專利名稱：一種利用ssr核心引物鑒定棉花品種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用SSR(簡單重復(fù)序列，SimpleSequence Repeat，簡稱SSR)分子標(biāo)記鑒定棉花新品種的方法。
背景技術(shù)：
準(zhǔn)確、快速進(jìn)行農(nóng)作物品種的鑒定，對于農(nóng)作物品種審定、品種保護(hù)、真假品種辨 別、品種的產(chǎn)權(quán)糾紛等方面均有重要作用。作物品種鑒定方法可分為形態(tài)學(xué)鑒定、蛋白質(zhì)指 紋技術(shù)和DNA (脫氧核糖核酸，Deoxyribonucleic acid，簡稱DNA)指紋技術(shù)三個主要鑒定 方法。形態(tài)學(xué)鑒定方法簡便、經(jīng)濟(jì)，但存在周期長、費工費時，調(diào)查性狀受栽培條件及環(huán) 境因素影響，人為觀察誤差較大等缺陷。而且檢測結(jié)果相對滯后，難以及時監(jiān)控市場上的種 子質(zhì)量問題和解決品種侵權(quán)等糾紛。并且隨著農(nóng)作物品種遺傳基礎(chǔ)狹窄，僅僅利用傳統(tǒng)的 形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行農(nóng)作物品種鑒定也愈來愈困難。蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物，品種間的遺傳差異形成蛋白質(zhì)的多態(tài)性，通過電泳技 術(shù)得到多態(tài)性的蛋白質(zhì)指紋圖譜，即蛋白質(zhì)指紋鑒定技術(shù)。由于直接測定的是蛋白質(zhì)，具有 快速、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好的優(yōu)點。1991年，國際種子檢驗協(xié)會把蛋白質(zhì)電泳方法正式定為 標(biāo)準(zhǔn)的品種鑒定方法，從而使蛋白質(zhì)指紋鑒定技術(shù)在品種真實性鑒定和種子純度檢驗上占 有重要地位。根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，可將檢驗方法分為同工酶電泳和種子貯藏蛋白電泳兩大 類，然而，同工酶分析結(jié)果常常因為所選擇的酶多少和種類不同存在偏差。此外，作為基因 表達(dá)的最后產(chǎn)物，同工酶不能完全顯示品種間的多態(tài)性，對于親緣關(guān)系比較密切的自交系 及其雜交種難以鑒定。蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的直接產(chǎn)物，具有組織特異性、可利用數(shù)量少、多 態(tài)性低的特點，因而對親緣關(guān)系較近的品種難以鑒別。DNA指紋技術(shù)是指能夠反映生物個體或種群間基因組中DNA位點差異的一種分 子生物學(xué)技術(shù)。目前，DNA分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到數(shù)十種，主要可分為以下四大類第 一類是以Southern雜交為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，如限制性片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism，簡稱 RFLP)。第二類是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)。它又分為兩類，一類是使用隨機(jī)引物 進(jìn)行擴(kuò)增，主要指隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (Random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD)。 另一類是采用特定引物進(jìn)行擴(kuò)增，主要有序列特異性擴(kuò)增區(qū)(Sequence characterized amplifiedregion,簡稱 SCAR)、序列標(biāo)記位點(sequence-tagged site,簡稱 STS)、SSR。 第三類是基于PCR與酶切相結(jié)合的DNA分子標(biāo)記技術(shù)。它又分為兩類，一類是先酶切，再 用特殊設(shè)計的引物進(jìn)行擴(kuò)增，如擴(kuò)增片段長度多態(tài)性標(biāo)記(Amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP)。另一類是先擴(kuò)增，再酶切擴(kuò)增片段，檢測酶切片段的長度多態(tài) 性，如酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CleavedAmplified Polymorphism Sequences，簡稱 CAPS)。第 四類是基于單核甘酸多態(tài)性的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，如單核甘酸多態(tài)性(Single-nucleotide polymorphism，簡稱SNP)。它們具有直接以DNA的形式表現(xiàn)，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問題；數(shù)量極多，遍布整個基因組；多態(tài)性高，無需人為創(chuàng)造等位變異；表現(xiàn)為中 性，不影響目的性狀的表達(dá)等優(yōu)點。國際植物品種權(quán)保護(hù)組織(The International Union for the Protection of New Varieties of Plants，簡稱 UPOV)在 2005 年在生物化學(xué) 和分子生物學(xué)技術(shù)(Biochemical and MolecularTechniques，簡稱BMT)測試指南草案中 (Guidelines (proj. 3)，3-6)，將構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的標(biāo)記方法確定為SSR和SNP，其中 SSR標(biāo)記技術(shù)比較成熟。SSR是基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記，具有以下5個優(yōu)點(1)以孟德爾方式遺傳，呈共 顯性；(2)數(shù)量豐富，覆蓋整個染色體組；(3)每個位點均有許多等位形式，多態(tài)性豐富，信 息含量高；(3)利用PCR技術(shù)分析，對DNA數(shù)量及質(zhì)量要求不高；(4)實驗程序簡單，結(jié)果重 復(fù)性好；(5)每個位點由引物序列順序決定，便于不同實驗室相互交流合作。目前已經(jīng)利用 SSR標(biāo)記構(gòu)建馬鈴薯、玉米、水稻、小麥的DNA指紋庫(Moisan等，2005 Potato Research, 48(2-3) 191-200 ；王風(fēng)格等，2007，分子植物育種，5 (1) 128-132 ；程本義等，2008，雜交水 稻，18 (5) 319-320 ；李根英等，2006，作物學(xué)報，32 (12) :1771_1778)，在我國以SSR標(biāo)記為 基礎(chǔ)的玉米和水稻的品種鑒定DNA指紋技術(shù)已經(jīng)形成國家標(biāo)準(zhǔn)(NYT 1432-2007《玉米品種 鑒定DNA指紋方法》和NYT 1433-2007《水稻品種鑒定DNA指紋方法》)。但在我國，目前棉 花品種的鑒別仍然是形態(tài)學(xué)結(jié)合蛋白質(zhì)指紋技術(shù)鑒定方法，因此急需利用SSR核心引物構(gòu) 建棉花品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫，它在棉花區(qū)試品系的鑒定、品種保護(hù)、假種辨別、產(chǎn)權(quán)糾紛等 領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以32份國家和山東省已經(jīng)審定的棉花品種作為樣本材料，利用棉花分子 標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(Cotton Marker Database，簡稱CMD)中已經(jīng)公布的2000對SSR引物進(jìn)行多態(tài) 性篩選，以篩選出適合棉花品種鑒定的SSR核心引物，構(gòu)建棉花品種的指紋數(shù)據(jù)，對匿名取 樣品種和2009年參加山東省區(qū)試的品系進(jìn)行真實性鑒定。32份國家和山東省已經(jīng)審定的棉花品種，采用SDS(十二烷基磺酸鈉，Sodium dodeyl fulfate，簡稱SDS)法提取棉花干種子的DNA，2000對SSR引物對32份棉花 品種DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(denaturing Polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE)作為檢測平臺，統(tǒng)計每個引物的多態(tài)性 信息量(Polymorphism information Content，簡稱PIC)，每對SSR位點的多態(tài)性信息量按 PIC= 1- E fi2公式計算，其中fi為i位點的基因頻率(Smith et al.，1997，Theor. Appl. Genet. ,95(1-2) :163_173.)。以條帶清晰，易于統(tǒng)計，多態(tài)性好，穩(wěn)定性好作為核心引物的 標(biāo)準(zhǔn)，2000對引物中26對(表1)引物符合核心引物的篩選標(biāo)準(zhǔn)，其占總引物數(shù)量的1.3%， 其余引物沒有多態(tài)性，這26對引物覆蓋了棉花的22條染色體。表1經(jīng)過篩選26對多態(tài)性高的SSR引物 注l、aF:正向引物 bR:反向引物2、NAU, Nanjing Agricultural University,縮寫 NAU ;BNL, BrookhavenNational Laboratory，美國布克海文國家實驗室，縮寫B(tài)NL根據(jù)這26對引物對32份審定品種擴(kuò)增的帶型，構(gòu)建棉花DNA指紋數(shù)據(jù)庫，利用 引物依次遞減的原則，對32份審定品種進(jìn)行非加權(quán)組平均法(unweightedpair grouping method with arithmetic mean，簡稱 UPGMA)聚類分析(圖 2,3,4), 11 對核心引物(圖 3) 和26對核心引物(圖2)所反映的32份審定品種間DNA水平的差異基本吻合，當(dāng)引物減少 到8對(圖4)時候，每個大類別所包含的品種有大的變化，且品種間遺傳相似系數(shù)也有較 大的差別，所以將11對核心引物確定為首選核心引物(表1中編號1-11)，11對首選核心 引物理論上可以區(qū)分419904個品種，且出現(xiàn)指紋圖譜相同的概率為2. 38X 10_6。利用11對首選核心引物對匿名取樣品種的真實性進(jìn)行了指紋鑒定，結(jié)果表明該 品種DNA指紋圖譜與為鑫秋4號棉花品種圖譜一致，與匿名取樣品種完全相符。利用11對 核心引物，獲得參加2009年山東省區(qū)域試驗25份參試品系的DNA指紋數(shù)據(jù)庫，將25份參 試品系的DNA指紋數(shù)據(jù)庫和32份審定品種數(shù)據(jù)庫進(jìn)行聚類(圖6)，結(jié)果表明省區(qū)試4號 和魯棉研37遺傳相似系數(shù)為1，省區(qū)試15號和邯棉559遺傳相似系數(shù)為1，為同一品種。這 與田間鑒定結(jié)果一致。
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在實驗室中利用11對核心引物對匿名取樣品種真實性的進(jìn)行檢測，其檢測時間 僅需1-2天即可完成，對2009年山東省棉花區(qū)域試驗的25份參試品系的檢測時間僅需3-5 天即可完成，并且其檢測結(jié)果快速、準(zhǔn)確。在棉花品種市場流通過程中的產(chǎn)權(quán)糾紛和假冒偽 劣品種的辨別上可以提供快速、準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。


圖1表1中編號2對應(yīng)的引物在32份審定品種中擴(kuò)增出的等位基因片段的銀染 2利用26對SSR引物指紋數(shù)據(jù)庫對32份審定品種聚類結(jié)果圖3利用11對SSR引物指紋數(shù)據(jù)庫對32份審定品種聚類結(jié)果圖4利用8對SSR引物指紋數(shù)據(jù)庫對32份審定品種聚類結(jié)果圖5匿名取樣棉花品種(A)的真實性聚類分析圖62009年山東省區(qū)域試驗棉花品系的真實性聚類分析注圖中號碼1-32為32份審定品種對應(yīng)的編號，號碼33_57為25份山東省區(qū)試 棉花品系對應(yīng)的編號
具體實施例方式本發(fā)明的具體實施按照以下步驟進(jìn)行(實施步驟中使用的化學(xué)試劑均為市售試 劑)步驟1棉花品種鑒定的SSR核心引物的篩選表2數(shù)據(jù)庫利用的32份審定棉花品種 注其中 1、2、6、9、11、12、13、16、18、20、22、23、24、25、26、29、31、32對應(yīng)的 18個品
種為國家審定品種，其余14個品種為山東省審定品種。
1、DNA 提取以32份國家和山東省審定的品種為材料(表2)，采用SDS法提取棉花種子的DNA A.棉花干種子的種皮去掉，與石英砂混合粗研磨，之后加入液氮細(xì)研磨，轉(zhuǎn)移到 2mL離心管中加入 ImL DNA提取液[200mmol/L Tris-HCl (pH7. 5)，288mmol/L NaCl,25mmol/ L EDTA，0. 5% SDS (ff/V)]混勻，60°C水浴 lOmin，偶爾振蕩 2 3 次。B.水浴結(jié)束后，13200r/min 離心 5min。C.取SOOul上清轉(zhuǎn)入新的離心管，加入等體積的氯仿異戊醇(24 1，ν/ν)，溫 和翻轉(zhuǎn)50次以上至充分混合均勻。D. 13200r/min 離心 5min。Ε.取600ul的上清液，并加入0. 6-1. O倍體積_20°C預(yù)冷的的異丙醇，并靜置 于-20°C下Ih以上。F.用鉤狀物挑取每個樣品中的絮狀DNA沉淀，用75%的乙醇和無水乙醇各洗一次。G.倒掉酒精風(fēng)干，加400ul ddH20溶DNA，4°C保存待用。將溶解好的DNA溶液13200r/min離心lmin，取上清DNA溶液保存上述方法提取的 基因組DNA利用Eppendorf BioPhotometer生物分光光度計測量DNA的濃度和純度，_20°C 長期保存。0D260/0D280的數(shù)值在1.7-2. 1之間均可以滿足SSR反應(yīng)的需要。DNA使用的 時，使用雙蒸水將DNA濃度均稀釋到25ng/ul。2、PCR 擴(kuò)增總體積為20ul，加入量依此為 IOXPCR buffer 2ul,25mM Mg2+L 2ul,2. 5mMdNTP 1. 6ul,IOuM Forward Primer Iul,IOuM Reverse Primer lul,5U/ul Taq DNAPolymerase 0. 2ul，25ng/ul DNA 2ul, ddH20 Ilul0 反應(yīng)程序采用能提高PCR反應(yīng)過程中特異性和靈敏性的Touchdown-PCR程序 (Darren et al. ,2008, nature Protocols, 9 (3) 1452-1456)進(jìn)行，反應(yīng)程序為:95°C 3min ； 20 個循環(huán)(94°C 30s，65-55°C 30s，72°C 45s，每個循環(huán)降 0. 5°C ) ； 15 個循環(huán)(94°C 30s， 55°C 30s, 72°C 45s) ；72°C 7min ；4°C保存。3、PCR產(chǎn)物的檢測6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳作為檢測平臺，(1)聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑的配制方法如下①10XTBE Buffer (2L)Trisbase216gBoric acid (硼酸) IlOg0. 5M EDTA (pH 8. 0)74. 5ml② 6% Acr-Bis soulation(2L)ACR (丙烯酰氨)114g/2LBis(甲叉聚丙烯酰氨)6g/2L10XTBE100ml/2Lurea840. 8g/2L③ IOXLoading Buffer (50ml)98% Formamide (甲酰胺) 49ml (100% )
IOmM EDTA (pH 8. 0)Iml (0. 5M ρΗ8· 0)0. 25% Brph Blue (溴酚藍(lán))0. 125g0.25%X.cynol (二甲基苯菁)0· 125g④0· 5M EDTA (ρΗ8· 0)186. Ig Na2EDTA-2H20容于800ml H20 中，用固體NaOH調(diào)pH至8. 0 定容至 1000ml， 高溫滅菌，室溫保存。(5) 2% Repel Silance500ml 95% 乙醇，加入 IOml Repel silance 0. 5% Binding Silance500ml 95% 乙醇，加入 2. 5ml Binding Silance(2)變性聚丙烯酰胺膠板的制備A.耳朵板經(jīng)洗滌劑清洗、自來水沖洗、雙蒸水沖洗后，晾干；用無水或95%乙醇擦 拭，晾干；然后涂上2% Repel (剝離硅烷)并用細(xì)紙涂勻，干燥。B.平板用同樣的方法清洗擦拭后，涂上0.5% Binding(親和硅烷)并用細(xì)紙涂 勻，干燥。C.平板、壓條、耳朵板按從下到上的順序進(jìn)行組裝，用夾子固定；D.膠的配制取 6% Acr-Bis 溶液 60ml，加入 140ul 10% AP (過硫酸銨)(_20°C 可長期保存)，70ul TEMED (N, N, N, N-四甲基二乙胺)迅速混勻。E.灌膠把膠液瓶(或用注射器代替)沿膠口來回移動緩緩灌入，輔以輕輕敲打。 待膠液流動至底部，在灌膠口輕輕插入梳子，兩側(cè)及頂部用大號裝訂夾夾好，待膠凝固后上 板電泳。膠版可以在前一天的晚上做好，待第二天使用，膠凝固完全。在氣溫高、天氣干燥 的時候，過夜保存的膠版會出現(xiàn)底部膠稍微的皺縮，但并不影響實驗的效果。(3)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳A.預(yù)電泳膠凝聚好后，除去裝訂夾及梳子，清洗灌膠口處碎膠。與電泳裝置組裝 好后，1/2XTBE約750ml加入電泳儀下槽，1/3XTBE約700ml加入電泳儀上槽，清除膠面的 碎膠及氣泡。60W恒功率預(yù)電泳20-30min :2000V, 100A,60ff(恒定)。B.樣品變性電泳前，在PCR產(chǎn)物中加入7ul IOXLoading Buffer ； 4ulMarker (pBR322DNA/MspI)力卩入 IOul ddH20 和 7ul IOXLoadingBuffer ；PCR 產(chǎn)物和 Marker在95°C條件下變性5min后迅速放入冰水混合物中，IOmin后點樣。C.加樣待膠板預(yù)電泳20min左右時停止預(yù)電泳，使用膠頭滴管徹底清除點樣空 隙的碎膠及氣泡，插入梳子，開始點樣，每個點樣孔2-5ul，點樣量可根據(jù)帶型的清晰度進(jìn)行 適當(dāng)調(diào)整。D.電泳60W恒功率電泳l_2h，電泳時間根據(jù)等位基因片段的大小進(jìn)行調(diào)整。(4)快速銀染法顯帶A.從垂直板電泳槽上，取下膠板并撬開，將帶膠的平板玻璃板放入IOOOml礦泉 水中漂洗15s。然后在放入0. AgNO3中染色8-10min。0. 1 % AgNO3配方1. 5g硝酸銀 +1500ml礦泉水，充分混勻。B.從0. 1 % AgNO3取出平板玻璃板，再用IOOOml礦泉水漂洗兩次，每次洗5s。
C.顯影事先取30. Og NaOH，加入1500ml礦泉水，混勻，制成顯影液。在將漂洗好 的膠放入顯影液中之前l(fā)-2min加入4ml甲醛，在顯影過程中密切觀察顯影效果和背景的深 淺。注意顯影時盡量不要搖動，以免PAGE從玻璃面上脫落。D.當(dāng)DNA帶已經(jīng)清晰顯出來后，馬上從顯影液中取出膠，在礦泉水中漂洗2次，洗 去膠面上的NaOH溶液，室溫晾干即可讀膠。4、帶型的讀取各引物對應(yīng)擴(kuò)增出的等位基因依據(jù)分子量從大到小依次按1，2，3……進(jìn)行編號， 對于數(shù)據(jù)統(tǒng)計過程中出現(xiàn)的新等位基因，按上述規(guī)則插入或追加并編號，原有等位基因編號 可能依此變化。在相同遷移率位置上有帶記為1和無帶記為0。將帶型的有無轉(zhuǎn)化為1和0 數(shù)字組成的指紋數(shù)據(jù)，在記錄過程中，參照MarkerpBR322DNA/MspI帶型，統(tǒng)計主要帶型，忽略 弱雜帶型，統(tǒng)計穩(wěn)定且易于分辨的條帶。品種1到品種32的帶型讀取結(jié)果如表3所示。將同 一個品種在不同的引物所產(chǎn)生的指紋數(shù)據(jù)串聯(lián)起來就組成了該品種的指紋數(shù)據(jù)庫。表3品種1到品種32的帶型讀取結(jié)果 5、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析在獲得不同品種的指紋數(shù)據(jù)后，利用NTSYS-pc軟件(version 2. IOe)計算Dice 遺傳相似性系數(shù)GS = 2a/(2a+b+c)，其中，a為任意兩品種共享譜帶數(shù)，b和c為相應(yīng)兩品 種間的差異條帶，用UPGMA法進(jìn)行聚類分析。利用數(shù)目依次減少的核心引物(26對，11對，8對)在32份審定品種產(chǎn)生的指紋 數(shù)據(jù)進(jìn)行UPGMA聚類分析(依次為圖2，圖3，圖4)，在不同的遺傳相似系數(shù)時，32份品種均 能分為五大類，當(dāng)核心引物減少到11對時，每個大類別所包含的品種(除邯5158)及品種 間的遺傳相似系數(shù)具有較高的一致性(圖3和圖2)。當(dāng)引物減少到8對時候，每個大類別所包含的品種已經(jīng)發(fā)生了大的變化，并且品 種間遺傳相似系數(shù)也有相對較大的差別(圖4和圖2)。11對核心引物和26對核心引物所 反映的32份審定品種間DNA水平的差異基本相吻合，所以將11對核心引物確定為首選核 心引物。
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步驟2利用棉花品種指紋數(shù)據(jù)庫進(jìn)行棉花品種鑒定1、匿名取樣品種(A)的指紋鑒定。利用11對首選核心引物對匿名取樣品種(A) 的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了 11對引物對A品種的指紋數(shù)據(jù)。將A品種和32份審定品種進(jìn)行 聚類，A品種和鑫秋4號遺傳相似系數(shù)為1，判定A品種就是鑫秋4號(圖5)，經(jīng)證實A品 種為鑫秋4號，說明11對首選核心引物對A品種的指紋分析結(jié)果完全與事實相符。2、32份審定品種的系譜來源分析。山農(nóng)圣棉1號(常規(guī)種)為山農(nóng)圣雜3號(雜 交種)后代優(yōu)良單株系統(tǒng)選育的品種，其遺傳相似系數(shù)大于0.9(圖3)。銀瑞361(常規(guī) 種)為SGK321系統(tǒng)選育，魯RH-2(雜交種)其親本之一為K321，SGK321和K321均來自石 遠(yuǎn)321，具有共同的遺傳基礎(chǔ)，銀瑞361和魯RH-2遺傳相似系數(shù)為0. 96 (圖3)。魯棉研29 為魯735系X 168系雜交后代系譜法選育而成，魯棉33為組合1106系/49系Fl代，1106 系為735系與魯棉研18號雜交后代選系，兩者有共同的遺傳基礎(chǔ)魯735系，魯棉研29 (常 規(guī)種)和魯棉研33(雜交種)相似系數(shù)為0. 9以上(圖3)。鑫秋1號為中棉9418XGK12 雜交后代系統(tǒng)選育而成，冠棉4號為系鄂棉品系67008選系9806與GK12雜交后系統(tǒng)選育， 邯5158為邯93-2XGK12選系邯9598后代系統(tǒng)選育而成，魯墾棉33系墾721 (魯棉1號系 選)與墾655 (GK12選系)雜交后系統(tǒng)選育，鑫秋4號為鑫秋1號變異株系統(tǒng)選育，鑫秋1 號、冠棉4號、邯5158、魯墾棉33、鑫秋4號擁有共同的遺傳基礎(chǔ)材料GK12，聚為一類，遺傳 相似系數(shù)大于0. 8 (圖3)。依據(jù)32份審定品種的指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行的聚類分析結(jié)果和品種來源 的系譜分析結(jié)果基本相吻合，也就是說11對核心引物所反映的品種間DNA水平上的差異與 品種來源的系譜分析結(jié)果基本吻合。3、山東省2009年區(qū)試品系真實性鑒定。利用11對核心引物，獲得參加2009年山 東省區(qū)域試驗25份參試品系(表4)的DNA指紋數(shù)據(jù)庫，將25份參試品系的DNA指紋數(shù)據(jù) 庫和32份審定品種數(shù)據(jù)庫進(jìn)行聚類(圖6)，結(jié)果表明57份品種(系)在遺傳系數(shù)為0. 67 時聚為一類，省區(qū)試4號和魯棉研37遺傳相似系數(shù)為1，省區(qū)試15號和邯棉559遺傳相似 系數(shù)為1，為同一品種。鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果一致。表4 2009年山東省區(qū)試25份棉花品系
權(quán)利要求
一種利用SSR核心引物鑒定棉花品種的方法，其特征在于由棉花干種子提取基因組DNA，利用11對SSR核心引物NAU1167，NAU2026，NAU1269，NAU2257，NAU1103，BNL1694，NAU5046，NAU2083，NAU2277，NAU1043，NAU3468構(gòu)建32份審定棉花品種的DNA指紋數(shù)據(jù)庫，將測試品種或品系DNA指紋數(shù)據(jù)和已構(gòu)建的棉花品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行UPGMA聚類分析，依據(jù)品種間Dice遺傳相似系數(shù)可對測試品種或品系的真實性作出判斷，遺傳相似系數(shù)為1的為同一品種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用SSR標(biāo)記進(jìn)行棉花品種鑒定的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。利用32份國家和山東省已經(jīng)審定的棉花品種作為樣本材料，對棉花分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公布的2000對SSR引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，最終確立了11對引物為棉花品種鑒定的首選核心引物，11對首選核心引物理論上可以區(qū)分419904個品種，且出現(xiàn)指紋圖譜相同的概率為2.38×10-6。利用11對核心引物構(gòu)建了32份審定品種的DNA指紋數(shù)據(jù)庫，并利用該數(shù)據(jù)庫對匿名取樣品中A和山東省2009年25份區(qū)試品系真實性進(jìn)行了指紋鑒定，其鑒定結(jié)果與田間試驗結(jié)果完全一致。本發(fā)明所建立的SSR-DNA指紋技術(shù)可快速、準(zhǔn)確的鑒定棉花品種。
文檔編號C12Q1/68GK101921866SQ20101027144
公開日2010年12月22日 申請日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者馮雪梅, 劉峰, 張友秋, 張娜, 徐子初, 沈法富, 趙佩 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué);山東鑫秋種業(yè)科技有限公司