在45001uX 75001ux，種子培養(yǎng)至對數(shù) 期；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將上述種子培養(yǎng)后的紅假單胞菌S8_i菌種按發(fā)酵培養(yǎng)基 5% 的接種量接種種子菌體，于透明的發(fā)酵生產(chǎn)瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方與 所述種子液體培養(yǎng)基相同，發(fā)酵培養(yǎng)時的溫度控制在30°C 35°C，發(fā)酵培養(yǎng)時的光照強(qiáng)度 控制在45001UX 75001UX，發(fā)酵培養(yǎng)至對數(shù)生長期后將所得培養(yǎng)液進(jìn)行封裝，得到液體菌 劑。上述本發(fā)明的制備方法中，全流程培養(yǎng)時間大約在25天，培養(yǎng)結(jié)束后，紅假單胞 菌S8_i菌體濃度可達(dá)到10億個/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出生產(chǎn)瓶，并在自動包裝機(jī)上 用塑料袋或塑料瓶分裝成液體菌劑劑型。上述紅假單胞菌菌株的液體菌劑的制備方法中，所述固體培養(yǎng)基優(yōu)選包含以下濃 度的組分(NH4)2SO4O. lg/mL 0. 2g/mL、MgSO4O. 02g/mL 0. 05g/mL、NaHCO3O. 5g/mL 0. 6g/mL、K2HPO4O. 05g/mL 0. lg/mL、NaCl 0. 02g/mL 0. 05g/mL、酵母膏 0. 15g/mL
0.17g/mL和瓊脂1.3g/mL 1.8g/mL(余量物質(zhì)為蒸餾水，這是公知的)。所述固體培養(yǎng)基 主要是由前述組分配制而成，其配制時的PH值為7. 0 7. 2，配制后在121°C溫度下滅菌 30mino上述紅假單胞菌菌株的液體菌劑的制備方法中，每升所述的種子液體培養(yǎng)基 中含有以下質(zhì)量的組分(NH4)2SO4Ig 2g、MgSO4 · 7H20 0. 2g 0. 5g、NaHC035g 6g、 K2HPO4O. 5g lg、蛋白胨2g 2. 5g、乙酸鈉2g 3g、NaCl 0. 2g 0. 5g和酵母膏1. 5g
1.7g (余量物質(zhì)為蒸餾水)。所述種子液體培養(yǎng)基主要是由前述組分配制而成，其配制時的 PH值為7. 0 7. 2，配制后在121 °C溫度下滅菌30min。作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述的紅假單胞菌菌株或者上述的紅 假單胞菌菌株的液體菌劑在降解除草劑吡嘧磺隆殘留物中的應(yīng)用。作為對上述應(yīng)用的進(jìn)一步改進(jìn)，所述應(yīng)用的一種具體方法為將所述液體菌劑稀 釋50 100倍后噴施在含有除草劑吡嘧磺隆殘留物的土壤中，間隔5 10天后再次噴施一次。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明成功解決了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中吡嘧磺隆除 草劑殘留量超標(biāo)的問題，既充分發(fā)揮了吡嘧磺隆除草劑在雜草防治中的高效快速的作用， 又可以生產(chǎn)出無公害的綠色農(nóng)產(chǎn)品。通過使用本發(fā)明的紅假單胞菌菌株s8_i能使土壤和水 體中除草劑吡嘧磺隆殘留量降低45%以上，大大降低了該種除草劑在土壤和水體中的殘留 危害，也降低了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中因這種除草劑殘留去除過程中的工作量和操作成本。通過使用 本發(fā)明的降解菌紅假單胞菌菌株Sp1可以在農(nóng)作物的生長過程中正常使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行病 蟲害防治和雜草的防除，同時還能保證農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留含量符合綠色食品生產(chǎn)的要求。 本發(fā)明的降解菌紅假單胞菌菌株Sp1還可用于農(nóng)藥廠高濃度農(nóng)藥廢水的處理，降低廢水中 農(nóng)藥殘留量?？傮w來說，本發(fā)明的紅假單胞菌菌株V1及液體菌劑具有生產(chǎn)成本小、使用方便、 農(nóng)藥降解效果好等優(yōu)點(diǎn)，適合在全國糧油生產(chǎn)基地或綠色食品商標(biāo)標(biāo)志的地方大面積推廣 使用。本發(fā)明對于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保護(hù)人民的身體健康，提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值具有重要意 義。本發(fā)明的紅假單胞菌菌株已于2010年6月13日送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)保藏，保藏編號為 CCTCC M 2010144。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本實(shí)施例考察液體培養(yǎng)基中本發(fā)明的紅假單胞菌菌株CCTCC M 2010144對高濃度 吡嘧磺隆的降解。首先將吡嘧磺隆原藥用丙酮溶解，溶解后的吡嘧磺隆丙酮溶液經(jīng)0. 22 μ m濾膜過 濾除菌，并將其添加到本發(fā)明的滅菌的種子液體培養(yǎng)基中至吡嘧磺隆終濃度為200mg/L。所 用的種子液體培養(yǎng)基由以下組分配制而成(NH4)2SO4Ig 2g、MgSO4 · 7H20 0. 2g 0. 5g、 NaHC035g 6g,K2HPO4O. 5g lg、蛋白胨 2g 2. 5g、乙酸鈉 2g 3g、NaCl 0. 2g 0. 5g 和 酵母膏1. 5g 1. lg,然后用蒸餾水定容至lOOOmL，控制pH值為7. 0 7. 2，經(jīng)121°C滅菌 30min后得到。在含有吡嘧磺隆(200mg/L)的上述種子液體培養(yǎng)基中，按2%的接種量接入 已活化后的紅假單胞菌菌株CCTCC M 2010144種子菌液，溫度控制在30°C 35°C，光照強(qiáng) 度為45001UX 75001UX，該條件下培養(yǎng)7天，以同等培養(yǎng)條件下不加本發(fā)明降解菌株而含 有吡嘧磺隆(200mg/L)的種子液體培養(yǎng)基作為空白對照，每個處理重復(fù)三次。上述含有吡嘧磺隆的液體培養(yǎng)基樣品經(jīng)過乙腈及超聲波萃取處理20min，凝膠 滲透色譜凈化、C18固相萃取柱凈化后，采用高效液相色譜分離，外標(biāo)法定量，上機(jī)前用 0. 45 μ m有機(jī)相濾膜過濾。吡嘧磺隆檢測殘留量在Agilent 1200Series高效液相色譜儀 上進(jìn)行，其配置為配備四元泵、可變波長紫外(VWD)檢測器、自動進(jìn)樣器、化學(xué)工作站；色 譜柱為 Agilent ZORBAX Eclipse, XDB-C18 (4. 6mmX 250mm i. d.不銹鋼柱，5-Micron，內(nèi)裝 ODS填充物)(美國Agilent公司)。高效液相色譜分離的檢測條件經(jīng)過優(yōu)化后流動相的 配比為乙腈/水(用磷酸調(diào)節(jié)PH值3.0) = 70 30(V/V)、流速lmL/min、柱溫30°C、進(jìn)樣 量10μ L、檢測波長為241nm。試驗(yàn)測定結(jié)果見下表1。由下表1可見，種子液體培養(yǎng)基中吡 嘧磺隆的降解率高達(dá)52. 07%表1 降解菌劑V1在液體培養(yǎng)基中對吡嘧磺隆的降解
權(quán)利要求
一種紅假單胞菌菌株，其特征在于所述紅假單胞菌菌株的保藏名稱為紅假單胞菌S8 1(Rhodopseudomonas sphaeroides S8 1)，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2010144。
2.一種含權(quán)利要求1所述紅假單胞菌菌株的液體菌劑，其特征在于所述液體菌劑中， 所述紅假單胞菌Sp1的菌體濃度達(dá)到10億個/ml以上。
3.—種如權(quán)利要求2所述的紅假單胞菌菌株的液體菌劑的制備方法，包括以下步驟(1)活化將所述紅假單胞菌Sp1接種于雙層夾心固體培養(yǎng)基平板中進(jìn)行活化，所述活 化過程中，控制固體培養(yǎng)基的pH值為7. O 7. 2，活化溫度控制在30°C 35°C，活化時的光 照強(qiáng)度控制在45001uX 75001uX，活化培養(yǎng)至紅色單菌落出現(xiàn)；(2)種子培養(yǎng)將上述活化后的紅假單胞菌Sp1菌種接種于種子液體培養(yǎng)基中，種子培 養(yǎng)時的溫度控制在30°C 35°C，光照強(qiáng)度控制在45001uX 75001ux，種子培養(yǎng)至對數(shù)期；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將上述種子培養(yǎng)后的紅假單胞菌Sp1菌種按發(fā)酵培養(yǎng)基 5%的接 種量接種入生產(chǎn)瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方與所述種子液體培養(yǎng)基相同， 發(fā)酵培養(yǎng)時的溫度控制在30°C 35°C，發(fā)酵培養(yǎng)時的光照強(qiáng)度控制在45001uX 75001ux， 發(fā)酵培養(yǎng)至對數(shù)生長期后將所得培養(yǎng)液進(jìn)行封裝，得到液體菌劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的紅假單胞菌菌株的液體菌劑的制備方法，其特征在于，所 述固體培養(yǎng)基中包含以下濃度的組分(NH4)2SO4O. lg/mL 0. 2g/mL、MgSO4O. 02g/mL 0. O5g/mL^NaHCO3O. 5g/mL 0. 6g/mL、K2HPO4O. 05g/mL 0. lg/mL、NaCl 0. 02g/mL 0. 05g/ mL、酵母膏 0. 15g/mL 0. 17g/mL 和瓊脂 1. 3g/mL 1. 8g/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的紅假單胞菌菌株的液體菌劑的制備方法，其特征在于，每 升所述的種子液體培養(yǎng)基中含有以下質(zhì)量的組分(NH4)2SO4Ig 2g、MgSO4 · 7H20 0. 2g 0. 5g、NaHC035g 6g、K2HPO4O. 5g lg、蛋白胨 2g 2. 5g、乙酸鈉 2g 3g、NaCl 0. 2g 0. 5g和酵母膏1. 5g 1. 7g。
6.一種如權(quán)利要求1所述的紅假單胞菌菌株或者如權(quán)利要求2所述的紅假單胞菌菌株 的液體菌劑在降解除草劑吡嘧磺隆殘留物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用的具體方法為將所述液體菌劑 稀釋50 100倍后噴施在含有除草劑吡嘧磺隆殘留物的土壤中，間隔5 10天后再次噴 施一次。
全文摘要
本發(fā)明具體公開了一種紅假單胞菌菌株及其液體菌劑及其制備方法和應(yīng)用，該紅假單胞菌菌株的保藏名稱為紅假單胞菌S8-1，保藏號為CCTCC M 2010144。本發(fā)明的液體菌劑中紅假單胞菌S8-1的菌體濃度達(dá)到10億個/ml以上。本發(fā)明液體菌劑的制備方法包括以下步驟先將紅假單胞菌S8-1接種于雙層夾心固體培養(yǎng)基平板中進(jìn)行活化，然后接種于種子液體培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，活化、培養(yǎng)過程中的溫度控制在30℃～35℃，光照強(qiáng)度控制在4500～7500lux，發(fā)酵培養(yǎng)至對數(shù)生長期后得到液體菌劑。本發(fā)明的菌株及液體菌劑可有效降解土壤中的除草劑吡嘧磺隆殘留物，以解決土壤中的化學(xué)除草劑殘留物對后茬作物的安全性問題。
文檔編號C12R1/01GK101948782SQ201010269080
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月1日
發(fā)明者劉勇, 尹樂斌, 張德詠, 張松柏, 張馳, 成飛雪, 朱春暉, 羅源華, 羅香文 申請人:湖南省植物保護(hù)研究所