專利名稱：鑒別奧利亞羅非魚(yú)遺傳性別的引物、片段與方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一組鑒別奧利亞羅非 魚(yú)遺傳性別的引物、片段與方法。
背景技術(shù)：
魚(yú)類的遺傳學(xué)研究及育種實(shí)踐中常常要求鑒別其性染色體組成，但是 大多數(shù)魚(yú)類性染色體分化程度較低，沒(méi)有性染色體，少數(shù)魚(yú)類經(jīng)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)證明存在性染 色體，但從細(xì)胞遺傳學(xué)上卻鑒別不出。加之魚(yú)類性別分化在胚胎發(fā)育過(guò)程中易受環(huán)境因素 影響(如溫度、光照和食物等)，導(dǎo)致其性別表型與遺傳型不一致。因此，有必要探尋一種可 以識(shí)別其遺傳組成的簡(jiǎn)便方法，而性別特異性的分子標(biāo)記無(wú)疑是一種簡(jiǎn)捷有效的遺傳性別 鑒別方法。奧利亞羅非魚(yú)(Oreochromis aureus)是我國(guó)引進(jìn)的幾種羅非魚(yú)中經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高 的種類之一。羅非魚(yú)雄性比雌性生長(zhǎng)速度快40%以上，因此準(zhǔn)確鑒別其遺傳性別對(duì)于性控 育種具有重要的研究意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。研究證實(shí)奧利亞羅非魚(yú)為ZW性別決定型，其染色體 核型中有1對(duì)特別人的染色體可能是性染色體，但這對(duì)染色體形態(tài)相似，因此也無(wú)法利用 傳統(tǒng)的核型分析來(lái)鑒別其遺傳性別。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記技術(shù)(RAPD、AFLP、SSR等)可以從分子水平上直接尋 找與目標(biāo)性狀相關(guān)的DNA片段，為魚(yú)類遺傳性別的鑒定提供了新的有效途徑。運(yùn)用分子標(biāo) 記技術(shù)已經(jīng)在半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)等魚(yú)類找到性別相關(guān)DNA片段，可以用 來(lái)鑒別其遺傳性別。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有關(guān)利用分子標(biāo)記成功鑒別奧利亞羅非魚(yú)遺傳性別的報(bào)道，本發(fā) 明填補(bǔ)了該領(lǐng)域的空白。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明內(nèi)容分列如下1. 一組鑒別奧利亞羅非魚(yú)遺傳性別的引物，其特征在于該組引物的序列是由 SEQID NO 1所示序列設(shè)計(jì)合成的。2.如1所述的引物，其序列長(zhǎng)度為18 28nt。3.如1或2所述的引物，其序列是由SEQ ID NO=I所示序列中連續(xù)300bp以上的 序列設(shè)計(jì)合成的。4.如1 3所述的引物，其中一對(duì)引物序列為SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示 的序列。5. 一段鑒定奧利亞羅非魚(yú)遺傳性別的DNA片段，其特征在于該片段的序列包括 SEQ ID NO 1所示序列。6. 一種鑒定奧利亞羅非魚(yú)遺傳性別的方法，其特征在于該方法是根據(jù)樣品的PCR 反應(yīng)產(chǎn)物的電泳結(jié)果鑒定樣品性別。7.如6所述的方法，其特征在于該方法中PCR引物由SEQ ID NO :1所示序列中連 續(xù)300bp以上的序列設(shè)計(jì)合成的。8.如6或7所述的方法，其特征在于該方法中PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果中出現(xiàn)一段300 1500bp大小條帶的樣品為雌性，而相同部位沒(méi)有出現(xiàn)條帶的樣品為雄性。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明目的是提供鑒別奧利亞羅非魚(yú)遺傳性別的一組引物和一段DNA片段；本發(fā)明的另一目的是提供一種鑒別奧利亞羅非魚(yú)遺傳性別的方法。本發(fā)明運(yùn)用RAPD方法在雌性?shī)W利亞羅非魚(yú)基因組中擴(kuò)增出一條雌性特異條帶， 通過(guò)克隆和測(cè)序獲得了一段長(zhǎng)度為1488bp的DNA序列，如SEQ ID N0:1所示，并據(jù)此設(shè)計(jì) 了一組鑒別奧利亞羅非魚(yú)遺傳性別的引物，優(yōu)選SEQ ID N0:1序列中可產(chǎn)生300bp以上擴(kuò) 增產(chǎn)物的序列部分設(shè)計(jì)物。引物長(zhǎng)度為18 28nt，其中小于ISnt時(shí)非特異性條帶出現(xiàn)， 大于28nt時(shí)引物容易自身聚合。本發(fā)明實(shí)施例提供了一對(duì)引物，其序列如SEQID NO :2和 SEQ ID NO 3 所示。本發(fā)明提供一種鑒別奧利亞羅非魚(yú)遺傳性別的方法，其特征在于方法是根據(jù)樣品 的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果鑒定樣品的性別。該方法中PCR引物由SEQ ID NO :1所示的序 列間隔不少于300bp的序列設(shè)計(jì)合成的。該方法中PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果中出現(xiàn)一段300 1500bp左右條帶的樣品為雌性，而相同部位沒(méi)有出現(xiàn)條帶的樣品為雄性。PCR 反應(yīng)體系為 25 μ 1 時(shí)，體系含 10XBuffer2. 5μ 1 ；MgCl22 μ 1 ；dNTP(各 2. 5 μ mol/L) 2 μ 1 ；雌性特異性上下游引物各0. 1 0. 2 μ mol/L ；Taq DNA聚合酶 (TaKaRa) IU ；基因組DNA 20 30ng。反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；35個(gè)循環(huán)94°C 30 40sec，60 64°C 50 80sec，72°C 50 80sec ；接著 72°C延伸 7 IOmin ；4°C保存。本發(fā)明一共使用了 800個(gè)RAPD隨機(jī)引物，各引物均擴(kuò)增出了 6 9條多態(tài)性條帶， 其中引物RAPD71699 (GTGACGTAGG)能夠在雌性個(gè)體基因組DNA中擴(kuò)增出一條大小約1500bp 左右的特征條帶，而相同位置上雄性個(gè)體基因組DNA沒(méi)有出現(xiàn)(圖1)。將上述特征條帶克隆、測(cè)序，獲得序列如SEQ ID NO 1所示。將序列與NCBI數(shù)據(jù) 庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)該序列從40bp至332bp處共293bp長(zhǎng)的片段與另一種麗魚(yú)科(Cichlidae)魚(yú)類 Astatotilapia burtoni 的 Hoxba 基因家族(GcnBank :EF594310. 1)Hoxb7a 基因禾口 Hoxb6a 基因之間的重復(fù)序列的同源性較高，序列一致性高達(dá)93%，其功能尚不可知(SimoneHoegg 等)，其余部分沒(méi)有發(fā)現(xiàn)較高同源性序列。由序列SEQ ID NO=I設(shè)計(jì)構(gòu)建2個(gè)寡核苷酸鏈(引物)SEQ ID NO 25' -GTGACGTAGGTAGAATCATGGCGGC-3，SEQ ID NO 35' -GTGACGTAGGGAGAGAGAACTTGTT-3’用24個(gè)已知性別的奧利亞羅非魚(yú)檢驗(yàn)這對(duì)引物的有效性，PCR反應(yīng)顯示所有被測(cè) 雌性個(gè)體DNA電泳都出現(xiàn)一條1500bp左右的特征條帶，而所有被測(cè)雄性個(gè)體相應(yīng)位置上都 沒(méi)有出現(xiàn)該特征條帶(圖2)。綜上所述，本發(fā)明提供了一段長(zhǎng)度為1488bp的奧利亞羅非魚(yú)雌性特異的DNA序 列，并根據(jù)該序列設(shè)計(jì)的引物，可以用于奧利亞羅非魚(yú)遺傳性別的鑒定。實(shí)施例證明了引物 和PCR方法可以100%鑒別奧利亞羅非魚(yú)的遺傳性別。


圖1、RAPD反應(yīng)結(jié)果，其中7個(gè)雌性個(gè)體(早標(biāo)示)的電泳條帶上有一個(gè)特異條帶 (箭頭所示位置)，而7個(gè)雄性個(gè)體($標(biāo)示)相應(yīng)位置上沒(méi)有。圖2、PCR反應(yīng)結(jié)果，所有被測(cè)雌性個(gè)體DNA電泳都出現(xiàn)一條1500bp左右的特征條 帶，而所有被測(cè)雄性個(gè)體相應(yīng)位置上都沒(méi)有出現(xiàn)該特征條帶。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例用常規(guī)DNA提取方法分別提取雌雄各12個(gè)奧利亞羅非魚(yú)的基因組DNA，稀釋到 IOng/μ 1以備PCR擴(kuò)增使用；PCR引物采用本發(fā)明根據(jù)奧利亞羅非魚(yú)雌性特異性DNA片段設(shè)計(jì)的特異性引物5， -GTGACGTAGGTAGAATCATGGCGGC-3，5’ -GTGACGTAGGGAGAGAGAACTTGTT-3’PCR 反應(yīng)體系為 25 μ 1，體系含 10 X Buffer2. 5 μ 1 ；MgCl22 μ 1 ；dNTP (各 2· 5 μ mol/ L)2y 1 ；雌性特異性上下游引物各0. 2μπι01/1;Τεκι DNA聚合酶(TaKaRa) IU ；基因組DNA 20ng。反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性 5min ；35 個(gè)循環(huán)-MV 40sec，62. 3V 50sec，72°C 50sec ；接 著72°C延伸7min ；4°C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，照相，結(jié)果如圖 2所示從上圖可以看出，在所有被測(cè)雌性個(gè)體中DNA電泳都出現(xiàn)一條1500bp左右的特征 條帶，而所有被測(cè)雄性個(gè)體相應(yīng)位置上都沒(méi)有出現(xiàn)該特征條帶，由此證實(shí)了根據(jù)獲得的奧 利亞羅非魚(yú)雌性特異性DNA片段設(shè)計(jì)合成的引物為雌性特異，同時(shí)也表明本發(fā)明提供的引 物、片段和方法可以應(yīng)用于奧利亞羅非魚(yú)遺傳性別的鑒定。
權(quán)利要求
一組鑒別奧利亞羅非魚(yú)遺傳性別的引物，其特征在于該組引物的序列是由SEQID NO1所示序列設(shè)計(jì)合成的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其序列長(zhǎng)度為18 28nt。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物，其序列是由SEQID N0:1所示序列中連續(xù)300bp 以上的序列設(shè)計(jì)合成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3所述的引物，其中一對(duì)引物序列為SEQID NO 2和SEQ IDNO 3所示的序列。
5. 一段鑒定奧利亞羅非魚(yú)遺傳性別的DNA片段，其特征在于該片段的序列包括SEQ ID NO 1所示序列。
6. 一種鑒定奧利亞羅非魚(yú)遺傳性別的方法，其特征在于該方法是根據(jù)樣品的PCR反應(yīng) 產(chǎn)物的電泳結(jié)果鑒定樣品性別。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于該方法中PCR引物由SEQID NO 1所示序 列中連續(xù)300bp以上的序列設(shè)計(jì)合成的。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于該方法中PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果中出現(xiàn)一 段300 1500bp大小條帶的樣品為雌性，而相同部位沒(méi)有出現(xiàn)條帶的樣品為雄性。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一段鑒別奧利亞羅非魚(yú)遺傳性別的片段和一組引物及鑒別方法。使用該組引物進(jìn)行PCR反應(yīng)可以從奧利亞羅非魚(yú)雌性個(gè)體中獲得長(zhǎng)度為1488bp的擴(kuò)增片段，而在雄性個(gè)體中無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物，說(shuō)明該引物為雌性特異，從而表明該引物和方法可以用于奧利亞羅非魚(yú)遺傳性別的鑒定。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101921865SQ20101026970
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月2日
發(fā)明者劉羽清, 孟慶磊, 安麗, 張志山, 張龍崗, 李嫻, 楊玲, 王成武, 董學(xué)颯 申請(qǐng)人:山東省淡水水產(chǎn)研究所