專利名稱：一種提高綿羊成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后發(fā)育能力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物胚胎生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及提高綿羊卵母細(xì)胞的發(fā)育的方 法，本申請(qǐng)稱之為 Electric-Chemical-Electric, ECE 法。
背景技術(shù)：
卵母細(xì)胞冷凍保存不僅對(duì)于瀕臨物種的保存具有重要意義，而且可以為基礎(chǔ)研究 提供了大量可利用的材料。近年來(lái)，玻璃化冷凍法保存卵母細(xì)胞獲得了優(yōu)于傳統(tǒng)慢速冷凍 法的效果。許多報(bào)道利用玻璃化冷凍法保存了不同動(dòng)物的卵母細(xì)胞，而且在一些報(bào)道中也 獲得健康的后代。但是，目前綿羊卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的成功率仍然較低，相對(duì)于新鮮的卵 母細(xì)胞，玻璃化冷凍后的卵母細(xì)胞發(fā)育能力很低。有報(bào)道表明，玻璃化冷凍過(guò)程會(huì)對(duì)動(dòng)物卵 母細(xì)胞造成多種損傷，例如細(xì)胞骨架的破壞、皮質(zhì)顆粒的提前釋放以及透明帶超微結(jié)構(gòu)的 變化。這些變化嚴(yán)重阻礙了正常的受精過(guò)程，使精子不能進(jìn)入卵母細(xì)胞而受精，采用顯微注 射可以提高精子進(jìn)入卵母細(xì)胞的比率，但是玻璃化冷凍后的卵母細(xì)胞發(fā)育能力很低，需要 額外的刺激才能啟動(dòng)其正常發(fā)育，目前用于卵母細(xì)胞的激活多用化學(xué)激活方法，但是化學(xué) 激活后，很容易照成孤雌激活胚胎，不能形成正常的二倍體胚胎。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述領(lǐng)域的缺陷，本發(fā)明提供一種提高了玻璃化冷凍后綿羊卵母細(xì)胞的發(fā)育 能力的方法，其孤雌激活胚胎比率減少，而正常的二倍體胚胎比率大大提高，同時(shí)與常規(guī)的 體外受精方法相比，其卵裂率和囊胚率分別提高到13. 7%和6. 8%。一種提高綿羊成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后發(fā)育能力的方法，包括綿羊成熟卵母細(xì) 胞的顯微注射受精和受精卵的激活步驟，其特征在于所述受精卵的激活包括如下步驟 1.將顯微注射后的綿羊成熟卵母細(xì)胞在直流脈沖(2. 4kv/cm, IOus)下刺激1次；2.放入添 加了 5mMionomycin的SOF培養(yǎng)液中5分鐘；3.在SOF培養(yǎng)液中3小時(shí)；4.移入添加了 1. 9 mM6-dimethylaminopurine (6-DMAP)的 SOF 培養(yǎng)液中 1. 5 小時(shí)；5.用直流脈沖(2. 4kv/cm, IOus)再刺激1次。所述SOF 培養(yǎng)液成分如下107· 63nM NaCl+7.16mM KC1+1.19mM KE,P04+1. 51mMMgS04+l. 78mM CaCl2. 2H,(K25. OOmM NaH003+5. 35nM 乳酸鈉 +7. 27nM 丙酮酸鈉 +0. 20mM 谷氨酰胺 +20. O μ L/nL 必需氨 基酸混合液+10. O μ L/nL非必需氨基酸混合液+0. 34πΜ檸檬酸鈉+2. 77πΜ肌醇+100IU/nL青霉素 +100IU/nL 鏈霉素 +0. 2mg/nL 酚紅。所述綿羊成熟卵母細(xì)胞的顯微注射受精是利用顯微操作儀將單個(gè)綿羊精子直接 注射到玻璃化冷凍后的綿羊成熟卵母細(xì)胞。所述綿羊成熟卵母細(xì)胞的顯微注射受精包括如下步驟(1)用0. 2%透明質(zhì)酸酶 將存活的綿羊成熟卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞去除，(2)再將卵母細(xì)胞移入顯微操作液滴中，顯微 操作液滴是添加了 25mM Hepes和10%血清的SOF培養(yǎng)液，(3)在顯微鏡下將單個(gè)精子注射 到綿羊成熟卵母細(xì)胞中。
本發(fā)明受精卵的激活采用直流脈沖_化學(xué)激活_直流脈沖的方式進(jìn)行激活，正常 的二倍體胚胎有明顯的提高，孤雌激活胚胎減少。同時(shí)經(jīng)過(guò)本方法處理后，提高了玻璃化冷 凍后的綿羊卵母細(xì)胞單精子注射后的發(fā)育能力，與常規(guī)的體外受精方法相比，卵裂率和囊 胚率分別提高了 13. 7%和6.8%。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。1.主要儀器設(shè)備顯微操作儀、CO2培養(yǎng)箱、恒溫臺(tái)、視體顯微鏡、恒溫箱、超凈臺(tái)。2.玻璃化冷凍后的綿羊卵母細(xì)胞準(zhǔn)備在顯微鏡下挑選存活的綿羊成熟卵母細(xì)胞，用0.2%透明質(zhì)酸酶脫去顆粒細(xì)胞， 在體視顯微鏡下選擇存在第一極體的、胞質(zhì)均勻一致的卵母細(xì)胞，置于含有10%血清的 HC03-199液中待用。3.顯微注射成熟卵母細(xì)胞的顯微注射是在顯微操作儀上進(jìn)行。將10枚脫去顆粒細(xì)胞的成熟 卵母細(xì)胞放入操作液滴的一端，操作液滴由添加25mMfepeS和10%血清的SOF培養(yǎng)液組成， 用持卵針吸住一枚卵母細(xì)胞，調(diào)整極體的位置，使其第一極體位于時(shí)鐘12點(diǎn)的位置。用注 射針在精子操作滴中吸入1個(gè)精子，將注射針移入卵母細(xì)胞操作滴中，并將精子推到注射 針尖端，注射針從3點(diǎn)位置穿入卵母細(xì)胞深部，回吸少量卵母細(xì)胞質(zhì)，再將精子注入卵母細(xì) 胞，將注射針輕輕從卵母細(xì)胞中撤出，注射后，將卵母細(xì)胞移入液滴的一邊直到顯微注射完 畢，將注射后的卵母細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中保存lh。4.受精卵激活當(dāng)所有卵母細(xì)胞注射完畢后進(jìn)行激活處理。激活處理方法為1.將顯微注射 后的綿羊成熟卵母細(xì)胞在直流脈沖(2. 4kv/cm，IOus)下刺激一次；2.放入添加了 5mM ionomycin的SOF培養(yǎng)液中5分鐘；3.在SOF培養(yǎng)液中3小時(shí)；4.移入添加了 1. 9mM 6-dimethylaminopurine (6-DMAP)的 SOF 培養(yǎng)液中 1.5 小時(shí)；5.用直流脈沖(2. 4kv/cm, IOus)再刺激1次。5.胚胎發(fā)育激活后，胚胎進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)方法為將受精卵在添加了 10%血清的SOF培養(yǎng)液中 培養(yǎng)7天。每2天半換液。觀察胚胎發(fā)育情況，統(tǒng)計(jì)卵裂率和囊胚率。從2008年1月至2009年10月，經(jīng)ECE法處理后，玻璃化冷凍后的綿羊卵母細(xì)胞 單精子注射后的胚胎發(fā)育能力大大提高，與常規(guī)的體外受精方法相比，卵裂率和囊胚率分 別提高到13.7%和6.8%。同時(shí)，比較了不同處理后的胚胎的染色體倍性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用 ECE法處理后，正常倍性胚胎的比例(71.5%)明顯高于普通的化學(xué)激活方法(45.4%)，且 與體外受精組沒(méi)有明顯差異，這說(shuō)明，本方法有利于玻璃化冷凍后的綿羊卵母細(xì)胞單精子 注射后胚胎的正常發(fā)育，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表一玻璃化冷凍后的綿羊成熟卵母細(xì)胞在不同受精方法下的發(fā)育情況
權(quán)利要求
一種提高綿羊成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后發(fā)育能力的方法，包括綿羊成熟卵母細(xì)胞的顯微注射受精和受精卵的激活步驟，其特征在于所述受精卵的激活包括如下步驟1.將顯微注射后的綿羊成熟卵母細(xì)胞在2.4kv/cm，10us的直流脈沖下刺激1次；2.放入添加了5mMionomycin的SOF培養(yǎng)液中5分鐘；3.在SOF培養(yǎng)液中3小時(shí)；4.移入添加了1.9mM6 dimethylaminopurine 的SOF培養(yǎng)液中1.5小時(shí)；5.用2.4kv/cm，10us的直流脈沖再刺激1次。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述S0F培養(yǎng)液成分如下107.63mM NaCl+7. 16mM KC1+1. 19mM KH2P04+1. 51mM MgS04+l. 78mM CaCl2. 2H20+25. OOmM NaHC03+5. 35mM 乳酸鈉 +7. 27mM丙酮酸鈉+0. 20mM谷氨酰胺+20. 0 u L/mL必需氨基酸混合液+10. 0 u L/mL非必需 氨基酸混合液+0. 34mM檸檬酸鈉+2. 77mM肌醇+100IU/mL青霉素+ 100IU/mL鏈霉素+0. 2mg/ mL酚紅。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述綿羊成熟卵母細(xì)胞的顯微注射受精是利用顯微操 作儀將單個(gè)綿羊精子直接注射到玻璃化冷凍后的綿羊成熟卵母細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述綿羊成熟卵母細(xì)胞的顯微注射受精包括如下步 驟(1)用0.2%透明質(zhì)酸酶將存活的綿羊成熟卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞去除，(2)再將卵母細(xì) 胞移入顯微操作液滴中，顯微操作液滴是添加了 25mM Hepes和10%血清的S0F培養(yǎng)液，(3) 在顯微鏡下將單個(gè)精子注射到綿羊成熟卵母細(xì)胞中。
全文摘要
本發(fā)明涉及“一種提高綿羊成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后發(fā)育能力的方法”，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，包括綿羊成熟卵母細(xì)胞的顯微注射受精和受精卵的激活步驟，本發(fā)明受精卵的激活采用直流脈沖-化學(xué)激活-直流脈沖的方式，實(shí)驗(yàn)證明玻璃化冷凍后的綿羊卵母細(xì)胞單精子注射后采用本發(fā)明的激活方法，其胚胎發(fā)育能力大大提高，與常規(guī)的體外受精方法相比，卵裂率和囊胚率分別提高到13.7％和6.8％。同時(shí)，比較了不同處理后的胚胎的染色體倍性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用ECE法處理后，正常倍性胚胎的比例(71.5％)明顯高于普通的化學(xué)激活方法(45.4％)，且與體外受精組沒(méi)有明顯差異。
文檔編號(hào)C12N5/075GK101948799SQ20101027043
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月1日
發(fā)明者張家新 申請(qǐng)人:張家新