專利名稱：一種水稻數(shù)量性狀基因座(qtl)定位的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水稻數(shù)量性狀基因座(QTL)定位的方法，特別是涉及一種利用水 稻永久群體開展QTL定位時數(shù)量性狀表型數(shù)據(jù)分析的方法。
背景技術(shù)：
水稻是世界上最重要的第一大糧食作物，也是我國最重要的糧食作物之一。水稻 絕大部分農(nóng)藝性狀諸如產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等均受多基因系統(tǒng)的數(shù)量性狀基因座(QTL)控制。 當(dāng)前，水稻QTL定位、分離、圖位克隆策略是解析多基因控制數(shù)量性狀為單個孟德爾遺傳因 子最為有效的方法，也是水稻數(shù)量性狀基因挖掘與功能研究的重要途徑。眾所周知，構(gòu)建水稻分子遺傳圖譜、發(fā)展統(tǒng)計模型以及準(zhǔn)確測定數(shù)量性狀表型值 是開展數(shù)量性狀基因座(QTL)定位研究必不可少的三個重要環(huán)節(jié)。近年來，已有水稻分子 數(shù)量性狀遺傳研究的報道更多關(guān)注分子遺傳圖譜的構(gòu)建與統(tǒng)計模型的發(fā)展。至今，很少有 關(guān)于利用水稻重組自交系群體(RIL)或加倍單倍體(DH)等永久群體開展QTL定位時株系 內(nèi)抽取樣本容量大小影響主效QTL定位的相關(guān)報道。一般情況，利用水稻F2或BC1F2分離 群體進(jìn)行QTL定位時每類性狀僅測定一個單株性狀值。但這類分離群體不能同時用于多環(huán) 境下試驗(yàn)研究而不常用于開展QTL定位研究。目前，大部分水稻QTL定位研究項(xiàng)目選用RIL 或DH永久群體。通常情況，選用水稻永久群體開展QTL定位時，每類性狀株系內(nèi)調(diào)查5或 10株求平均值作為該株系性狀表型值來進(jìn)行QTL定位。然而，每類性狀株系內(nèi)測定過多單 株必將倍加了性狀值測定的工作量。眾所周知，測定性狀值效率的高低直接影響著QTL定 位研究進(jìn)程，特別是一些難以進(jìn)行性狀表型值測定的數(shù)量性狀，例如根表面積、根直徑、根 尖數(shù)目，以及一些重要的生理或生化指標(biāo)性狀值。倘若株系內(nèi)單個性狀測定過多單株，那么 性狀測定的最佳時期將被錯過，這將嚴(yán)重影響了 QTL研究進(jìn)展，甚至很難獲得一套完整用 于QTL定位的表型性狀數(shù)據(jù)。因此，我們急需弄清楚利用水稻永久群體開展QTL定位時每 類性狀株系內(nèi)最佳抽取樣本容量，該樣本容量可以準(zhǔn)確、可靠、高效的用于QTL定位研究。利用水稻永久群體開展QTL定位研究由來已久，該類群體能同時滿足不同研究目 標(biāo)和研究環(huán)境的需要，目前早已被國內(nèi)外水稻遺傳學(xué)家和育種學(xué)家廣泛使用。在利用水稻 永久群體開展QTL定位研究，準(zhǔn)確測定性狀值將是開展高效QTL定位研究的重要環(huán)節(jié)之一。 但目前，尚未有關(guān)于株系內(nèi)抽取樣本容量大小影響穩(wěn)定表達(dá)主效QTL定位研究的相關(guān)信息 報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決當(dāng)今人們利用水稻永久群體進(jìn)行數(shù)量性狀基因座(QTL)定位時容 易導(dǎo)致株系內(nèi)測定過多單株而錯過最佳性狀考察期，難以獲得一套完整用于QTL定位的性 狀表型數(shù)據(jù)進(jìn)而嚴(yán)重影響QTL定位研究進(jìn)程的問題。為此本發(fā)明提供一種水稻數(shù)量性狀基 因座(QTL)定位的方法，通過本發(fā)明的方法實(shí)施以及取得的研究結(jié)果，能很好地指導(dǎo)人們 準(zhǔn)確、高效、可靠地檢測在不同環(huán)境下穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL。
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水稻永久群體株高性狀每株系內(nèi)完全隨機(jī)調(diào)查5個單株，命名為pha、phb、phc、 phd、phe.共獲得26套一系列株系內(nèi)5個單株完全隨機(jī)組合2株、3株、4株和5株性狀平 均表型值，株系內(nèi)完全隨機(jī)組合2或3株分別獲得10套性狀表型數(shù)據(jù)。命名為phab、phac、 phad、phae、phbc、phbd、phbe、phcd、phce、phde ；phacd、phabe、phabd、phabc、phbcd、phbde、 phade. phcde、phace. phbce ；株系內(nèi)完全隨機(jī)組合4株以及5株所求平均性狀表型值分別 為 phabde、phacde、phabcd、phabce、phbcde 禾口 phabcde。利用分子遺傳圖譜、復(fù)合區(qū)間作圖法(CIM)、株系內(nèi)5個單株以及26套完全隨機(jī)組 合性狀表型均值對控制株高性狀進(jìn)行QTL定位，選用多區(qū)間作圖法(MIM)對CIM作圖法所 檢測到的主效QTL進(jìn)行存在與否的驗(yàn)證。所述主效QTL能在不同環(huán)境條件下同時被株系內(nèi)5個單株和26套完全隨機(jī)組合 的性狀表型值分別檢測到。所述主效QTL定位不受株系內(nèi)抽取樣本容量大小的影響。我們在利用水稻永久群 體開展QTL定位時株系內(nèi)抽取樣本容量大小不影響穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL的檢測結(jié)果。每類 性狀株系內(nèi)測定一個單株和同時測定多個單株性狀值求均值來分別進(jìn)行主效QTL定位，其 定位結(jié)果沒顯著差異。上述單一步驟其他內(nèi)容為公知技術(shù)，在此不再贅述。本發(fā)明的有益效果是，利用水稻數(shù)量性狀基因座(QTL)定位的方法，特別是數(shù)量 性狀表型數(shù)據(jù)分析的方法，很好的探索在利用水稻永久群體開展QTL定位時每類性狀株系 內(nèi)抽取樣本容量大小對主效QTL定位結(jié)果的影響。研究結(jié)果表明株系內(nèi)樣本容量的大小 對主效QTL定位結(jié)果沒有任何影響，這將為遺傳學(xué)家和育種學(xué)家在利用水稻永久群體開展 QTL定位時的田間表型實(shí)驗(yàn)設(shè)計提供指導(dǎo)，有助于利用永久群體開展準(zhǔn)確、高效、可靠的水 稻QTL定位研究。


圖1表示位于水稻第3染色體上的主效QTL同時被水稻重組自交系群體株系內(nèi)5 個單株和26套完全隨機(jī)組合性狀表型數(shù)據(jù)在2006年和2009年兩個不同環(huán)境條件下檢測 到；圖2表示位于水稻第7染色體上的主效QTL同時被重組自交系群體株系內(nèi)5個單 株和26套完全隨機(jī)組合性狀表型數(shù)據(jù)在2006年一個環(huán)境條件下檢測到；具體實(shí)施方式
在說明實(shí)施方式前，先對其中的術(shù)語作如下解釋分子遺傳連鎖圖譜染色體的交換與重組是遺傳圖譜構(gòu)建的理論基礎(chǔ)，利用分子 標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜的基本原理是根據(jù)標(biāo)記在分離群體中的共分離情況來確定它們的連鎖 關(guān)系而建立連鎖群。具體步驟包括選擇親本和分子標(biāo)記、構(gòu)建遺傳群體、構(gòu)建連鎖群。遺 傳連鎖圖譜以遺傳距離表示標(biāo)記與標(biāo)記之間的相對位置(不是實(shí)際的物理距離)，它是建 立在統(tǒng)計分析的基礎(chǔ)上，通過計算在分離群體中兩個標(biāo)記的交換值，將交換值轉(zhuǎn)化為遺傳 距離(厘摩cM)。微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記由一類由幾個核苷酸(1-5個)為重復(fù)單位組成的長達(dá)幾十 個核苷酸的重復(fù)序列，長度較短，廣泛分布在染色體上。由于重復(fù)單位次數(shù)的不同或重復(fù)程 度的不完全相同，造成了 SSR長度的高度變異性，由此而產(chǎn)生SSR標(biāo)記或SSLP標(biāo)記。雖然SSR在基因組上的位置不盡相同，但是其兩端序列多是保守的單拷貝序列。因此，可以用微 衛(wèi)星區(qū)域特定順序設(shè)計成對引物，通過PCR技術(shù)，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，即可顯示SSR位 點(diǎn)在不同個體間的多態(tài)性。優(yōu)點(diǎn)1)標(biāo)記數(shù)量豐富，具有較多的等位變異，廣泛分布于各條 染色體上；2)共顯性標(biāo)記，呈孟德爾遺傳分離規(guī)律；3)技術(shù)重復(fù)性好，易于操作，結(jié)果可靠； 4)標(biāo)記結(jié)果可直接用于水稻分子標(biāo)記輔助選擇育種。復(fù)合區(qū)間作圖法(CIM) :CIM法又叫多標(biāo)記QTL定位法，是一種基于全基因組所有 標(biāo)記進(jìn)行QTL定位及效應(yīng)分析的作圖方法。CIM法以IM法為基礎(chǔ)，仍采用QTL似然圖來顯 示QTL的可能位置及顯著程度，在假定不存在上位性效應(yīng)的條件下，把特定標(biāo)記區(qū)間外的 其他標(biāo)記擬合到模型中，充分利用了整個基因組的標(biāo)記信息，在較大程度上控制了背景的 遺傳效應(yīng)；用類似于單區(qū)間作圖的方法，計算各參數(shù)的LOD值及顯著性，繪制各染色體的似 然圖譜，標(biāo)出各QTL的可能位置，可以較好地處理多QTL連鎖的情形，改善了作圖的精度和 效率。數(shù)量性狀基因座(QTL)指控制數(shù)量性狀表現(xiàn)的數(shù)量基因在連鎖群中的位置。數(shù) 量性狀的變異呈連續(xù)性，雜交后的分離世代不能明確分組。數(shù)量性狀一般容易受環(huán)境條件 的影響而發(fā)生變異，而這種變異一般是不能遺傳的?？刂茢?shù)量性狀的基因在特定時空條件 下表達(dá)，不同環(huán)境條件下基因表達(dá)的程度可能不同，因此數(shù)量性狀普遍存在著基因型與環(huán) 境互作。本發(fā)明的方法具體實(shí)施過程1、材料與方法(1)供試材料2002年選用中國第一個商業(yè)超級雜交稻組合“協(xié)優(yōu)9308”雙親配制“協(xié)青早B (株 高94. 6cM) X中恢9308 (株高119. 3cM) ”雜交組合并獲得F1經(jīng)單粒傳法構(gòu)建含有226個株 系重組自交系群體。株高性狀在雙親呈顯著表型遺傳差異且在重組自交系群體中表現(xiàn)連續(xù) 分布，同時該性狀比較容易準(zhǔn)確測定。所選定位群體和定位數(shù)量性狀均較適應(yīng)于本方法的 實(shí)施。同時“協(xié)優(yōu)9308”為中國水稻研究所選育的超級雜交水稻，株型緊湊，分蘗中等偏弱， 莖桿粗壯，耐肥抗倒，劍葉挺，后期青桿黃熟，轉(zhuǎn)色好，首批被國家農(nóng)業(yè)部認(rèn)定的超級雜交稻 品種之一。(2)分子遺傳圖譜本方法實(shí)施所用分子遺傳圖譜以“協(xié)青早BX中恢9308”重組自交系群體281 個株系構(gòu)建分子遺傳圖譜為定位圖譜。該圖譜包含199個SSR標(biāo)記，標(biāo)記序列公布于 (http://www. gramene. org/)，SSR標(biāo)記均勻分布于水稻12條染色體，圖譜覆蓋水稻基因組 全長1765. 6cM，相鄰標(biāo)記間平均圖距為8. 87cM，該圖譜適合QTL定位研究，繪圖所用軟件為 MapMaker/EXP3. OVersion0(3) QTL作圖軟件及方法本方法實(shí)施所采用軟件為WinQTLCart 2. 5版軟件。應(yīng)用復(fù)合區(qū)間作圖法(CIM) 和多區(qū)間作圖(MIM)進(jìn)行主效QTL定位并對其存在與否進(jìn)行驗(yàn)證，估算主效QTL的遺傳參數(shù)。在2006年、2009年夏季分年將含有226個株系的“協(xié)青早BX中恢9308”重組自 交系群體及雙親種植于浙江富陽中國水稻研究所試驗(yàn)基地，選擇肥力均勻田塊，按照株行
5間距20cMX 23cM的規(guī)格實(shí)驗(yàn)材料，每株系種植4行，每行6株。用于本方法實(shí)施研究的數(shù) 量性狀為水稻株高。重組自交系群體性狀株高株系內(nèi)完全隨機(jī)測定5個單株；命名為pha、phb、phc、 phd、phe.共獲得26套一系列株系內(nèi)5個單株完全隨機(jī)組合2株、3株、4株和5株性狀平 均表型數(shù)據(jù)，株系內(nèi)完全隨機(jī)組合2或3株分別能獲得10套性狀表型數(shù)據(jù)，命名為phab、 phac> phad> phae、phbc、phbd、phbe、phcd、phce、phde ；phacd> phabe> phabd> phabc、phbcd、 phbde,phade,phcde,phace,phbce ；株系內(nèi)完全隨機(jī)組合4株和5株，獲得6套性狀表型數(shù) 據(jù)，為 phabde、phacde、phabcd、phabce、phbcde 和 phabcde。利用構(gòu)建 RIL 分子遺傳圖譜、復(fù) 合區(qū)間作圖法(CIM)、株系內(nèi)5個單株和26套完全隨機(jī)組合性狀表型數(shù)據(jù)對株高性狀分別 進(jìn)行QTL定位，選用多區(qū)間作圖法(MIM)對CM所檢測到的主效QTL的存在與否進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第3、第7染色體上分別被株系內(nèi)5個單株和26套完全隨機(jī)組合性狀表型數(shù) 據(jù)同時檢測到2個控制株高的主效QTL(圖1、圖2)。位于第3染色體上Qph3 (RM148-RM85) 能同時被31套株高表型數(shù)據(jù)在2006年、2009年兩個不同環(huán)境條件下檢測到。位于第7染 色體控制株高Qph7a(RM3670-RM2)能同時被31套株高表型數(shù)據(jù)在2006年一個環(huán)境下檢測 到。同時發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL定位結(jié)果不受株系內(nèi)抽取樣容量大小的影響。因此，本 方法很好的詮釋了利用水稻永久群體開展QTL定位時株系內(nèi)抽取樣本容量大小影響QTL定 位結(jié)果的問題。本發(fā)明采用QTL作圖技術(shù)，利用水稻永久群體開展數(shù)量性狀基因定位，創(chuàng)建了一 種數(shù)量性狀基因座QTL定位研究時田間性狀表型數(shù)據(jù)分析的新方法，豐富了 QTL定位研究 所表型性狀表型數(shù)據(jù)，提高了 QTL定位研究的準(zhǔn)確性、可靠性，必將加快QTL定位研究進(jìn)程。最后，還需要特別注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然，本發(fā) 明不僅僅限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變通的情況。本領(lǐng)域的技術(shù)人員從本發(fā)明公開 的內(nèi)容直接推導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變通情況，均認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種水稻數(shù)量性狀基因座(QTL)定位的方法，其特征在于選用雙親農(nóng)藝性狀存在顯著差異的水稻重組自交系(RILs)永久群體作為QTL定位群體；選用分子微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記構(gòu)建分子遺傳連鎖圖譜；調(diào)查水稻永久群體株高性狀株系內(nèi)完全隨機(jī)的5個單株，該單株性狀表型值分別命名為pha、phb、phc、phd、phe，總共獲得26套株系內(nèi)5個單株完全隨機(jī)組合2株、3株、4株以及5株性狀表型數(shù)據(jù)，其中株系內(nèi)完全隨機(jī)組合2株求平均值獲得10套性狀表型數(shù)據(jù)，命名為phab、phac、phad、phae、phbc、phbd、phbe、phcd、phce、phde；完全隨機(jī)組合3株也獲得10套表型數(shù)據(jù)，命名為phacd、phabe、phabd、phabc、phbcd、phbde、phade、phcde、phace、phbce；完全隨機(jī)組合4株以及5株共獲得6套表型數(shù)據(jù)，命名為phabde、phacde、phabcd、phabce、phbcde和phabcde；利用所述分子遺傳連鎖圖譜，用WinQTLCart 2.5版軟件的復(fù)合區(qū)間作圖法(CIM)，以及株系內(nèi)5個單株和26套完全隨機(jī)組合株高性狀表型數(shù)據(jù)，對控制株高性狀基因進(jìn)行QTL作圖，用多區(qū)間作圖法(MIM)對CIM作圖法所檢測的主效QTL的存在與否進(jìn)行驗(yàn)證。
2.如權(quán)利要求1所述的一種水稻數(shù)量性狀基因座(QTL)定位的方法，其特征在于所 述主效QTL能在不同環(huán)境條件下同時被株系內(nèi)5個單株和26套完全隨機(jī)組合的性狀表型 數(shù)據(jù)分別同時檢測到。
全文摘要
能指導(dǎo)人們準(zhǔn)確、高效、可靠地檢測主效QTL的一種水稻數(shù)量性狀基因座定位的方法選用雙親農(nóng)藝性狀存在顯著差異的水稻重組自交系(RILs)永久群體作為QTL定位群體；選用分子微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記構(gòu)建分子遺傳連鎖圖譜；調(diào)查水稻永久群體株高性狀株系內(nèi)完全隨機(jī)的5個單株的性狀表型值以及26套由5個單株完全隨機(jī)組合2株、3株、4、5株的性狀表型數(shù)據(jù)；利用所述分子遺傳連鎖圖譜，用WinQTLCart 2.5版軟件的復(fù)合區(qū)間作圖法(CIM)，以及株系內(nèi)5個單株和26套完全隨機(jī)組合株高性狀表型數(shù)據(jù)，對控制株高性狀基因進(jìn)行QTL作圖，用多區(qū)間作圖法(MIM)對CIM作圖法所檢測的主效QTL的存在與否進(jìn)行驗(yàn)證。本發(fā)明可用于水稻數(shù)量性狀基因座定位。
文檔編號C12Q1/68GK101974620SQ201010269959
公開日2011年2月16日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者曹立勇, 梁永書, 程式華, 高志強(qiáng) 申請人:中國水稻研究所