專利名稱：一種控制生鮮乳中細菌總數(shù)的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，特別涉及一種控制生鮮乳中細菌總數(shù)的方法。
背景技術：
“生鮮牛乳”即為未經(jīng)任何加工的牛乳。在生鮮乳中微生物的含量是評價生鮮乳質(zhì) 量的一個重要指標，對于所有乳制品來說，微生物含量對最終產(chǎn)品質(zhì)量也是十分重要的。細 菌總數(shù)高，其中的致病菌就容易產(chǎn)生非常耐熱的毒素，這些毒素經(jīng)過超高溫處理后仍有少 量殘留，消費者飲用后會導致中毒；而且大量的細菌繁殖會加速產(chǎn)酸，從而引起牛乳酸度增 加，蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性下降。在國標“GB/T 6914-1986”中規(guī)定了 I級、II級、III級、IV級生鮮 乳細菌總量應分別< 50萬個/mL、< 100萬個/mL、< 200萬個/mL、< 400萬個/mL。目前乳制品企業(yè)對原料奶收購時普遍采取直接冷藏方式，在加工前也只采取過濾 法和離心凈乳法，不能從本質(zhì)上減少其菌落總數(shù)。雖然多數(shù)奶業(yè)生產(chǎn)單位通過規(guī)范的牧場 管理體系等而獲得質(zhì)量較好的生鮮乳，但也有生產(chǎn)單位，如個體農(nóng)戶等，因奶牛飼養(yǎng)環(huán)境條 件差，以及部分奶站在原料奶降溫和冷藏貯運方面，缺乏很好的配套措施等，從而使得原料 奶的微生物菌落總數(shù)達到較高的水平。因此，研究一種簡便易行且不會破壞牛乳品質(zhì)的細 菌控制方法和/或技術十分必要。蛭弧菌為寄生性革蘭氏陰性菌，具有寄生、進而裂解其它細菌的作用，是一種優(yōu)良 的微生物控制劑。目前，對于生鮮乳中細菌總數(shù)的控制只有零星報道，且多集中在高壓，輻 照等物理加工處理方式；在利用生物技術控制方面，特別是蛭弧菌控制牛乳中細菌總數(shù)方 面在國內(nèi)外均尚無報道。已有的研究表明，作為一種有益微生物制劑，無論是在食品工業(yè)還是在(海洋) 水產(chǎn)養(yǎng)殖等領域，蛭弧菌的應用均是安全的。例如在國外，Lenz and Hespell (1978) 研究發(fā)現(xiàn)，蛭弧菌及對動物及人的細胞不具侵染性[Lenz R. W.，HespellR. B. Attempts to grow bedellovibrios micurgically-injected into animal cells. Archives of Microbiology, 1978,119(3) =245-248] 在國內(nèi)，林茂等(2006)研究了蛭弧菌對魚類細 胞的作用，發(fā)現(xiàn)它對魚類細菌沒有侵染作用[林茂，楊先樂，薛暉，曹海鵬，邱軍強。蛭弧菌 BDH21 02對魚類細胞及病原菌的作用。微生物學通報，2006，33(1) :7_11]。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術存在的不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種高效、無毒無副 作用的控制生鮮牛乳中細菌總數(shù)的方法，解決了目前物理、化學殺菌方法造成的殘留和牛 乳口味改變的問題。本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)一種控制生鮮乳中細菌總數(shù)的方法，采用蛭弧菌控制細菌總數(shù)，所述蛭弧菌菌株 為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其簡稱為CCTCC， 保藏編號為CCTCC NO =M 209172，保藏地址湖北省武漢市珞珈山武漢大學內(nèi)，保藏日期
3為2009年8月7日；具體步驟如下(1)將蛭弧菌CCTCC 209172制備成蛭弧菌游泳體菌液；(2)在生鮮乳中加入步驟(1)中制得的蛭弧菌游泳體菌液，其中的蛭弧菌游泳體 的濃度至少達到102pfu/ml，靜置或攪拌1-8小時后細菌總數(shù)會得到有效控制和減少。 優(yōu)選地，所述蛭弧菌游泳體的濃度為IO4 108pfu/ml。所述生鮮乳經(jīng)過步驟(2)處理后，還經(jīng)過低溫巴氏殺菌或4°C低溫保藏可達到更 好的殺菌效果。優(yōu)選地，步驟⑵中溫度控制在4°C 30°C。優(yōu)選地，所述蛭弧菌游泳體菌液的制備方法如下(1)制備乳鏈球菌乳鏈球菌用MRS培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)，160rpm 250rpm、25 32°C 培養(yǎng)12 36h，培養(yǎng)物經(jīng)過5000rpm、4°C離心15 20min，棄上清液，沉淀即為乳鏈球菌；(2)混合培養(yǎng)將蛭弧菌CCTCC 209172與上述制備得到的乳鏈球菌加入到DNB培 養(yǎng)基中，恒溫搖床160rpm 250rpm、25 32°C培養(yǎng)12 36h ；(3)制備菌液混合培養(yǎng)物經(jīng)過6000rpm、4°C離心20min，取上清液，再將上清液 16000rpm、4°C條件下離心20min，棄上清液，向沉淀中加入DNB液體培養(yǎng)基重新懸浮蛭弧菌 沉淀物，制得蛭弧菌游泳體菌液(濃度IO8 109pfU/mL)。該菌液可以用無菌水、生理鹽水 或0. 2mol/L pH值為7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液稀釋成不同濃度的蛭弧菌游泳體菌液，備用。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術，具有如下的優(yōu)點及效果1.本發(fā)明所述的使用蛭弧菌游泳體菌液控制生鮮乳中細菌總數(shù)的方法效果顯著。 如圖1所示，細菌總數(shù)在8小時無冷藏的狀況下很好的控制甚至減少了細菌總數(shù)，提升了生 鮮乳的等級。2.本發(fā)明所述的控制生鮮乳細菌總數(shù)的方法安全性好，已有研究證明，蛭弧菌對 人無毒，且普通的低溫巴氏殺菌既能將其完全殺滅，不存在諸如輻照或抗生素殺菌等存在 的輻射或藥物殘留問題。3.采用生物殺菌可有效避免物理殺菌方法對食品口味、品質(zhì)等的改變，更有利于 保持牛乳最原始的鮮味、品質(zhì)。4.本方法采用的蛭弧菌游泳體菌液不僅能殺滅生鮮乳中常見的大腸桿菌，沙門氏 菌等，對常因牛得乳腺炎而感染的金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球 菌都有清除的能力。


圖1為實施例蛭弧菌游泳體菌液控制生鮮乳中細菌總數(shù)的效果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步具體詳細描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此，對于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術進行。實施例(1)控制生鮮乳中細菌總數(shù)的蛭弧菌游泳體菌液的制備
使用的蛭弧菌菌株為蛭弧菌(Bdellovibrio sp. )BDFM05，由中國典型培養(yǎng)物保藏 中心保藏，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCC NO =M 209172，保藏日期為2009年8月7曰。對蛭弧菌BDFM05進行負染后于電子顯微鏡下形態(tài)觀察BDFM05呈單細胞，橢圓 形，大小為1. 43X0. 53 μ m,端生鞭毛，鞭毛長度至少2 μ m ；所述蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05以雙層平板法于28°C培養(yǎng)三天可形成直徑2 3mm的透明圓形噬菌斑。蛭弧菌游泳體通過申請?zhí)枴?00710031166. X”的發(fā)明專利公開的高密度蛭弧菌游 泳體的發(fā)酵方法進行發(fā)酵在裝有IOOmL MRS液體培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉8g，酵母 膏粉4g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸三氨2g，乙酸鈉5g，硫酸鎂0. 2g，硫酸錳0. 05g, 18吐溫80，？!1值6.0 6.4)的錐形瓶中接種0. 5mL107cfu/mL乳鏈球菌(購自廣東省微生 物菌種保藏中心，編號GIM 1. 156)，200rpm、28°C搖床培養(yǎng)18小時，培養(yǎng)液于4°C、5000rpm 離心15min，棄上清。將沉淀加入到裝有IOOmL DNB (dilute nutrient broth)液體培養(yǎng) 基(營養(yǎng)肉湯0. 8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵母精提物0. lg，溶于1000ml蒸餾水中，pH值 為7. 2 7. 6)的錐形瓶中，再加入ImL含103pfu/mL的蛭弧菌CCTCC 209172。恒溫搖床 250rpm、28°C培養(yǎng)36h。培養(yǎng)液分別于4°C 6000rpm離心20min，取上清液，再將上清液于 40C 16000rpm離心20min，保留沉淀，加入DNB液體培養(yǎng)基(營養(yǎng)肉湯0. 8g，酪蛋白酸水解 物0. 5g，酵母精提物0. lg，溶于1000ml蒸餾水中，pH值為7. 2 7. 6)重新懸浮蛭弧菌沉 淀物，即制得濃度為108pfu/ml的蛭弧菌游泳體菌液。用無菌水稀釋上述蛭弧菌游泳體菌液，得到不同濃度的菌液，其中
菌液A含有的蛭弧菌濃度為108pfu/mL ；菌液B含有的蛭弧菌濃度為106pfu/mL ；菌液C含有的蛭弧菌濃度為104pfU/mL ；(2)將蛭弧菌菌液應用于控制生鮮乳細菌總數(shù)本實驗取新鮮的12L鮮牛乳(山東，荷斯坦奶牛)，將其分為12份，其中3份為對 照系列，另9份為實驗系列。實驗系列中分別加入步驟(1)制好的菌液A、B、C，在25°C下分 別靜置8小時。每30分鐘用無菌移液管吸取IOmL牛乳樣品，以營養(yǎng)瓊脂(蛋白胨10g，牛 肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂15 20g，蒸餾水IOOOmL)為培養(yǎng)基，采用涂布平板法對細菌進行 計數(shù)(單位為cfu/mL)。所有數(shù)據(jù)均為三個平行樣的平均值。檢測結(jié)果如圖1所示。圖中所有數(shù)據(jù)均為三個平行樣的平均值。實驗結(jié)果表明， 對照系列在8h后細菌總數(shù)增長到9. 2X108cfu/mL,而實驗系列中3小時后細菌總數(shù)均控 制在105Cfu/mL以下，在5小時后A組甚至降至7. IX 102Cfu/mL次方，B組C組也分別降至 7. 8X103cfu/mL 和 9. 8 X 104cfu/mL。8 小時結(jié)束實驗時 A 組細菌總數(shù)為 3. 2 X 102cfu/mL, B 組為3. 4X 103cfu/mL，C組2. 76 X 104cfu/mL。可見蛭弧菌游泳體菌液控制生鮮乳中細菌總 數(shù)效果顯著，且高濃度蛭弧菌游泳體菌液效果要優(yōu)于低濃度。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權利要求
1. 一種控制生鮮乳中細菌總數(shù)的方法，其特征在于，采用蛭弧菌控制細菌總數(shù)，所述蛭 弧菌菌株為蛭弧菌(Bdellovibrio sp. )BDFM05，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其簡稱 為CCTCC，保藏編號為CCTCC NO =M 209172，保藏日期為2009年8月7日；具體步驟如下(1)將蛭弧菌CCTCC209172制備成蛭弧菌游泳體菌液；(2)在生鮮乳中加入步驟(1)中制得的蛭弧菌游泳體菌液，其中的蛭弧菌游泳體的濃 度至少達到102pfu/ml，靜置或攪拌1-8小時。
2.根據(jù)權利要求1所述的控制生鮮乳中細菌總數(shù)的方法，其特征在于，所述蛭弧菌游 泳體的濃度為1O4 108pfu/ml。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的控制生鮮奶中細菌總數(shù)的方法，其特征在于，所述生鮮乳 經(jīng)過步驟(2)處理后，還經(jīng)過低溫巴氏殺菌或4°C低溫保藏。
4.根據(jù)權利要求1所述的控制生鮮乳中細菌總數(shù)的方法，其特征在于，步驟(2)中溫度 控制在4°C 30°C。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的控制生鮮乳中細菌總數(shù)的方法，其特征在于，所述蛭弧菌 游泳體菌液的制備方法如下(1)制備乳鏈球菌乳鏈球菌用MRS培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)，160rpm 250rpm、25 32°C培 養(yǎng)12 36h，培養(yǎng)物經(jīng)過5000rpm、4°C離心15 20min，棄上清液，沉淀即為乳鏈球菌；(2)混合培養(yǎng)將蛭弧菌CCTCCNO 209172與上述制備得到的乳鏈球菌加入到DNB培 養(yǎng)基中，恒溫搖床160rpm 250rpm、25 32°C培養(yǎng)12 36h ；(3)制備菌液混合培養(yǎng)物經(jīng)過6000rpm、4°c離心20min，取上清液，再將上清液 16000rpm、4°C條件下離心20min，棄上清液，向沉淀中加入DNB液體培養(yǎng)基重新懸浮蛭弧菌 沉淀物，制得蛭弧菌游泳體菌液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種控制生鮮乳中細菌總數(shù)的方法，采用蛭弧菌控制細菌總數(shù)，所述蛭弧菌菌株為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCC NOM 209172，保藏日期為2009年8月7日；具體步驟為(1)將蛭弧菌CCTCC 209172制備成蛭弧菌游泳體菌液；(2)在生鮮乳中加入步驟(1)中制得的蛭弧菌游泳體菌液，其中的蛭弧菌游泳體的濃度至少達到102pfu/ml，靜置或攪拌1-8小時。本發(fā)明可有效控制生鮮乳細菌的增長，有利于保持牛乳原始的鮮味、品質(zhì)，提高生鮮乳在收購中的評級，減少因細菌過快增長造成的原料奶浪費。
文檔編號A23C7/04GK101999456SQ20101027096
公開日2011年4月6日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權日2010年8月31日
發(fā)明者孫麗瀅, 蔡俊鵬 申請人:華南理工大學