專利名稱：一種烷基型硫酸酯酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及硫酸酯酶，特別涉及一種烷基型硫酸酯酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
隨著去污劑的濫用，廢水嚴(yán)重影響了水生生物的生存環(huán)境，廢水處理也逐漸成為 當(dāng)今社會(huì)亟待解決的問(wèn)題之一。十二烷基磺酸鈉(Sodium dodecyl sulfate, SDS)作為一 種表面活性劑，廣泛應(yīng)用于家用清洗劑以及工業(yè)生產(chǎn)中。廢水中的SDS因其碳鏈過(guò)長(zhǎng)而不 易降解，對(duì)環(huán)境會(huì)造成一定的污染。對(duì)SDS進(jìn)行生物降解的研究，在生物學(xué)、生態(tài)學(xué)和經(jīng)濟(jì) 上都有重要意義。烷基型硫酸酯酶(Alkylsulfatase)是硫酸酯酶(Sulfatases)(EC 3. 1. 6)中的一 種，它能夠水解硫酸酯鍵后釋放無(wú)機(jī)硫酸根和相應(yīng)的醇類。烷基型硫酸酯酶能夠較好地降 解表面活性劑，對(duì)廢水中的表面活性劑成分進(jìn)行有效的清除，即使針對(duì)不易分解的長(zhǎng)鏈SDS 也能發(fā)揮作用。因此，烷基型硫酸酯酶在廢水處理中扮演了重要角色。已發(fā)現(xiàn)的烷基型硫酸酯酶大多來(lái)源于革蘭氏陰性菌中，研究最為透徹的是 Pseudomonassp. strain C12B( = NCIMB 11753 = ATCC 43648)禾口 Comamonas terrigena NCIMB 8193。在Pseudomonas sp. strain C12B菌株中，研究者發(fā)現(xiàn)其具有5種不同的 Alkylsulfatase(1. Bartholomew B, Dodgson KS, Gorham SD(1978)Purification and properties of the Slsecondary alkylsulphohydroIase of the detergent-degrading microorganism, Pseudomonas C12B. Biochem J 169 :659_667 ；2.Cloves JM, Dodgson KS, White GF, Fitzgerald Jff(1980)Purificationand properties of the P2 primary alkyIsulphohydroIase of the detergent-degrading bacteriumPseudomonas C12B. Biochem J 185(1) 23-31 ；3.Dodgson KS, Fitzgerald JW，Payne WJ(1974)Chemically defined inducers of alkyIsulphatases present in Pseudomonas C12B. Biochem J138 53-62)；而在 Comamonas terrigena NCIMB 8193 中只有 2 種(4. Matcham Gff, Dodgson KS(1977)Purification, properties and cellular localization of the stereospecific CS2 secondaryalkylsulphohydroIase ofComamonas terrigena. Biochem J167 (3) :723-729.)。然而這兩個(gè)菌株里的Alkylsulfatase并沒(méi)有在外源得到表達(dá)，因此 該酶無(wú)論是在酶量上、分離純化方法上及其應(yīng)用的廣泛程度上都受到了限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種烷基型硫酸酯酶SdsA。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種烷基型硫酸酯酶基因sdsA。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種所述烷基型硫酸酯酶SdsA的制備方法。所述烷基型硫酸酯酶命名為SdsA，所述烷基型硫酸酯酶SdsA的生產(chǎn)菌株為假單 胞菌株P(guān)seudomonas sp. S9，該菌株已于2010年7月20日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No. 4026。
1501 GCTGAACCGA ACAATCMGC GGCAAMAAT ATGCMGCCG ACGCGCTGGA ACAGCTGGGT1561 TATCAAGCTG AGAGCGGCCC ATGGCGCAAC TTCTACCTCA CAGGTGCGCA GGAACTTCGC1621 AATGGCGTGC MCAACTTCC GACACCCGAT ACCGCAAGTC CTGACACCGT CAAGGCGATG1681 GACTTGGATT TGTTCTTCGA CTTCCTGGCC ATGCGTTTGA AAGGGCCTGA TGTTGCCGAC1741 AAGCACATCA CTCTCAACCT TGACTTTACC GATCTCAAAC AGAAGTACAC GCTCGAGATG1801 GTAAACGGTG TGCTCAACCA CACCGMGGC ATGCMGCTA AGAACGCCGA CGCGACCGTC1861 ACCTTAACGC GTGAAACCCT TAATAACGTG ATGCTAAAAC AGACCACGCT AAAAGATGCG1921 GMAGCTCAG GCGACATCAA MTCGMGGT GACAMGGCA AGCTCGAAGA GCTMTGAGC1981 TACATGGATA ACTTCGACTT CTGGTTCAAC ATTGTGACGC CATAA所述烷基型硫酸酯酶SdsA的制備方法包括以下步驟1)克隆烷基型硫酸酯酶基因sdsA，將所述烷基型硫酸酯酶基因sdsA插入表達(dá)載 體，構(gòu)建攜帶所述烷基型硫酸酯酶基因sdsA的重組表達(dá)載體；2)將所述烷基型硫酸酯酶基因sdsA的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，選 取轉(zhuǎn)化后大腸桿菌BL21中的陽(yáng)性克隆于培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；3)離心收集發(fā)酵后的大腸桿菌BL21細(xì)胞，重懸所述大腸桿菌BL21細(xì)胞于裂解緩 沖液中進(jìn)行裂解，將裂解后的懸液進(jìn)行離心，收集上清液；4)將步驟3)所得上清液與Ni-NTA Agarose混勻，按照純化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純 化，即得所述烷基型硫酸酯酶SdsA0在步驟1)中，所述表達(dá)載體可為pET-His載體。在步驟2)中，所述培養(yǎng)基可為含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，所述發(fā)酵 培養(yǎng)的條件可為溫度為37°C，搖床培養(yǎng)至A6tltl = 0. 6時(shí)(A6tltl為發(fā)酵液在600nm處的吸光 度值)，再加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為50ymol/L，16°C誘導(dǎo)過(guò)夜。在步驟3)中，所述裂解緩沖液的配方可為0. 3mol/L NaCl，IOmmol/L咪唑， 50mmol/LNaH2P04，去離子水定容至1L，pH 8.0。所述離心可為18000g，離心的時(shí)間可為 20mino本發(fā)明所述烷基型硫酸酯酶SdsA能夠在大腸桿菌中穩(wěn)定表達(dá)，并且純化后的酶 活力很高，熱穩(wěn)定性好，具備較廣的PH耐受性，可以克服現(xiàn)有烷基型硫酸酯酶活力低下、酶 分離純化過(guò)程繁瑣等不足，可廣泛應(yīng)用于降解SDS。


圖1為烷基型硫酸酯酶SdsA重組表達(dá)純化的SDS-PAGE圖譜。在圖1中，M為蛋 白Marker，l為重組載體pET-SdsA在菌株BL21中的表達(dá)(未進(jìn)行誘導(dǎo))，2為重組載體 PET-SdsA在菌株BL21中的誘導(dǎo)表達(dá)，3為經(jīng)Ni-NTA純化所得的目的蛋白SdsA(70kDa)。圖2為烷基型硫酸酯酶SdsA重組蛋白的酶活性與PH值的關(guān)系。在圖2中，橫坐 標(biāo)為PH，縱坐標(biāo)為酶活性(％ )。圖3為烷基型硫酸酯酶SdsA重組蛋白的酶活性與反應(yīng)溫度的關(guān)系。在圖3中，橫 坐標(biāo)為溫度CC )，縱坐標(biāo)為酶活性(％ )。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所 述的實(shí)驗(yàn)條件，或按照試劑或儀器生產(chǎn)廠商所建議的條件。1. Pseudomonas sp. S9 基因組 DNA 的提取用接種環(huán)挑取_80°C保存的Pseudomonas sp. S9菌種，在LB培養(yǎng)基平板(一種 細(xì)菌培養(yǎng)基，含有1 %的胰蛋白胨，1 %的氯化鈉，0. 5 %的酵母提取物，1. 5 %的瓊脂糖)上 劃線分離單菌落。劃線后的平板置37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取一個(gè)單菌落接種到5mL的LB培養(yǎng) 液管中(一種細(xì)菌培養(yǎng)基，含有的胰蛋白胨，的氯化鈉，0.5%的酵母提取物)，37°C 搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜，收集菌，6000g離心Smin后棄去上清，沉淀重新懸浮于567 μ L TE緩沖液 (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，pH 8. 0)，加 30yL 10% SDS，搖勻，再加入 3 μ L 蛋白酶 K (20mg/ mL)，輕輕混勻，37°C水浴lh。加入IOOyL 5mol/L NaCl，充分混勻，再加入80 μ L CTAB/ NaCl (CTAB 十六烷基三乙基溴化銨)，輕柔混勻，65°C水浴lOmin。用酚/氯仿/異戊醇 (25 24 1)抽提兩次，15000g離心lOmin，上清小心轉(zhuǎn)移至另一個(gè)離心管中。用氯仿/ 異戊醇(24 1)抽提一次，15000g離心lOmin，用異丙醇沉淀DNA，再用乙醇洗滌兩次，沉淀 溶于重蒸水中，-20°C保存。2. Pseudomonas sp. S9基因組文庫(kù)的構(gòu)建及產(chǎn)烷基型硫酸酯酶sdsA陽(yáng)性克隆的 篩選用Sau3AI部分酶切Pseudomonas sp. S9總DNA，回收3 IOkb的酶切片斷。與 pUC19/BamHI載體連接，電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中。在含有0. 1 % SDS的LB/Amp+ (Amp濃 度為100yg/mL)平板上篩選能產(chǎn)生白色圈的陽(yáng)性克隆子，挑選陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序。3.烷基型硫酸酯酶sdsA基因的PCR擴(kuò)增和序列分析根據(jù)測(cè)序結(jié)果，在NCBI上比對(duì)序列，得到烷基型硫酸酯酶sdsA基因的全長(zhǎng)序列 (SEQID No. 1)。根據(jù)篩庫(kù)得到的脫硫酯酶結(jié)構(gòu)基因序列(不含有信號(hào)肽)，設(shè)計(jì)引物F :5’ ATAGGATCCGCAGAAACAGCTAAGCCT G-3，(劃線為 BamHI 酶切位點(diǎn)) (SEQIDNo. 3)；R :5，M0GM TTCTTA TGG OGT CAC AAT GTT G-3，(劃線為 EcoRI 酶切位點(diǎn))(SEQID No. 4)。以提取的Pseudomonas sp. S9基因組DNA為模板，用引物F和R擴(kuò)增全長(zhǎng)的sdsA 基因。PCR反應(yīng)條件為在5(^1^的反應(yīng)體系中含有，1001^模板，400歷0/1引物？，400111110/ L 引物 R，200 μ mo/L dNTP, 2. 5mmo/L Mg2+，5U Primer Star HSTaq 酶(購(gòu)自 TaKaRa 公司)， 5L10XPCR 反應(yīng)緩沖液；反應(yīng)條件:94V 5min ；98°C 10s、52°C 45s,72°C 2min(30cycles)； 72°C 10min;4°C保存。純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，與同種酶酶切后的pET_His載體連接， CaCl2法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ToplO中，挑陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)得到的核苷酸序列推導(dǎo)出烷基型硫酸酯酶SdsA的氨基酸序列，共675個(gè)氨基 酸殘基，其氨基酸序列詳見(jiàn)SEQ ID No. 2。4.重組SdsA的表達(dá)和純化克隆烷基型硫酸酯酶基因sdsA，將其插入表達(dá)載體pET-His中，構(gòu)建攜帶烷基型 硫酸酯酶基因sdsA的重組表達(dá)載體。將攜帶sdsA基因的重組表達(dá)載體pET-SdsA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，選取陽(yáng)性克隆在含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C搖培至A_ = 0.6時(shí)，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度50ymol/L，16°C誘導(dǎo)過(guò)夜后將 菌液收集至200mL的離心管中，5000g離心沉淀細(xì)菌細(xì)胞。將細(xì)菌細(xì)胞重新懸浮在20mL的 裂解緩沖液(裂解緩沖液配方為0. 3mol/L NaCl，10mmol/L咪唑，50mmol/L NaH2PO4, pH 8. 0)中，超聲波處理至菌液成半透明，18000g離心20min，上清與預(yù)先用裂解緩沖液平衡的 Ni-NTAAgarose混勻，4°C結(jié)合lh，純化過(guò)程按照純化試劑盒(購(gòu)自Qiagen公司)說(shuō)明進(jìn)行。 純化的蛋白經(jīng)8%的SDS-PAGE電泳分析，其分子量約為70kDa，純度達(dá)95%以上(結(jié)果參見(jiàn) 圖1)5.重組烷基型硫酸酯酶SdsA的酶學(xué)性質(zhì)5. 1重組烷基型硫酸酯酶SdsA酶活力的測(cè)定方法如下10 μ L 稀釋純化后的 SdsA(150 μ g/mL)，加入到 490 μ L 50mmol/L Tris-HCl 緩沖 液(pH 9.0)含0.01% &八)505中，701下反應(yīng)51^11后，取1(^1^反應(yīng)液加入到20(^1^ Stains-all (C3tlH27BrN2S2，F(xiàn)luka)試劑中顯色，438nm處測(cè)吸收值。酶活性定義為每分鐘降 解Ιμπιο SDS的酶量為1U。通過(guò)酶活性檢測(cè)，計(jì)算得到重組烷基型硫酸酯酶SdsA的酶活 力為 23U/mg。5. 2重組烷基型硫酸酯酶SdsA的最適pH測(cè)定方法如下經(jīng)純化的重組SdsA在不同的pH值下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測(cè)定其最適pH。重組SdsA 在不同PH的緩沖液中70°C溫度下進(jìn)行重組SdsA酶活力測(cè)定。結(jié)果表明(參見(jiàn)圖2)，重組 SdsA的最適pH為9. 0，在pH6 11的范圍內(nèi)，酶活性都維持在最大酶活性的90%以上。5. 3重組烷基型硫酸酯酶SdsA的最適溫度及溫度穩(wěn)定性測(cè)定方法如下重組SdsA的最適溫度的測(cè)定為在Tris-HCl緩沖液(pH 9. 0)體系及不同溫度下 進(jìn)行酶促反應(yīng)。熱穩(wěn)定性測(cè)定為重組SdsA在60°C、65°C、7(TC下分別處理不同時(shí)間，再在 70°C下進(jìn)行酶活性測(cè)定。酶促反應(yīng)最適溫度測(cè)定結(jié)果表明(參見(jiàn)圖3)，其最適溫度為70°C。 酶的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，60°C處理Ih后，剩余酶活還有95%以上；70°C處理Ih后，酶活能 維持在60%以上。
權(quán)利要求
一種烷基型硫酸酯酶SdsA，其特征在于所述烷基型硫酸酯酶SdsA的生產(chǎn)菌株為假單胞菌株P(guān)seudomonas sp.S9，該菌株已于2010年7月20日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No.4026；所述烷基型硫酸酯酶SdsA的氨基酸序列如下1 MKLNALSTAT HGSRSSPVKL WKFSTSFLLA ASIIVSGQSW AAETAKPATD ATKAANDALL61 KELPFDDKTS FDLAHKGFIA PLPAEPIKGE KGNMIWDPSK YGFIKEGEAA PDTTNPSLWR121 QSQLINISGL FEVTDGIYQV RNYDLSNMTI VEGKDGITIF DPLISQETAK AALDLYYKHR181 PKKPVVAVIY THSHVDHYGG VRGVVDEADV KAGKVKIYAP LGFLEHAVAE NVMAGTAMSR241 RASYMYGNLL PPDAKGQLGA GLGTTTSAGT VTLIPPTDII KETGETHVID GLTYEFMYAP301 GSEAPAEMLY YIKEKKALNA AEDSTHTLHN TYSLRGAKIR DPLAWSKYLN EALKLWGDDV361 QVMYAMHHWP VWGNKEVREQ LSLQRDMYRY INDETLRLAN KGYTMTEIAE QVKLPKKIAT421 KFSNRGYYGS LNHNVKATYV LYLGWFIGNP ATLWELPPAD KAKRYVEMMG GADAVLKKAK481 EYYDKGDFRW VAEVVNHVVF AEPNNQAAKN MQADALEQLG YQAESGPWRN FYLTGAQELR541 NGVQQLPTPD TASPDTVKAM DLDLFFDFLA MRLKGPDVAD KHITLNLDFT DLKQKYTLEM601 VNGVLNHTEG MQAKNADATV TLTRETLNNV MLKQTTLKDA ESSGDIKIEG DKGKLEELMS661 YMDNFDFWFN IVTP
2. 一種烷基型硫酸酯酶基因sdsA，其特征在于所述烷基型硫酸酯酶基因sdsA的序列 如下1ATGAAATTGAATGCCCTATCGACCGCAACGCATGGGAGCCGGTCATCTCCAGTCAAATTA61TGGAAATTCAGCACTTCGTTTCTGCTTGCCGCATCCATCATAGTATCTGGTCAAAGCTGG121GCTGCAGAAACAGCTAAGCCTGCAACGGATGCGACCAAAGCCGCTAACGATGCTTTGCTC181AAAGAGCTGCCATTTGACGACAAGACCTCCTTCGACTTAGCGCACAAAGGCTTTATTGCT241CCCCTGCCTGCAGAACCGATCAAAGGCGAAAAGGGCAATATGATCTGGGACCCAAGCAAA301TATGGCTTTATTAAAGAAGGTGAAGCCGCGCCGGACACGACCAACCCAAGCTTGTGGCGC361CAATCTCAACTAATCAATATTTCTGGCCTGTTTGAAGTCACCGACGGCATTTACCAAGTC421CGCAACTATGACTTGTCGAACATGACCATCGTCGAAGGCAAAGATGGCATCACCATATTC481GACCCACTGATTTCACAAGAAACAGCGAAGGCAGCGCTCGACCTGTACTACAAACATCGG541CCGAAAAAACCTGTGGTTGCAGTCATCTACACACACAGCCACGTTGACCACTACGGCGGC601GTGCGCGGTGTTGTCGATGAGGCAGATGTTAAGGCCGGCAAGGTTAAGATCTACGCACCG661TTAGGTTTCCTTGAGCACGCCGTGGCCGAGAACGTTATGGCAGGTACTGCCATGAGCCGC721CGGGCCAGCTATATGTACGGTAACCTGCTGCCGCCAGACGCCAAAGGGCAATTAGGCGCT781GGTCTGGGTACCACCACATCGGCAGGTACAGTAACGCTGATTCCACCAACCGACATCATC841AAAGAAACCGGTGAAACCCACGTAATCGACGGTCTCACTTACGAGTTCATGTATGCGCCT901GGCAGTGAAGCCCCGGCGGAGATGCTCTACTACATCAAGGAGAAGAAAGCCCTTAACGCT961GCAGAAGACTCCACGCATACGCTGCACAATACCTACTCGCTTCGTGGCGCCAAGATCCGT1021GACCCACTCGCTTGGTCGAAGTACCTCAACGAAGCACTGAAACTCTGGGGTGATGACGTT1081CAAGTGATGTATGCCATGCACCACTGGCCGGTGTGGGGCAACAAAGAAGTGCGCGAGCAG1141TTATCGCTACAACGCGACATGTACCGCTACATCAATGATGAAACCCTTCGCCTAGCGAAC1201AAGGGTTACACCATGACCGAAATCGCGGAGCAGGTGAAACTGCCAAAGAAAATTGCTACA1261AAATTCTCCAACCGCGGTTACTACGGCTCACTGAATCACAACGTCAAAGCCACTTATGTT1321CTGTATCTTGGCTGGTTCATTGGCAACCCCGCCACATTGTGGGAGCTGCCACCTGCAGAC1381AAGGCTAAGCGTTACGTTGAAATGATGGGTGGTGCTGACGCTGTGCTGAAAAAAGCCAAG1441GAGTATTACGACAAAGGTGATTTCCGCTGGGTAGCCGAGGTAGTCAACCATGTGGTCTTT1501GCTGAACCGAACAATCAAGCGGCAAAAAATATGCAAGCCGACGCGCTGGAACAGCTGGGT1561TATCAAGCTGAGAGCGGCCCATGGCGCAACTTCTACCTCACAGGTGCGCAGGAACTTCGC1621AATGGCGTGCAACAACTTCCGACACCCGATACCGCAAGTCCTGACACCGTCAAGGCGATG1681GACTTGGATTTGTTCTTCGACTTCCTGGCCATGCGTTTGAAAGGGCCTGATGTTGCCGAC1741AAGCACATCACTCTCAACCTTGACTTTACCGATCTCAAACAGAAGTACACGCTCGAGATG1801GTAAACGGTGTGCTCAACCACACCGAAGGCATGCAAGCTAAGAACGCCGACGCGACCGTC1861ACCTTAACGCGTGAAACCCTTAATAACGTGATGCTAAAACAGACCACGCTAAAAGATGCG1921GAAAGCTCAGGCGACATCAAAATCGAAGGTGACAAAGGCAAGCTCGAAGAGCTAATGAGC1981TACATGGATAACTTCGACTTCTGGTTCAACATTGTGACGCCATAA
3. 3.如權(quán)利要求]L所述一種烷基型硫酸酯酶SdsA的制備方法，包括以下步驟1)克隆烷基型硫酸酯酶基因sdsA，并將所述烷基型硫酸酯酶基因sdsA插入表達(dá)載體， 構(gòu)建攜帶所述烷基型硫酸酯酶基因sdsA的重組表達(dá)載體；2)將所述烷基型硫酸酯酶基因sdsA的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，選取轉(zhuǎn) 化后大腸桿菌BL21中的陽(yáng)性克隆于培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；3)離心收集發(fā)酵后的大腸桿菌BL21細(xì)胞，重懸所述大腸桿菌BL21細(xì)胞于裂解緩沖液 中進(jìn)行裂解，將裂解后的懸液進(jìn)行離心，收集上清液；4)將步驟3)所得上清液與Ni-NTAAgarose混勻，按照純化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化，即 得所述烷基型硫酸酯酶SdsA0
4.如權(quán)利要求3所述一種烷基型硫酸酯酶SdsA的制備方法，其特征在于在步驟1)中， 所述表達(dá)載體為pET-His載體。
5.如權(quán)利要求3所述一種烷基型硫酸酯酶SdsA的制備方法，其特征在于在步驟2)中， 所述培養(yǎng)基為含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求3所述一種烷基型硫酸酯酶SdsA的制備方法，其特征在于在步驟 2)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為溫度為37°C，搖床培養(yǎng)至慫㈨=0.6時(shí)，再加入異丙基硫 代- β -D-半乳糖苷至終濃度為50 μ mol/L, 16°C誘導(dǎo)過(guò)夜。
7.如權(quán)利要求3所述一種烷基型硫酸酯酶SdsA的制備方法，其特征在于在步驟3)中， 所述裂解緩沖液的配方為0. 3mol/L NaCl，10mmol/L咪唑，50mmol/L NaH2PO4，去離子水定 容至 1L，pH 8. 0。
8.如權(quán)利要求3所述一種烷基型硫酸酯酶SdsA的制備方法，其特征在于在步驟3)中， 所述離心為18000g，離心的時(shí)間為20min。
全文摘要
一種烷基型硫酸酯酶及其制備方法，涉及硫酸酯酶。提供一種烷基型硫酸酯酶SdsA及制備方法，以及烷基型硫酸酯酶基因sdsA。烷基型硫酸酯酶SdsA的生產(chǎn)菌株為假單胞菌株P(guān)seudomonas sp.S9。制備時(shí)，克隆烷基型硫酸酯酶基因sdsA，將烷基型硫酸酯酶基因sdsA插入表達(dá)載體，構(gòu)建攜帶烷基型硫酸酯酶基因sdsA的重組表達(dá)載體；將烷基型硫酸酯酶基因sdsA的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，選取陽(yáng)性克隆于培養(yǎng)基中培養(yǎng)；離心收集發(fā)酵后的大腸桿菌BL21細(xì)胞，重懸大腸桿菌BL21細(xì)胞于裂解緩沖液中，將裂解后的懸液離心，收集上清液，再與Ni-NTA Agarose混勻，純化。
文檔編號(hào)C12N15/70GK101942427SQ20101027451
公開(kāi)日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日
發(fā)明者徐洵, 阮靈偉, 龍夢(mèng)嫻 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所