專利名稱：發(fā)酵法制備VB₁₂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于發(fā)酵工程領(lǐng)域生產(chǎn)VB12的方法，尤其是一種厭氧發(fā)酵法制備 VB12的方法。
背景技術(shù)：
維生素B12(VB12)是一種重要的水溶性維生素，又稱鈷胺素，根據(jù)分子取代基的 差異又可以細(xì)分為氰鈷胺素、腺苷鈷胺素、羥基鈷胺素、甲基鈷胺素等，VB12主要應(yīng)用于 醫(yī)藥、食品、飼料等行業(yè)。目前，VB12采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，主要有采用謝氏丙酸桿菌 (Propionibacteria shermanni)的厭氧工藝和采用脫氮假單胞菌的好氧工藝。其中，好氧 工藝的發(fā)酵單位高、成本低，在氰鈷胺素以及飼料級產(chǎn)品中占主導(dǎo)地位，而厭氧工藝獲得的 腺苷鈷胺素的質(zhì)量是最好的。丙酸菌通過厭氧發(fā)酵，將葡萄糖代謝成為丙酸、乙酸和二氧 化碳，這個基本的生化途徑需要2-甲基丙二酰輔酶A變位酶的催化，該酶需要VB12作為輔 酶，丙酸菌在細(xì)胞內(nèi)能夠過量合成并儲存這個輔酶，因此可以通過培養(yǎng)丙酸菌并收獲細(xì)胞， 經(jīng)進一步分離純化得到VB12產(chǎn)品。發(fā)酵的基本培養(yǎng)基采用 3%的玉米漿以及5% 10%的碳水化合物(葡萄糖等)，其中，玉米漿的內(nèi)在質(zhì)量嚴(yán)重影響發(fā)酵水平，因玉米漿造 成的厭氧VB12發(fā)酵單位的波動可以達到10% 30%的幅度。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供了一種能夠提高厭氧VB12的發(fā)酵單位 的發(fā)酵法制備VB12的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的發(fā)酵法制備VB12的方法，包括如下步驟a，對玉米漿進行凈化處理；b，采用經(jīng)過上述處理的玉米漿配制培養(yǎng)基，接種謝氏丙酸桿菌后，進行厭氧發(fā) 酵；c，將步驟b所得的發(fā)酵液經(jīng)常規(guī)程序進行VB12的提取精制，獲得VB12產(chǎn)品。具體 的講，依次按照過濾、水解、樹脂吸附、解析濃縮、結(jié)晶等常規(guī)程序進行VB12的提取精制，獲 得VB12廣品。具體的講，上述步驟a包括如下步驟al，將普通的玉米漿進行稀釋；a2,向稀釋后的玉米漿中加入含有鈣離子的化合物，調(diào)節(jié)pH4. 5 8. 0。步驟a2后可包括步驟a3，將加入含有鈣離子化合物的玉米漿在30°C 90°C進行加熱處理，得到含有不 溶性絮狀沉淀物的玉米漿，加熱，使沉淀物形成速度快，沉淀多，吸附有害物質(zhì)的能力強，過 濾速度快。進一步的，步驟a3后包括步驟a4，將步驟a3所得的含有不溶性絮狀沉淀物的玉米漿進行液固分離，去除沉淀物。步驟al中普通玉米漿稀釋到干物質(zhì)含量5% 20% (w/v)。具體的，含有鈣離子的化合物為氫氧化鈣、氧化鈣、氯化鈣中的至少一種。當(dāng)含有鈣離子的化合物為氫氧化鈣時，其加入量為5克 100克氫氧化鈣/千克 玉米漿干物質(zhì)。步驟b培養(yǎng)基中經(jīng)凈化處理后的玉米漿干物質(zhì)含量為0. 5% 4% (w/v)。步驟b中發(fā)酵溫度為25 35°C，發(fā)酵培養(yǎng)時間為48 120小時。步驟b中種子培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)pH值為5. 0 7. 5。采用本發(fā)明的技術(shù)方案，由于在步驟a中加入的含有鈣離子的化合物與玉米漿中 的植酸發(fā)生反應(yīng)，形成不溶性絮狀沉淀物，液固分離是為了除去反應(yīng)形成的沉淀，此沉淀物 在溫度較高時能夠更多地吸附一些VB12發(fā)酵的抑制因子，所以一般情況下液固分離應(yīng)當(dāng)在 步驟a3后趁熱進行，其中，液固分離采用過濾的方式是最方便的，也可以采用離心分離的 方式。步驟al中，由于反應(yīng)的好壞相當(dāng)程度上取決于玉米漿的濃度，一般來講，低濃度 處理有利于未來的VB12發(fā)酵，但過低的濃度不方便使用，因此，將玉米漿稀釋到5% 20% (w/v)會獲得較好的效果。當(dāng)玉米漿稀釋后濃度低于5%時可以獲得較好的清潔效果，但操 作體積有些偏大，但高于20%，抑制因子去除不夠，因此，將范圍放在5-20%。此外，步驟b中種子培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)pH值控制在5. 0 7. 5，在發(fā)酵至48小時左 右或者殘?zhí)菫?%左右加入前體DBI (5，6- 二甲基苯丙咪唑)，則發(fā)酵的效果會更好。綜上所述，采用上述技術(shù)方案，可以從兩個方面改進VB12的發(fā)酵1、由于玉米漿的 凈化，使其中的某些抑制因子的含量下降，發(fā)酵效價得到提高。此時，由于植酸的減少對發(fā) 酵沒有影響，但對發(fā)酵結(jié)束后的過濾有影響，植酸含量過低固液分離難度加大，所以溫度和 PH的相互調(diào)整也是為了既除抑制因子又保植酸，兩者相互兼顧，2、由于玉米漿的凈化，使玉 米漿原有的微生物雜菌(如乳酸菌等)數(shù)量下降，降低了滅菌所需要的條件、也降低了發(fā)酵 中的染菌率。
具體實施例方式下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作更進一步詳細(xì)說明實施例一步驟a，玉米漿的凈化處理al，用自來水將普通玉米漿稀釋到干物質(zhì)含量為10 %的濃度；a2,取干物質(zhì)含量為10 %的玉米漿1L，加入氫氧化鈣固體或乳液，使pH調(diào)節(jié)到 5. 5 ；a3，將上述加入氫氧化鈣的玉米漿加熱到60°C，維持lOmin，出現(xiàn)絮凝沉淀；a4，真空抽濾，去掉濾餅，獲得凈化玉米漿0. 94L。取10毫升凈化玉米漿，105°C烘干2小時，測定其干物質(zhì)含量為9. 2%，其余凈化玉 米漿冷藏備用。步驟b，發(fā)酵(1)菌株謝氏丙酸桿菌(Propionibacteria shermanni)
(2)固體培養(yǎng)基配方(w/v)葡萄糖3%、玉米漿干物質(zhì)1%、磷酸二氫鉀0. 1%、氯 化鈷 0. 001%、瓊脂 2%, pH6. 5-7. 2。(3) 一級種子及二級種子培養(yǎng)基配方(w/v):葡萄糖5%，玉米漿干物質(zhì)1%，磷酸 二氫鉀 0. 15%，氯化鈷 0. 0015%, pH7. 0。(4)發(fā)酵培養(yǎng)基配方(干物w/v):葡萄糖7.0%、玉米漿干物質(zhì)2%、磷酸二氫鉀 0. 15%，氯化鈷 0. 0015%, pH7. 0(5)滅菌采用糖、漿分別滅菌工藝，115°C、25分鐘滅菌，避免不良反應(yīng)。(6)發(fā)酵工藝采用250ml三角瓶裝液200毫升發(fā)酵，接種量為15%。即一級種 200ml接入冰箱保藏種子1ml，培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)溫度30°C，每8小時用無菌氨水調(diào)pH7. 0 ； 二級種子170ml接入一級種子30ml，培養(yǎng)48小時，每8小時用無菌氨水調(diào)pH7. 0，發(fā)酵瓶 170ml接入二級種子30ml，培養(yǎng)溫度30°C，每8小時用無菌氨水調(diào)pH7. 0，第48小時加入 15ppmDBI，培養(yǎng)84小時。(7)對比設(shè)計驗證組采用凈化玉米漿，對照組采用普通玉米漿。(8)檢驗方法液相法檢測VB12的發(fā)酵效價。(9)對比結(jié)果由表1可以看出凈化玉米漿可以使發(fā)酵單位有很大幅度的提高。表1普通玉米漿與凈化玉米漿對VB12發(fā)酵的影響
權(quán)利要求
一種發(fā)酵法制備VB12的方法，其特征在于該方法包括如下步驟a，對玉米漿進行凈化處理；b，采用經(jīng)過上述處理的玉米漿配制培養(yǎng)基，接種謝氏丙酸桿菌后，進行厭氧發(fā)酵；c，將步驟b所得的發(fā)酵液經(jīng)常規(guī)程序進行VB12的提取精制，獲得VB12產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵法制備VB12的方法，其特征在于所述的步驟a包括如下 步驟al，將普通的玉米漿進行稀釋；a2,向稀釋后的玉米漿中加入含有鈣離子的化合物，并調(diào)節(jié)pH4. 5-8. 0。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵法制備VB12的方法，其特征在于所述步驟a2后包括步驟a3，將加入含有鈣離子化合物的玉米漿在30°C 90°C進行加熱處理，得到含有不溶性 絮狀沉淀物的玉米漿。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵法制備VB12的方法，其特征在于所述步驟a3后包括步驟a4，將步驟a3所得的含有不溶性絮狀沉淀物的玉米漿進行液固分離，去除沉淀物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一項所述的發(fā)酵法制備VB12的方法，其特征在于將步驟al 中普通玉米漿稀釋到干物質(zhì)含量5% -20% (w/v)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一項所述的發(fā)酵法制備VB12的方法，其特征在于所述的含 有鈣離子的化合物為氫氧化鈣、氧化鈣、氯化鈣中的至少一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的發(fā)酵法制備VB12的方法，其特征在于所述的含有鈣離子的 化合物為氫氧化鈣，其加入量為5克 100克氫氧化鈣/千克玉米漿干物質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的發(fā)酵法制備VB12的方法，其特征在于步驟b培 養(yǎng)基中經(jīng)凈化處理后的玉米漿干物質(zhì)加入含量為0. 5% -4% (w/v)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的發(fā)酵法制備VB12的方法，其特征在于步驟b中 發(fā)酵溫度為25-35°C，發(fā)酵培養(yǎng)時間為48 120小時。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的發(fā)酵法制備VB12的方法，其特征在于步驟b中 種子培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)PH值為5. 0-7. 5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于發(fā)酵工程領(lǐng)域生產(chǎn)VB12的方法，尤其是一種厭氧發(fā)酵法制備VB12的方法。該方法包括對玉米漿進行凈化處理；采用經(jīng)過上述處理的玉米漿配制培養(yǎng)基，接種謝氏丙酸桿菌后，進行厭氧發(fā)酵；將所得的發(fā)酵液經(jīng)常規(guī)程序進行VB12的提取精制，獲得VB12產(chǎn)品。采用該方法，實現(xiàn)了對常規(guī)的謝氏丙酸桿菌厭氧發(fā)酵工藝的改進，提高了發(fā)酵效價。
文檔編號C12P19/42GK101942494SQ201010272408
公開日2011年1月12日 申請日期2010年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月6日
發(fā)明者儀宏, 劉雪培, 唐麗娜, 曹云峰, 李雪然, 王麗麗, 賈寧, 趙宇, 趙強, 馬蕙 申請人:河北科技大學(xué);河北華榮制藥有限公司