專利名稱：一種茶樹表達(dá)序列標(biāo)簽構(gòu)成的基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種茶樹基因檢測技術(shù)，尤其涉及一種茶樹表達(dá)序列標(biāo)簽構(gòu)成的基因
-H-· I I心片。
背景技術(shù)：
利用已知基因信息在待測樣品中特異地檢測目的基因的表達(dá)信息，是分子生物學(xué) 領(lǐng)域中常用的檢測手段，如常用的Southern雜交、Northern雜交以及PCR技術(shù)。但是，隨 著分子生物學(xué)的發(fā)展，這些技術(shù)不能在同一條件下對(duì)成千上萬個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行分析，因此 具有一定的局限性。通過原位合成(in sitil Synthesis)探針或合成目的基因片段后采 用交聯(lián)的方式，可以將成千上萬個(gè)基因固定在載體上，再利用雜交方式檢測基因表達(dá)信息 的方法已成為一種趨勢，隨著這種方法的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了生物芯片技術(shù)。生物芯片的實(shí) 質(zhì)就是在面積不大的基片上有序地點(diǎn)陣排列了一系列固定于一定位置地可尋址的生物識(shí) 別分子(Lipshutz RJ et al.，Bio Techniques 19 (1995), 442-447 ；Fodor SP et al.， Nature 364 (1993),555-556 ；Fodor SP et al.，Science 251 (1991),767-773 ；Pease AC et al. , Proceedings of National Academy of Science, USA 91 (1994)，5022—5026)。 由于最初的生物芯片主要是用于DNA序列測定、基因表達(dá)譜鑒定(Lockhart DJ et al., Nature Biotechnology 14 (1996)，1675-1680)、基因突變體的檢測和分析(Feriotto G et al. , Human Mutation 13 (1999),390-400 ；Hacia JG et al. , Nature Genetics 21 (suppl 1)(1999),42-47；Hacia JG et al.，Nature Genetics 22 (1999)，164—167 ；Nilsson P et al. ,Bio Techniques 26 (1999)，308-316)，所以又稱為DNA芯片或生物芯片。目前，這一技 術(shù)已擴(kuò)展至免疫反應(yīng)、受體結(jié)合等非核酸領(lǐng)域，因此生物芯片已超出了原來的范圍。如今生 物芯片主要包括cDNA微陣列、寡核苷酸微陣列、動(dòng)電微陣列、蛋白質(zhì)芯片和免疫芯片等，還 出現(xiàn)了組織芯片、細(xì)胞芯片、多肽芯片、質(zhì)譜芯片和電芯片等新的品種和技術(shù)。目前DNA芯 片因具有強(qiáng)有力性、靈活性、敏感性和相對(duì)簡單等特點(diǎn)而被應(yīng)用在許多領(lǐng)域，如醫(yī)學(xué)臨床診 斷、藥物開發(fā)、環(huán)境監(jiān)測、食品衛(wèi)生監(jiān)督以及司法鑒定等；在科研領(lǐng)域，生物芯片主要用于檢 測生物體在不同發(fā)育階段、組織器官、及在各種生物及非生物脅迫下基因的表達(dá)情況，鑒定 特異表達(dá)基因的信息，從而為研究提供信息和方向。通過構(gòu)建cDNA文庫、測序獲取基因信息，是生物芯片制備過程中目的探針設(shè)計(jì)的 主要來源。目前，在一些大型數(shù)據(jù)庫(如NCBI上的GenBank)中已經(jīng)有多種生物基因的 EST (基因表達(dá)序列標(biāo)簽)、基因、甚至基因組序列信息，為一些模式生物芯片的制作提供了 信息，大大方便了生物基因表達(dá)信息的獲取。探針制作完成后，通過將液相化學(xué)合成的大量 探針，或?qū)CR擴(kuò)增的cDNA、基因組DNA經(jīng)純化、定量分析后，通過陣列點(diǎn)樣機(jī)及電腦控制的 機(jī)器手，準(zhǔn)確、快速地將不同探針樣品定量點(diǎn)樣子帶正電荷的尼龍膜或多聚賴氨酸包被的 硅片等載體的相應(yīng)位置上，再由紫外線交聯(lián)固定后即得到DNA微陣列或芯片。而常規(guī)的雜 交檢測方法主要包括目的片段擴(kuò)增、直接點(diǎn)樣或電泳后轉(zhuǎn)到尼龍膜上、紫外鉸鏈等步驟，因 此，整體需要目的片段的量較大，且每次只能分析少數(shù)基因，具有一定的局限性。待測的生
3物樣品往往是各種組分的混合體，成分非常復(fù)雜，直接用樣品本身進(jìn)行標(biāo)記雜交對(duì)樣品量 的要求較高。因此，待測樣品DNA在雜交前一般都要通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增，然 后對(duì)擴(kuò)增后的靶DNA進(jìn)行標(biāo)記。芯片雜交可以根據(jù)實(shí)際情況在常規(guī)雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行 優(yōu)化，然后進(jìn)行掃描，圖像處理、數(shù)據(jù)提取、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，最終得到結(jié)果。這種處理和分析 數(shù)據(jù)方式比常規(guī)雜交檢測的靈敏度高，尤其是對(duì)一些低豐度表達(dá)的基因，此外，通過統(tǒng)計(jì)學(xué) 進(jìn)行分析可提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。利用茶樹表達(dá)序列標(biāo)簽構(gòu)成的生物芯片進(jìn)行基因表達(dá)分析，有助于發(fā)現(xiàn)并克隆基 因家族新成員、基因定位克隆、作為序列標(biāo)簽位點(diǎn)進(jìn)行染色體的基因定位和基因圖譜制作、 遺傳突變位點(diǎn)的鑒定、分析基因在不同組織中的表達(dá)特異性和建立DNA物理圖譜和對(duì)細(xì)胞 和有機(jī)體的整體研究等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種茶樹表達(dá)序列標(biāo)簽構(gòu)成的基因
-H-· I I心片。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的，一種茶樹表達(dá)序列標(biāo)簽構(gòu)成的基 因芯片，該基因芯片以茶樹表達(dá)序列標(biāo)簽作為探針，由序列表中SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 4866序列的探針組成。諸序列點(diǎn)所對(duì)應(yīng)代表的EST編號(hào)及其對(duì)應(yīng)的矩陣號(hào)1 48 ；列 號(hào)1 18 ；行號(hào)1 20 卩，該4866個(gè)序列點(diǎn)排布在平行的48個(gè)矩陣單元中，每個(gè)序列 點(diǎn)設(shè)三個(gè)重復(fù)；該芯片中的每序列點(diǎn)是以100 1000個(gè)連續(xù)的核苷酸為探針的序列和/或 同源序列和/或其互補(bǔ)序列。進(jìn)一步地，所述的每個(gè)矩陣，其第一排1 15個(gè)序列點(diǎn)為內(nèi)參，第一排16 18個(gè) 序列點(diǎn)為陽性對(duì)照序列點(diǎn)，第二排1 3個(gè)序列點(diǎn)為陰性對(duì)照序列點(diǎn)，第二排4 18個(gè)序 列點(diǎn)和第三排1 9個(gè)序列點(diǎn)為外標(biāo)。進(jìn)一步地，所述的內(nèi)參，其是5個(gè)茶樹看家基因，即TC0024H07，TC0038D06, TC0047B06, TL004D11, TC0011C07。進(jìn)一步地，所述的陰性對(duì)照序列點(diǎn)為空白點(diǎn)樣液，即50% DMS0。進(jìn)一步地，所述的適合的載體是固相載體，其或?yàn)椴Ｆ?，或?yàn)楣杵?，或?yàn)槟猃埬?，?為硝酸纖維膜。 進(jìn)一步地，所述的核苷酸，其是脫氧核糖核酸，和/或核糖核酸，和/或多聚寡核苷酸。本發(fā)明的有益效果是由于本發(fā)明的基因芯片具備高通量的優(yōu)勢，可通過定量監(jiān) 測大量基因表達(dá)水平，闡述基因功能、探索疾病原因及機(jī)理、發(fā)現(xiàn)可能的診斷及治療靶。采 用本發(fā)明的基因芯片技術(shù)從整體水平研究功能基因的表達(dá)譜等技術(shù)是一種高通量的進(jìn)行 功能基因表達(dá)分析的研究手段，具有許多商用價(jià)值和科研價(jià)值1、可同時(shí)檢測除去對(duì)照點(diǎn)以外的4866條茶樹功能基因的表達(dá)情況；2、可用于克隆植物的重要功能基因，如抗病、抗逆、生長發(fā)育相關(guān)基因的克隆；3、應(yīng)用該表達(dá)序列標(biāo)簽芯片可用于作物種質(zhì)資源的鑒定評(píng)價(jià)；4、應(yīng)用該生物芯片也可用于對(duì)農(nóng)作物的雜種優(yōu)勢進(jìn)行早期預(yù)測，篩選出最佳的優(yōu) 勢雜交種；
5、應(yīng)用該生物芯片還可用于查找藥物的毒性和副作用，進(jìn)行毒理學(xué)研究，利于對(duì) 新型除草劑和新型農(nóng)藥的篩選；6、該生物芯片可用于植物的育種和植物新品種的產(chǎn)生；7、該生物芯片還可用于從整體上研究整個(gè)信使核糖核酸(mRNA)的表達(dá)，這對(duì)生 物體基因調(diào)節(jié)的整體性研究具有重要的科研和實(shí)踐指導(dǎo)價(jià)值；8、應(yīng)用該生物芯片還可以運(yùn)用突變體研究植物中胞間和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，為發(fā)現(xiàn)植 物中的基因功能和生理代謝途徑提供重要的理論依據(jù)；9、該生物芯片能夠作為一種商品，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)科學(xué)研究和實(shí)際生產(chǎn)中。


圖1是茶樹表達(dá)序列標(biāo)簽構(gòu)成的基因芯片矩陣分布示意圖；圖2是茶樹基因芯片矩陣點(diǎn)制示意圖；圖3是安吉白茶不同白化階段差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)表。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明研制了一種茶樹表達(dá)序列標(biāo)簽構(gòu)成的基因芯片。該芯片是在適合的載體面 上點(diǎn)制組合有4866個(gè)序列點(diǎn)，諸序列點(diǎn)所對(duì)應(yīng)代表的EST編號(hào)及其對(duì)應(yīng)的矩陣號(hào)1 48 ； 列號(hào)1 18 ；行號(hào)1 20 ；S卩，該4866個(gè)序列點(diǎn)排布在平行的48個(gè)矩陣單元中，每個(gè)序 列點(diǎn)設(shè)三個(gè)重復(fù)；該芯片中的每序列點(diǎn)是以100 1000個(gè)連續(xù)的核苷酸為探針的序列和/ 或同源序列和/或其互補(bǔ)序列。所述的每個(gè)矩陣，其第一排1 15個(gè)序列點(diǎn)為內(nèi)參，第一排16 18個(gè)序列點(diǎn)為 陽性對(duì)照序列點(diǎn)，第二排1 3個(gè)序列點(diǎn)為陰性對(duì)照序列點(diǎn)，第二排4 18個(gè)序列點(diǎn)和第 三排1 9個(gè)序列點(diǎn)為外標(biāo)。所述的內(nèi)參，其是5個(gè)茶樹看家基因，EST編號(hào)為TC0024H07，TC0038D06, TC0047B06, TL004D11, TC0011C07，其基因序列如 SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 5 所示。所述的陰性對(duì)照序列點(diǎn)為空白點(diǎn)樣液，S卩50% DMS0。所述的適合的載體是固相載體，其或?yàn)椴Ｆ?，或?yàn)楣杵驗(yàn)槟猃埬?，或?yàn)橄跛崂w維膜。所述的核苷酸，其是脫氧核糖核酸，和/或核糖核酸，和/或多聚寡核苷酸。本發(fā)明提供了一種用于檢測茶樹功能基因表達(dá)情況的基因芯片。該基因芯片以茶 樹葉片和幼根基因的非冗余cDNA片段作為探針，包含有4688個(gè)茶樹cDNA序列和5個(gè)茶樹 看家基因序列，8個(gè)和已知基因均沒有相似性的酵母基因間序列作為外標(biāo)及陰性對(duì)照，且每 個(gè)探針設(shè)置了 3個(gè)重復(fù)，便于對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。應(yīng)用該芯片對(duì)安吉白茶不同白化階段葉片進(jìn)行鑒定，結(jié)果獲取了 580個(gè)差異表達(dá) 基因，并構(gòu)建出了不同基因表達(dá)時(shí)間和空間上的表達(dá)譜。本發(fā)明不僅可用于構(gòu)建茶樹特異 品種不同生長發(fā)育階段、不同組織器官乃至特異細(xì)胞中的基因表達(dá)譜，還可用于批量檢測 茶樹在生物或非生物脅迫下的基因表達(dá)信息、篩選差異基因。應(yīng)用該芯片可實(shí)現(xiàn)基因表達(dá) 信息的高通量檢測，且操作方便、安全，檢測結(jié)果可靠、有效，可節(jié)省大量時(shí)間、人力、物力和 財(cái)力，具有廣闊的應(yīng)用前景。
下面根據(jù)附圖和實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，本發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯。實(shí)施例1茶樹葉片cDNA文庫的構(gòu)建一、茶樹葉片總RNA的提取春天取生長健壯的茶樹嫩葉lOOmg，迅速加液氮冷凍研磨成細(xì)粉末狀，加入 IOOOyL Trizol試劑(購自Gibco BRL)繼續(xù)研磨后，又再加入1000 μ L Trizol試劑，混勻 分裝到兩個(gè)經(jīng)焦炭酸二乙酯處理的1. 5mL離心管中，冰上放置5分鐘，各加入200 μ L的氯 仿，顛倒混勻，4°C 12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取500 μ L上清液，加入等體積的異丙醇，上 下輕輕顛倒10次，室溫放置10分鐘，4°C 12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，去上清，沉淀中加 入ImL 75%乙醇輕輕清洗，倒去乙醇，干燥后加入20 μ L經(jīng)焦炭酸二乙酯處理過的雙蒸水 溶解沉淀。甲醛凝膠變性電泳檢測RNA質(zhì)量后，放于_70°C冰箱中長期保存，備用。二、mRNA的分離和純化1、生物素標(biāo)記的Oligo (dT)探針與mRNA的退火在經(jīng)焦炭酸二乙酯處理不含RNA酶的1. 5mL離心管中加入0. 5mg總RNA，溶解于 500 μ L焦炭酸二乙酯處理水中，65°C水浴保溫10分鐘，加入3 μ L的Oligo (dT)探針，13 μ L ^ 20 X SSC(1L 20XSSC含175. 3g氯化鈉和88. 2g檸檬酸鈉，ρΗ 7.0)輕輕混勻，室溫放置 約10-20分鐘至冷卻。2、親和素順磁磁珠的沖洗將一管親和素順磁磁珠(購白Promega Corporation)輕輕懸浮后放入磁性分離 架中，使親和素順磁磁珠集中到管的一側(cè)，小心除去上清，用300yL 0.5XSSC清洗親和素 順磁磁珠三次，每次用磁性分離架集中磁珠，去除上清液，將清洗過的親和素順磁磁珠溶于 IOOyL 的 0.5XSSC 中備用。3、雜交體的生成和漂洗將已退火的生物素標(biāo)記探針，加入到溶于100 μ L的0. 5 X SSC的親和素順磁磁珠 中，輕輕混勻，室溫放置10分鐘，每隔1-2分鐘輕混勻一次，用磁性分離架捕獲磁珠親和素 順磁磁珠，小心去除上清，用300 μ L的0. 1 X SSC洗滌親和素順磁磁珠，磁性分離架集中后 去除上清液，共重復(fù)4次。4、洗脫 mRNA將漂洗過的親和素順磁磁珠重新懸浮于100μ L的焦炭酸二乙酯水中，用磁性分 離架捕獲磁珠，將洗脫的水相吸至一新管中，重復(fù)清洗親和素順磁磁珠，共得到250 μ L的 mRNA。5、mRNA的沉淀和溶解加入0. IX體積的醋酸鈉(ρΗ 5. 2)和IX體積的異丙醇沉淀mRNA，-20°C過夜。 12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，去上清。加入ImL的75 %的乙醇懸浮后，離心片刻，去上清， 干燥，復(fù)溶于30 μ L的焦炭酸二乙酯處理的水中。3. 5yL mRNA加入16. 5 μ L上樣緩沖液 (按7 33配)混勻后在95°C變性2分鐘，拿出后立即放入冰上，防止退火，甲醛凝膠變性 電泳時(shí)，電泳槽置于冰上，保證低溫。電壓不超過5v/cm。三、cDNA第一鏈合成在0. 5mL的離心管中，分別加入3 μ L的茶樹mRNA，IyL 10 μ M 5，PCR第一鏈合 成引物(5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3，)，1 μ L 10 μ M 3，PCR 弓|物(5，-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)‘ ) (N = A，G，C 或者 T ；N^1 = A, G, C)。 混勻，稍離心，72°C溫育2分鐘，冰上冷卻2分鐘，離心把組分收集到底部，每管中加入2μ L 5 X第一鏈合成緩沖液，1 μ L二硫蘇糖醇(20mM)，1 μ L dNTP混合物(IOmM)，1 μ L反轉(zhuǎn)錄酶， 至總體積為10yL。經(jīng)渦旋、瞬間離心混勻，在PTC-220 PCR儀中42°C溫育1小時(shí)后，取出 放于冰上，終止第一鏈的合成。放于-20°C冰箱中可保存3個(gè)月，備用。四、cDNA第二鏈的合成先把PCR儀加熱到95 °C。在一個(gè)0. 5mL的離心管中加入2yL第一鏈cDNA，80yL 無離子水，IOyL 10XPCR緩沖液，2μ L 50 X dNTP mix,2y L 10 μ M 5，PCR第二鏈合成引物 (5‘-AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGT_3，)，2yL 3，PCI^|*(5，-ATTCTAGAGG CCGAGGCGGCCGACA TG-d (T) 30^^-3' ) (N = A，G，C 或者 T ；N^1 = A，G，C)，2 μ L 50 X 聚合酶混合物至總體積為 100 μ L，輕輕振動(dòng)混勻，稍離心，將物質(zhì)收集到底部，必要時(shí)加2滴礦物油以覆蓋液面。放進(jìn) 經(jīng)預(yù)熱到95°C的PCR儀中，PCR反應(yīng)程序如下95°C變性20秒，接著95°C 5秒，68°C 6分 鐘共24個(gè)循環(huán)，PCR結(jié)束后，取5yL用1. 瓊脂糖凝膠電泳檢測。其余放于-20°C冰箱 可保存3個(gè)月。五、Sfi I酶切獲得可連接的cDNA1、在一個(gè)0. 5mL的離心管中加入79 μ L cDNA10 μ L IOXSfi I 緩沖液10 μ L Sfi I 內(nèi)切酶(20 單位 / μ L)IyL IOOX牛血清白蛋白充分混勻2、50°C水浴保溫2小時(shí)，取出后放于-20V冰箱中3、分離時(shí)再加入2μ L 二甲苯青，充分混勻六、建庫用cDNA分離1、將約100 μ L經(jīng)Sfi I酶切的cDNA和二甲苯青的混合物加到CHROMA SPIN-400 柱(Clontech Laboratories, Inc.)膠頂部中心表面。2、用100 μ L的柱子緩沖液清洗含有cDNA的管，再輕倒入膠表面。3、讓緩沖液流光，當(dāng)停止時(shí)，繼續(xù)下一步，讓染料層進(jìn)入膠內(nèi)幾毫米。4、將放有16個(gè)管子的架子放在柱子下面，第一個(gè)管子正在柱子下的出口。5、加600 μ L的柱子緩沖液，立即開始收集，每管35 μ L (約1滴)，收集后的管子立 即加蓋，當(dāng)都收集完后，蓋上柱子的蓋子。6、在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，檢查每個(gè)管子的組分，在1. 的瓊脂糖/EB膠上電泳，每管用 3 μ L連續(xù)在點(diǎn)樣孔加樣，用Ikb DNA Marker作分子量標(biāo)記，150V電泳10分鐘。收集最亮 的3-4個(gè)組分到一個(gè)新1. 5mL的管中。7、加入 1/10 體積醋酸鈉(3M ；pH4. 8)，1. 3 μ L 糖原(20mg/mL)和 2. 5 體積的 95% 乙醇，_20°C過夜。9、室溫14000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘。10、小心去上清。11、輕離心，去剩余的上清，干燥約10分鐘后溶于7μ L的無離子水。七、cDNA與載體連接
1、按下列組分準(zhǔn)備一個(gè)連接反應(yīng)對(duì)照(UL)樣祝
(UL)
cDNA1. 01. 0
λ TripIEx2 載體(500ng/1. 01. 0
IOX連接酶緩沖液0. 50. 5
ATP(IOmM)0. 50. 5
T4 DNA連接酶(400單位./μ L)0. 50. 5
無離子水1. 51. 5
總體積5. 05. 0
2、輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，瞬間離心使組分沉到底部，16°C連接過夜
3、對(duì)于每一個(gè)連接，做一個(gè)包裝反應(yīng)。 八、包裝反應(yīng)
1、在每一個(gè)連接產(chǎn)物中加入25μ L的包裝蛋白。
2、30°C溫育90分鐘。
3、取出放于4°C冰箱中可保存2周。經(jīng)過擴(kuò)增的文庫可以在4°C穩(wěn)定保存6-74
月，或在7%二甲基亞砜中-70°C至少保存1年以上。九、測定滴度從平板中挑取分離良好的單克隆接種到含15mL LB/硫酸鎂/麥芽糖培養(yǎng)基的 50mL試管中，140轉(zhuǎn)/分鐘震蕩37°C培養(yǎng)過夜直至OD值達(dá)到2. 0，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分 鐘，去上清液，用7. 5mL IOmM硫酸鎂重新懸浮沉淀。將包裝產(chǎn)物用噬菌體緩沖液稀釋5_20 倍，在200 μ L過夜培養(yǎng)的XL-IBlue受體菌中加入1 μ L稀釋的噬菌體，讓噬菌體在37°C吸 收10-15分鐘，再加入2mL溶解的LB/硫酸鎂頂層瓊脂?？焖兕嵉够靹虿⒌谷虢?jīng)37°C預(yù)熱 的LB/硫酸鎂平板，快速搖動(dòng)平板使均勻分布，室溫冷卻10分鐘讓頂層瓊脂變硬，倒置平板 在37°C培養(yǎng)6-17小時(shí)，統(tǒng)計(jì)菌斑并根據(jù)公式文庫滴度(pfu/mL)=(噬菌斑數(shù)X稀釋倍 數(shù))/受體菌的體積，計(jì)算未擴(kuò)增文庫滴度6. 8X105pfu/mL,總克隆數(shù)為3. 5 X IO5個(gè)。十、文庫重組率的測定本文庫可以利用X-Gal顯色原理測定重組率，在測定滴度時(shí)加入IOOmM的IPTG及 IOOmM的X-Gal，過夜培養(yǎng)后，通過藍(lán)斑(未重組克隆)、白斑(重組克隆)的數(shù)量計(jì)算重組 率為 98. 05%。i^一、cDNA插入片段的PCR鑒定從LB平板上隨機(jī)挑取15-20個(gè)獨(dú)立的噬菌斑，分別加到含有200 μ L噬菌體緩 沖液的離心管中，37 °C放置1小時(shí)后，保存于4°C，利用XTripEX2噬菌體5’ PCR引物 (5，-CTCCGAGATCTGGACGAGCT-3，)和 3' PCR 引物(5，-GGGATATCACTCAG CATAAT-3，)對(duì)構(gòu) 建的文庫進(jìn)行PCR鑒定。PCR結(jié)果表明插入片段大多分布在0. 5-2. Okb之間，絕大部分在 1. 0-1. 5kb 左右。實(shí)施例2茶樹幼根cDNA文庫的構(gòu)建一、幼根總RNA的提取將茶樹龍井43的儲(chǔ)存種子播種于一定濕度的石英砂中，室溫25°C培養(yǎng)室中培養(yǎng)， 待長出幼苗后，取其幼根lOOmg，迅速加液氮冷凍研磨成細(xì)粉末狀，加入1000 μ L Trizol試劑繼續(xù)研磨后，再加入1000 μ L Trizol試劑，混勻分裝到兩個(gè)經(jīng)DEPC (焦炭酸二乙酯)處 理的1. 5mL離心管中，冰上放置5min，各加入200 μ L的氯仿，顛倒混勻，4°C 12000rpm離 心lOmin，取500 μ L上清液，加入等體積異丙醇，上下輕輕顛倒10次，室溫放置lOmin，4°C 12000rpm離心lOmin，去上清，沉淀中加入ImL 75%乙醇輕輕清洗，倒去乙醇，干燥后加入 20 μ L經(jīng)DEPC處理過的ddH20溶解沉淀。甲醛凝膠變性電泳檢測RNA質(zhì)量后于_70°C冰箱 中長期保存，備用。二、mRNA的分離和純化采用實(shí)施例1，“茶樹葉片cDNA文庫的構(gòu)建”中的“mRNA的分離和純化”所描述的 流程、方法分離和純化幼根mRNA。三、cDNA第一鏈合成在RNase-free 的 0. 2ml PCR 管中，加入 3 μ L 上面提取的 mRNA，1 μ L 帶有 Xho I 酶切位點(diǎn)的引物(5 ‘ -GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ‘)， 8 μ L的RNase-free ddH20?；靹蚝?，70°C反應(yīng)lOmin，冰上冷卻2min，離心把組分收集到底 部，按順序加入以下試劑4μ L 5Χfirst strand buffer2μ L 0. IM DTT1 μ L dNTP (IOmM)混勻后稍離心，42°C放置2min，反應(yīng)完成，趁熱加入IyL Superscipt II_RT，42°C 反應(yīng)50min，然后70°C水浴15min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。四、cDNA第二鏈的合成第一鏈反應(yīng)完成后，取2yL 第一鏈 cDNA，140yL ddH20, 20 μ L IOXDNA Polymerase I buffer,6y L IOmM dNTP,1 μ L RNase H(2U/μ L)，10 μ M DNA Polymerase Ι(10υ/μ L)，總體系為200 μ L?；靹蚝?，16°C反應(yīng)2. 5hr，70°C滅活lOmin，反應(yīng)完成后，得到 200 μ L cDNA第二鏈反應(yīng)體系，將此體系置于冰上，取2 μ L 二鏈產(chǎn)物，同保存的一鏈產(chǎn)物一 起電泳鑒定。同時(shí)上Ikb ladder，確定雙鏈的大小范圍。五、雙鏈cDNA末端補(bǔ)平1.在第二鏈反應(yīng)體系中，順序加入下列試劑6μ L dNTP(IOmM)2 μ L T4 DNA Polymerase (8. 7U/ μ L)2μ L BSA(10mg/ml)2.稍微離心混勻反應(yīng)物，37°C反應(yīng)至少30min，然后75°C滅活I(lǐng)Omin ；3.加入等體積酚/氯仿/異戊醇，劇烈振蕩后，常溫下13000g離心5min ；4.離心后，吸取上清于另一 1. 5ml離心管中，加入等體積氯仿，上下顛倒幾次混勻 后，常溫下13000g離心5min ；5.吸取上清至新離心管中，加入1/10體積的3M NaAc (PH5. 2)和2. 5倍體積的預(yù) 冷的無水乙醇，混勻，_20°C放置過夜以沉淀雙鏈cDNA ；6.將過夜的沉淀物在4°C，13000g離心60min以充分沉淀雙鏈cDNA ；7.離心完畢，棄上清，加入Iml 70%乙醇洗滌沉淀，常溫下13000g離心5min ；8.離心完畢，棄上清，干燥沉淀至無乙醇?xì)馕丁 adaptor(400ng/yL)，4°C 至少放置
0118]六、EcoR I adaptor 力口接
0119]1.往雙鏈cDNA沉淀中加入9yL EcoR 30min以充分溶解cDNA沉淀；
0120]2.溶解完成后，順序加入下列試劑
0121]1. 2μ L IOXLigase Buffer
0122]1 μ L ATP(IOmM)
0123]1 μ L T4 DNA Ligase (4U/ μ L)
0124]3.混勻后，8°C過夜連接；
0125]七、雙鏈cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切
0126]1.連接反應(yīng)完成后，將反應(yīng)體系在70°C水浴15min，滅活T4 DNA Ligase ；
0127]2.稍微離心使反應(yīng)物集中至管底，室溫下放置5min，然后加入下列試劑
0128]1 μ L IOXLigase Buffer
0129]1 μ L ATP(IOmM)
0130]6 μ L dd H2O
0131]1 μ L T4 PNK (1OU/μ L)
0132]3. 37°C反應(yīng) 30min 后，70°C滅活 15min ；
0133]4.稍微離心使反應(yīng)物集中至管底，室溫放置5min后，加入下列試劑
0134]4μ L Xho IOXBuffer
0135]2μ L BSA
0136]5 μ L ddH20
0137]8μ L Xho I(10U/y L)
0138]5. 37°C反應(yīng) 1. 5hr，然后 65°C滅活 IOmin ；
0139]6.反應(yīng)完成后將雙鏈cDNA回收，然后與同樣經(jīng)Xho I酶切的pBluescript載體連接。
0140]八、cDNA與載體連接
0141]1.按下列組分準(zhǔn)備一個(gè)連接反應(yīng) 對(duì)照(yL) 樣品(yL)
0142]cDNAO6.5
0143]ddH206.5O
0144]IOXligase buffer1. O1. O
0145]ATP(IOmM)1. O1. O
0146]pBluescript vector1.O1.O
0147]T4 DNA ligase (4U/μ L)1. O1. O
0148]總體積10.010.0
0149]2.輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，瞬間離心使組分沉到底部，12°C連接過夜。
0150]3.將連接產(chǎn)物在純化膜上純化一個(gè)半小時(shí)，然后吸到一個(gè)新的PCR管里，_20°C保 存?zhèn)溆谩?br> 0151]九、電轉(zhuǎn)化
0152]1.從-80°C冰箱中取出制備好的感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍；
0153]2.取1 μ L純化后的連接產(chǎn)物于1. 5ml的離心管中，將其和0. ICM的電極杯一起置于冰上預(yù)冷；3.將40 μ L解凍的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至此1.5ml的離心管中，小心混勻，冰上放置 IOmin ；4.打開電轉(zhuǎn)儀，調(diào)節(jié)電壓為2. IKV ；5.將此混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電極杯中，輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進(jìn)入電極 杯的底部；6.將電極杯推入電轉(zhuǎn)化儀，按下pulse鍵，聽到蜂鳴后，向電擊杯中迅速加入 500 μ L的SOC液體培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到1. 5ml的離心管中；7.將離心管置于37°C，220rpm復(fù)蘇1小時(shí)；8.取20 μ L轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加160 μ L SOC涂板，放于37°C過夜培養(yǎng)；9.其余菌液加1 1的30%甘油后，混勻_80°C保存。十、文庫重組率的測定利用X-Gal顯色原理測定重組率，在測定滴度時(shí)加入IOOmM的IPTG及IOOmM的 X-Gal過夜培養(yǎng)后，通過藍(lán)斑(未重組克隆)、白斑(重組克隆)的數(shù)量計(jì)算重組率。實(shí)施例3，茶樹葉片及幼根表達(dá)序列標(biāo)簽測序以前面構(gòu)建的茶樹葉片cDNA文庫和茶樹幼根cDNA文庫為測序EST的文庫來源， 采用自動(dòng)測序儀Megabace 1000對(duì)龍井43新梢cDNA文庫的4320個(gè)克隆進(jìn)行隨機(jī)測序 分析，獲得有效序列2963個(gè)，將所有有效序列進(jìn)行去重復(fù)和拼接后獲得新梢表達(dá)序列標(biāo)簽 1692個(gè)；對(duì)幼根cDNA文庫的5115個(gè)克隆進(jìn)行隨機(jī)測序分析，獲得有效序列4833個(gè)，大部 分序列長度在300bp-700bp之間，平均長度474bp，將所有有效序列進(jìn)行去重復(fù)和拼接后獲 得幼根表達(dá)序列標(biāo)簽3482個(gè)。將得到的所有非冗余序列與GenBank的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 BlastX比對(duì)分析，結(jié)果與已知防衛(wèi)病、蟲等生物脅迫及干旱、寒冷等非生物脅迫相關(guān)基因 200多個(gè)、還含有大量與已知擬境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、以及在能量代謝、基礎(chǔ)代 謝中起作用的關(guān)鍵基因。最后選取了 1692條葉片表達(dá)序列標(biāo)簽和3174條幼根表達(dá)序列標(biāo) 簽用作芯片探針。實(shí)施例4，芯片的制備一、探針的制備將1692條葉片表達(dá)序列標(biāo)簽和3174條幼根表達(dá)序列標(biāo)簽對(duì)應(yīng)的克隆挑選出來， 重新排列后，搖菌并提取質(zhì)粒，以此為模板PCR擴(kuò)增目的片段，將PCR擴(kuò)增得到的兩部分序 列用乙醇沉淀法進(jìn)行純化，測定濃度后，定量到250ng/ μ L，取10 μ L轉(zhuǎn)移到384孔板上。二、外標(biāo)基因片段的制備選取了釀酒酵母基因間的8段序列(編號(hào)為Υ1-Υ8)，經(jīng)過序列同源性的BLAST比 對(duì)，這8段核酸序列和NCBI上所有已知的核酸序列都沒有同源性。把這8段序列以酵母 基因組DNA為模板經(jīng)過PCR擴(kuò)增出來，然后把此8段核酸序列克隆到以下帶有PolyA的 pSP64Poly(A)質(zhì)粒載體中，通過體外轉(zhuǎn)錄的方法制備外標(biāo)核酸序列對(duì)應(yīng)的PolyA-RNA。把 此PolyA-RNA按照不同比例的數(shù)量摻入到實(shí)驗(yàn)樣品的RNA中去，一同進(jìn)行標(biāo)記、雜交。在芯 片上也點(diǎn)有外標(biāo)核酸DNA序列，因此雜交后，在芯片上外標(biāo)DNA序列對(duì)應(yīng)的點(diǎn)就會(huì)有雜交信 號(hào)，并且通過調(diào)節(jié)摻入PolyA-RNA的量而得到外標(biāo)的不同雜交信號(hào)。三、芯片的點(diǎn)制
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取5yL純化產(chǎn)物，加5yL 2XDNA點(diǎn)樣液至384孔板中，用博奧生物有限公司的 SmartArrayerTM-48型點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣，矩陣設(shè)計(jì)為48小圍欄分布方式(圖1)。所有矩陣的設(shè) 計(jì)完全相同。每個(gè)矩陣的排列方式為18x20，每點(diǎn)重復(fù)3次。其中第一排1 15個(gè)序列點(diǎn) 為內(nèi)參，第一排16 18個(gè)序列點(diǎn)為陽性對(duì)照序列點(diǎn)，第二排1 3個(gè)序列點(diǎn)為陰性對(duì)照序 列點(diǎn)，第二排4 18個(gè)序列點(diǎn)和第三排1 9個(gè)序列點(diǎn)為外標(biāo)，其余為茶樹表達(dá)序列標(biāo)簽 序列，如圖2所示。實(shí)施例5用本發(fā)明的基因芯片檢測安吉白茶不同白化階段的基因表達(dá)差異一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備及RNA的提取分別于2008年4月1號(hào)、11號(hào)、24號(hào)、30號(hào)和6月13號(hào)采摘白茶不同白化階段的 的茶樹葉片，液氮處理后，保存于_70°C冰箱中備用。Trizol—步法提取葉片總RNA，通過異 丙醇沉淀法濃縮RNA，并進(jìn)一步采用NucleoSpinRNA clean-up試劑對(duì)總RNA進(jìn)行過柱純 化，最后用分光光度計(jì)定量，甲醛變性膠電泳質(zhì)檢。檢測結(jié)果顯示樣本RNA電泳條帶清晰， 28S比18S rRNA條帶亮度接近1 1，質(zhì)量合格，總量夠用，可進(jìn)行芯片實(shí)驗(yàn)。二、芯片雜交設(shè)計(jì)將提取好的5份樣品組成具有可比性的4組，分別為BC4-11 vs BC4_1、BC4_24 vs BC4-UBC4-30 vs BC4-1和BC6-13 vs BC4-1，進(jìn)行芯片比較實(shí)驗(yàn)。在同一張芯片上雜交的 兩個(gè)樣品分別用二種不同的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，并設(shè)計(jì)熒光交換以保證試驗(yàn)準(zhǔn)確性。三、對(duì)樣品RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記以Total RNA為起始，含有T7啟動(dòng)子序列的T7 Oligo (dT) Primer為引物，使 用CbcScript酶合成lst_strand cDNA,用RNase H將雜合鏈中的RNA切成短片段，DNA Polymerase以RNA短片段為引物延伸，合成2nd-strand cDNA，并純化雙鏈cDNA。以cDNA為 模板，利用 T7 Enzyme Mix 合成 cRNA ；然后用 RNA Clean-up Kit(MN)純化。取 2yg cRNA, 用 CbcScript II 酶，Random Primer 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用 PCR NucleoSpinExtract II Kit(MN)純化。取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以Random Primer為引物進(jìn)行KLENOW酶標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物 用 PCR NucleoSpinExtract II Kit(MN)純化，純化后抽干。四、雜交與清洗標(biāo)記的DNA溶于80 μ 1雜交液中，于42°C雜交過夜。雜交結(jié)束后，先在42°C左右 含0.2% SDS，2XSSC的液體中洗5min，而后在0. 2XSSC中室溫洗5min。玻片甩干后用 LuxScan IOKA雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描。五、數(shù)據(jù)采集及分析采用LuxScan 3. O圖像分析軟件對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信 號(hào)；采用Lowess方法對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化；并刪除了熒光信號(hào)弱的基因以及芯片上的陰 性對(duì)照、內(nèi)標(biāo)、外標(biāo)等冗余的數(shù)據(jù)。根據(jù)歸一化后的結(jié)果得到每張芯片中基因的ratio值， 再將兩張熒光交換芯片的ratio值整合，ratio = (ratiol*ratio2) "0. 5，用SAM軟件進(jìn)行 分析，再以上調(diào)或下調(diào)1. 5倍標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。結(jié)果顯示6月13號(hào)和4月1號(hào)的葉 片雜交結(jié)果中，檢測到差異表達(dá)的基因580個(gè)，其中上調(diào)427個(gè)，下調(diào)153個(gè)；4月30號(hào)和4 月1號(hào)的葉片雜交結(jié)果中，檢測到差異表達(dá)的基因427個(gè)，其中上調(diào)304，下調(diào)123 ；4月24 號(hào)和4月1號(hào)的葉片雜交結(jié)果中，檢測到差異表達(dá)的基因337個(gè)，其中上調(diào)122，下調(diào)215 ； 4月11號(hào)和4月1號(hào)的葉片雜交結(jié)果中，檢測到差異表達(dá)的基因337個(gè)，其中上調(diào)14，下調(diào)67(圖3)。6月13號(hào)的復(fù)綠葉片與4月1號(hào)的白化葉片之間得到了最多的顯著差異表達(dá) 基因，其中光和作用相關(guān)基因49個(gè)、碳固定相關(guān)基因24個(gè)，還有多個(gè)逆境防衛(wèi)基因、次生代 謝途徑基因、轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因等。以上結(jié)果表明本發(fā)明的芯片具有足夠量的探針，可檢測到大 量差異表達(dá)基因，靈敏度較高，可用于快速、批量檢測茶樹特異品種不同生長發(fā)育階段、不 同組織器官乃至特異細(xì)胞中的基因表達(dá)譜，以及茶樹在生物或非生物脅迫下的基因表達(dá)信 息、篩選差異基因。
權(quán)利要求
一種茶樹表達(dá)序列標(biāo)簽構(gòu)成的基因芯片，其特征在于該基因芯片以茶樹表達(dá)序列標(biāo)簽作為探針，由序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.4866序列的探針組成。諸序列點(diǎn)所對(duì)應(yīng)代表的EST編號(hào)及其對(duì)應(yīng)的矩陣號(hào)1～48；列號(hào)1～18；行號(hào)1～20；即，該4866個(gè)序列點(diǎn)排布在平行的48個(gè)矩陣單元中，每個(gè)序列點(diǎn)設(shè)三個(gè)重復(fù)；該芯片中的每序列點(diǎn)是以100～1000個(gè)連續(xù)的核苷酸為探針的序列和/或同源序列和/或其互補(bǔ)序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述茶樹表達(dá)序列標(biāo)簽構(gòu)成的基因芯片，其特征在于所述的每個(gè) 矩陣，其第一排1 15個(gè)序列點(diǎn)為內(nèi)參，第一排16 18個(gè)序列點(diǎn)為陽性對(duì)照序列點(diǎn)，第二 排1 3個(gè)序列點(diǎn)為陰性對(duì)照序列點(diǎn)，第二排4 18個(gè)序列點(diǎn)和第三排1 9個(gè)序列點(diǎn)為 外標(biāo)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述茶樹表達(dá)序列標(biāo)簽構(gòu)成的基因芯片，其特征在于所述的內(nèi)參， 其是 5 個(gè)茶樹看家基因，即TC0024H07，TC0038D06，TC0047B06，TL004D11，TC0011C07，其基 因序列如SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 5所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述茶樹表達(dá)序列標(biāo)簽構(gòu)成的基因芯片，其特征在于所述的陰性 對(duì)照序列點(diǎn)為空白點(diǎn)樣液，即50% DMS0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述茶樹表達(dá)序列標(biāo)簽構(gòu)成的基因芯片，其特征在于所述的適合 的載體是固相載體，其或?yàn)椴Ｆ?，或?yàn)楣杵?，或?yàn)槟猃埬ぃ驗(yàn)橄跛崂w維膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述茶樹表達(dá)序列標(biāo)簽構(gòu)成的基因芯片，其特征在于所述的核苷 酸，其是脫氧核糖核酸，和/或核糖核酸，和/或多聚寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種茶樹表達(dá)序列標(biāo)簽構(gòu)成的基因芯片。該基因芯片以茶樹表達(dá)序列標(biāo)簽作為探針，由序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.4866序列的探針組成。本發(fā)明不僅可用于批量檢測不同茶樹品種在生物或非生物脅迫下的基因表達(dá)信息、篩選差異基因，還可用于構(gòu)建茶樹品種不同生長階段、不同組織器官乃至特異細(xì)胞中的基因表達(dá)譜。應(yīng)用該芯片可實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)信息的高通量檢測，且操作方便、安全，檢測結(jié)果可靠、有效，可節(jié)省大量時(shí)間、人力、物力和財(cái)力，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101942514SQ20101026948
公開日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者姚明哲, 王新超, 金基強(qiáng), 陳亮, 馬春雷 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所