專利名稱：利用可視薄膜感受器芯片檢測特異核苷酸序列的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種快速檢測和鑒定植物及其他機體中特異 核苷酸序列和單核苷酸多態(tài)性的方法。
背景技術(shù)：
在植物科學研究領(lǐng)域，能夠快速、準確的鑒定特異核苷酸序列非常必要。目前，在 基因組水平上鑒定物種和生態(tài)型以及追蹤遺傳模式已經(jīng)是常規(guī)的實驗方法。另外，海關(guān)和 政府的檢查員、作物育種者、商業(yè)食品加工部門經(jīng)常需要檢測植物商品中遺傳修飾作物和 病原體是否符合相應(yīng)的法規(guī)要求。對于植物商品的外源基因序列檢測的需求日益升高，為 了滿足這種需求，需要發(fā)明了一種應(yīng)用廣泛、價格低廉、高度特異性并且使用方便的測定方 法。目前已有的鑒定特異核苷酸序列和多態(tài)性的方法可以分為三大類1)以多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的檢測方法。PCR是一種廣泛使用的擴增特定 DNA序列的方法。用凝膠電泳技術(shù)可以顯示被擴增序列的存在，同時也可以確定DNA的數(shù) 量、大小、甚至序歹Ij (Chiueh et al.，2002 ；German et al.，2003 ；Gilliland et al.，1990 ； Hoist-Jensen et al.,2003 ；Miraglia et al. ,2004 ；Rogers and Parkes,1999 ；Su et al.，2003)。實時PCR是一種普遍用來定量檢測特異核苷酸片段的方法，使用熒光信號對擴 增產(chǎn)物進行實時定量。實時PCR技術(shù)要求特殊的熱循環(huán)儀和熒光探針，雖然快速靈敏，但價 格昂貴，并且容易產(chǎn)生假陽性信號(Baric and Dalla-via, 2004 ；Hernandez et al. ,2004 ； Shibata et al. ，1998 ;Stubner，2002)。2)以分子標記為基礎(chǔ)的檢測方法。采用DNA標記鑒定植物物種已經(jīng)成為一種常用 的方式(Andersen and Lilbberstedt，2003)。最常用的分子標記包括限制性片段長度多態(tài) 性(RFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)、簡單序列重復(fù)(SSR)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)。RFLP 技術(shù)是將樣本中的DNA消化后與探針進行雜交(Bai et al. ,2000 ；Cavallotti et al.， 2003 ；Yu et al. , 1995 ；Zhang et al.，1995)，包括限制性內(nèi)切酶消化、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、與 標記的探針雜交。這個方法得到的結(jié)果精確但費時費力。RAPD技術(shù)是對植物基因組進行隨 機PCR擴增，它需要進行大量的PCR實驗，并且隨著每個PCR反應(yīng)的具體實驗條件結(jié)果變化 差異很大(Bai et al. ,2000 ；Ilbi, 2003 ；Luo et al. ,2002) SSR 標記或者叫做微衛(wèi)星標 記是分散于整個基因組中獨特的串聯(lián)重復(fù)序列，可以用位于這些標記兩側(cè)的引物進行PCR 擴增(Cordeiro et al. ,2000 ；Edwards et al.，1998)。變性的 DNA 模板 SSR 區(qū)域的兩條 DNA鏈由于核苷酸組成的復(fù)雜度低其再聚合的傾向性高，在GenBank中可以查到相關(guān)物種 的SSR位點，或者通過基因組文庫搜索來設(shè)計SSR引物。SNP是由于等位基因中的單個核苷酸差異而引起的植物基因組的多樣性和自然變異(Maloof et al.，2001)。SNP普遍用于鑒別同一物種的不同品系和栽培種。例如，將兩 種主要的擬南芥生態(tài)型(Col和Ler)的基因組序列進行比較發(fā)現(xiàn)，平均每3. 3kb就會有一 個 SNP (即 125Mb 中的 SNP 總數(shù)超過 37, 000) (http //www, arabidopsis. org/cereon/)。比 較水稻的兩個主要亞種 indica 9311 (Yu et al. ,2005)和 japonica Nipponbare (IRGSP, 2005)發(fā)現(xiàn)，相同單位基因序列中的SNP標記數(shù)目是擬南芥的10倍。對于已建立的SNP技 術(shù)平臺的調(diào)查顯示，高通量的檢測技術(shù)(IrwaderTM and SNiPerTM)需要非常昂貴的儀器設(shè) 備投入(Mashima et al. ,2004 ；Pati et al.，2004)，而低通量的檢測技術(shù)，盡管不需要昂 貴的儀器但是費時費力?？梢暠∧じ惺芷餍酒且环N經(jīng)過特殊處理的硅晶片，其結(jié)構(gòu)可分為三層即直徑 10厘米的硅基質(zhì)為基底層；上面有一層475埃的氮化硅，構(gòu)成可視層；在可視層之上涂上便 于進行分子反應(yīng)的T型聚氨基堿性聚二甲基硅氧烷構(gòu)成反應(yīng)層?；讓雍涂梢晫訕?gòu)成薄膜 硅質(zhì)基片，涂上反應(yīng)層后它可以將分子反應(yīng)轉(zhuǎn)化為肉眼可見的信號，這個過程主要包括當 檢測物與反應(yīng)層分子發(fā)生相互作用時，物質(zhì)沉積在薄膜表面，產(chǎn)生酶催化反應(yīng)，通過可視層 改變反射光波長，最后導(dǎo)致膜表面可見的顏色變化，從而將分子反應(yīng)轉(zhuǎn)化為肉眼可見的信 號(Sandstrom, T.，Steinberg, Μ. &Nygren, H. (1985) Appl. Opt. 24，472-479.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用可視薄膜感受器芯片技術(shù)快速、準確、低廉的檢 測特異核苷酸序列和SNP標記(或點突變)的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案簡要地講，首先將特異序列的單鏈寡核苷酸作為捕捉探針通過 乙醛共價結(jié)合于胼衍生的感受器芯片表面；然后通過生物素標記的PCR產(chǎn)物與感受器表面 的捕捉探針雜交，可以鑒定特異的DNA序列，或者PCR產(chǎn)物與感受器表面的捕捉探針在生 物素標記的檢測探針和熱穩(wěn)定的連接酶的混合物中進行雜交反應(yīng)，可以鑒定位點突變序列 (如SNP位點)，只有目標序列與探針完全匹配的情況下生物素標記的檢測探針才能通過連 接酶作用共價結(jié)合于芯片的表面，即便是一個核苷酸不匹配也不可以；最后，將雜交后的芯 片與辣根過氧化物酶標記的生物素抗體溫育，再加入辣根過氧化物酶的底物，如果PCR產(chǎn) 物中存在特異性的目標序列，那么芯片的表面會有顏色的變化，金色變?yōu)樗{色或紫色，能夠 被人的裸眼所分辨。整個檢測過程在30分鐘內(nèi)即可完成。這項檢測技術(shù)具有準確、靈敏度 高和特異性強的特點，并且低通量和高通量可自由選擇，非常經(jīng)濟實惠。采用可視薄膜感受器芯片檢測特異核苷酸序列的原理如圖1所示，捕捉探針通過 5’端的乙醛基與芯片表面的胼基共價結(jié)合而固定于芯片上(見圖1A)，然后將生物素標記 的PCR片段與其進行雜交。其中一、檢測特異的基因或DNA片段時，需要合成正反向兩個引物并且將帶有正向鏈 序列的捕捉探針點在芯片表面。其中，反向引物的5’端帶有共價結(jié)合的生物素(參見表 1和圖1B)。捕捉探針的5’端帶有乙醛基團，從5’到3’依次是10-12個脫氧腺嘌呤殘基 (作為間隔)和35-50個的與PCR擴增子完全匹配的正向鏈序列，捕捉探針的5’端與芯片 表面共價結(jié)合(參見表1和圖1A)。用正反向兩個引物對待測樣品進行PCR擴增，靶DNA的 擴增產(chǎn)物中生物素標記的鏈與芯片表面的探針序列互補并特異性雜交，然后采用抗生物素 的抗體進行顯色反應(yīng)(參見圖1B)。反應(yīng)的產(chǎn)物沉淀于芯片上從而增加薄膜的厚度，由于薄膜厚度的改變使其表面的顏色發(fā)生變化，由金色變?yōu)樗{色或紫色，從而肉眼可進行辨別或 采用數(shù)字成像系統(tǒng)進行記錄。二、檢測SNP位點或點突變時，合成一對寡聚核苷酸作為Pl捕捉探針，通過5’端 與芯片表面共價結(jié)合(參見圖IA和圖1C)。這兩個Pl探針分別由10-12個堿基的間隔序 列和35-50個堿基的序列組成，該35-50個堿基的序列互補于靶基因中相關(guān)SNP位點(或 點突變位點)一側(cè)的DNA序列，它們的差別僅在于其3’末端核苷酸分別與該SNP (或點突 變)的不同等位基因相對應(yīng)。P2探針互補于該SNP(或點突變)位點另一側(cè)的相鄰序列，其 3’端有生物素標記，5’端帶有磷酸基。在雜交體系中加入熱穩(wěn)定的連接酶以便進行P1-P2 連接，在55-65°C條件下完成DNA雜交過程和連接反應(yīng)，反應(yīng)時間不超過20分鐘。用氫氧 化鈉進行嚴格洗滌以去除未連接的DNA分子，當Pl與靶DNA完全匹配時帶有生物素標記的 P2附著于芯片上，使用HRP標記的抗生物素IgG和可沉淀的底物進行檢測(參見圖1C)。具言之，本發(fā)明利用可視薄膜感受器芯片檢測特異DNA序列的方法包括如下步 驟1)將特異序列的單鏈寡核苷酸探針通過乙醛共價結(jié)合于胼衍生的可視薄膜感受 器芯片表面，該探針從5’到3’端依次是10-12個堿基的脫氧腺嘌呤殘基和35-50個堿基 的與特異DNA序列完全匹配的正向鏈序列；2) PCR擴增待測樣品的目標DNA序列，其中反向引物5’端帶有共價結(jié)合的生物 素；3)將變性后的PCR產(chǎn)物與芯片進行雜交，洗滌；4)芯片與辣根過氧化物酶(HRP)標記的生物素抗體雜交，洗滌；5)在芯片上加辣根過氧化物酶的底物進行反應(yīng)，如與四甲基聯(lián)苯胺室溫反應(yīng) 5min，然后水洗，干燥，觀察結(jié)果，芯片表面從金色變?yōu)樗{色或紫色表明樣品中含有該特異 DNA序列。上述步驟1)具體又可通過下列步驟實現(xiàn)1-1)利用旋轉(zhuǎn)涂布方式在構(gòu)成可視薄膜感受器芯片的薄膜硅質(zhì)基片表面涂布 145埃T型聚氨基堿性聚二甲基硅氧烷，然后將含有聚(苯丙氨酸-賴氨酸)的芯片在含 1-10 μ M的琥珀酰亞氨基煙酸沙星的ΡΗ8. 2的0. IM硼酸鈉溶液中處理2小時，去離子水洗 干凈，備用；1-2)合成捕捉探針，該探針從5’到3’端依次是10-12個堿基的脫氧腺嘌呤殘基和 35-50個堿基的與特異DNA序列完全匹配的正向鏈序列，并用乙醛基團修飾探針的5’端；1-3)將5’端帶有乙醛基團的探針稀釋為不同濃度，取l_200nl點樣至芯片上，室 溫反應(yīng)2小時后用去離子水浸洗，60°C浸于0. SDS中2小時，水洗，干燥。上述步驟3)雜交液為5 X SSC (1 X SSC溶液含有檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7 · 2H20) 2. 2 克，氯化鈉4. 4克，定容至500毫升蒸餾水)和5mg/ml酸解酪蛋白溶液，45°C雜交10-15分 鐘，在這個過程中目標PCR擴增子中生物素標記的反向鏈通過堿基配對與捕捉探針結(jié)合， 然后用0. IXSSC溶液室溫洗滌芯片以去除非特異性的結(jié)合。上述步驟4)雜交液為5XSSC、5mg/ml酸解酪蛋白及10%甘油溶液，在雜交液中 18-25°C溫育5min后用0. 1 X SSC溶液室溫洗滌芯片，其中HRP標記的生物素抗體通常是抗 生物素的IgG。
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本發(fā)明利用可視薄膜感受器芯片檢測特異DNA位點(SNP位點或點突變)的方法 包括如下步驟1)將一對特異序列的單鏈寡核苷酸捕捉探針Pl通過乙醛共價結(jié)合于胼衍生的可 視薄膜感受器芯片表面的不同點樣點，所述Pl探針從5’到3’端依次是10-12個堿基的脫 氧腺嘌呤殘基和35-50個堿基組成的序列，兩個Pl探針的3’末端堿基分別與SNP或點突 變的不同等位基因相對應(yīng)，其余的34-49個堿基組成的序列互補于靶基因中相關(guān)SNP或點 突變位點一側(cè)的相鄰序列；2)合成一個P2探針，P2探針互補于SNP或點突變位點另一側(cè)的相鄰序列，其3’ 端有生物素標記，5’端帶有磷酸基；3) PCR擴增待測樣品的目標DNA序列；4)在共價結(jié)合了 Pl探針的芯片上加P2探針和變性后的PCR產(chǎn)物，在熱穩(wěn)定連接 酶的存在下同時進行DNA雜交反應(yīng)和P1-P2連接反應(yīng)；5)用0. OlM的NaOH 60°C嚴格洗滌芯片，然后用0. 1 X SSC溶液室溫洗滌芯片；6)芯片與辣根過氧化物酶標記的生物素抗體雜交，洗滌；7)在芯片上加辣根過氧化物酶的底物進行反應(yīng)，水洗，干燥后觀察結(jié)果，芯片表面 從金色變?yōu)樗{色或紫色表明該點樣點的Pl探針與樣品的SNP位點或點突變相匹配。上述步驟1)具體又可通過下列步驟實現(xiàn)1-1)利用旋轉(zhuǎn)涂布方式在構(gòu)成可視薄膜感受器芯片的薄膜硅質(zhì)基片表面涂布 145埃T型聚氨基堿性聚二甲基硅氧烷，然后將含有聚(苯丙氨酸-賴氨酸)的芯片在含 1-10 μ M的琥珀酰亞氨基煙酸沙星的ΡΗ8. 2的0. IM硼酸鈉溶液中處理2小時，去離子水洗 干凈，備用；1-2)合成一對捕捉探針Ρ1，從5’到3’端依次是10_12個堿基的脫氧腺嘌呤殘基 和35-50個堿基組成的序列，兩個Pl探針的3’末端堿基分別與SNP或點突變的不同等位 基因相對應(yīng)，其余的34-49個堿基組成的序列與靶基因中相關(guān)SNP或點突變位點一側(cè)的相 鄰序列互補，用乙醛基團修飾Pl探針的5’端；1-3)將5’端帶有乙醛基團的一對Pl探針稀釋為不同濃度，分別取l_200nl點樣 至芯片上的不同位置處，室溫反應(yīng)2小時后用去離子水浸洗，60°C浸于0. 1 % SDS中2小時， 水洗，干燥。上述步驟4)先在芯片上加P2探針和變異Ampligase，在含20mM Tris-HCl, pH 8. 3,25mM KCl, IOmM MgCl2,0. 5mM 煙酰胺腺苷酸二核苷酸，0. 01 % Triton X-100 和 5mg/ml 酸解酪蛋白的連接反應(yīng)體系中55-65 °C預(yù)熱，然后加入變性后的PCR產(chǎn)物，于55-65°C同時 進行DNA雜交反應(yīng)和P1-P2連接反應(yīng)。上述步驟6)雜交液為5XSSC、5mg/ml酸解酪蛋白及10%甘油溶液，在雜交液中 18-25°C溫育5min后用0. 1 X SSC溶液室溫洗滌芯片，其中HRP標記的生物素抗體通常是抗 生物素的IgG。本發(fā)明利用可視薄膜感受器芯片技術(shù)檢測植物或其他機體基因組的特異核苷酸 序列和分子標記，具有下列優(yōu)點 可以替代其它檢測特異核苷酸序列的方法，包括實時PCR:此方法的特點是快速、靈敏，但是價格昂貴，要求特定的熱循環(huán)儀和特定的熒光探針，并且易于產(chǎn)生假陽性信號；限制性片段長度多態(tài)性此方法冗長費時；隨機擴增多態(tài)性DNA 要求大量PCR擴增工作，并且對實驗條件敏感，重復(fù)性差；簡 單序列重復(fù)易于造成錯誤信息；單核苷酸多態(tài)性需要采用昂貴的儀器進行高通量的分析，或不采用昂貴的儀器 但是比較費時費力；微陣列技術(shù)要求昂貴的儀器和訓練有素的技術(shù)人員。 結(jié)果可肉眼看見 方法快速、強大、靈敏度高、特異性高 不需要昂貴的儀器投資，此方法可應(yīng)用于任何可進行基本的PCR操作的分子生 物實驗室 靈敏度比凝膠電泳高1000倍以上。這項技術(shù)可針對任何核苷酸序列的檢測進行定制，可以廣泛應(yīng)用于作物育種、性 狀基因測序、谷物和食品及環(huán)境中的病源微生物檢測、轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的鑒定、外來植 物物種入侵和植物疫情的快速檢測及生物物種資源的快速檢測等任何需要進行特異核苷 酸序列鑒定的工作中。具體說來，其應(yīng)用領(lǐng)域包括快速、經(jīng)濟的檢測和鑒定 特異的單核苷酸對 用于快速的植物后代基因分型 商品化食品樣品中的植物轉(zhuǎn)基因的存在 檢測植物的交叉授粉 檢測植物疫情眷植物物種資源 食品和環(huán)境中的病原體的存在 任何有機體的基因突變 轉(zhuǎn)基因動物中轉(zhuǎn)基因的存在總之，本發(fā)明提供了一種利用可視薄膜感受器芯片檢測有機體或環(huán)境中特異核苷 酸序列的新方法，該方法的突出優(yōu)點是采用了可視薄膜感受器芯片，使得實驗結(jié)果肉眼可 見。同時，該方法快速、易用、高通量、靈敏度高、特異性強、應(yīng)用廣泛，并且與已存在的實驗 方法相比價格低廉，無需昂貴的設(shè)施和儀器，可以廣泛用于可進行普通PCR實驗的實驗室。 這項技術(shù)首先可應(yīng)用于遺傳修飾植物，也可用于動物和微生物的檢測。對于普遍的植物基 因探針，完全選擇性的靈敏度可達10_15M?？梢远ㄖ菩酒糜趶囊焉虡I(yè)化的遺傳修飾植物中 檢測轉(zhuǎn)基因標記，芯片上信號的強弱與特定基因標記的濃度相關(guān)。這項技術(shù)可以在干擾核 酸濃度高于靶核酸100倍的混合物體系中精確檢測出靶核酸序列。


圖1是采用可視薄膜感受器芯片檢測特異核苷酸序列的原理示意圖。其中A示意了捕捉探針通過5’端的乙醛基與芯片表面的胼基共價結(jié)合而固定于芯片 上；
B示意了用可視薄膜感受器芯片檢測遺傳修飾作物的原理，進行PCR反應(yīng)的反向 引物的5’端標記有生物素，擴增產(chǎn)物中一條生物素標記的鏈與芯片表面的探針序列互補并 特異性雜交，然后采用抗生物素的抗體進行顯色反應(yīng)；C示意了利用可視薄膜感受器芯片進行SNP檢測的原理。圖2顯示了用可視薄膜感受器芯片檢測遺傳修飾作物中的轉(zhuǎn)基因的特異性和敏 感性。其中A顯示了用手工進行不同濃度的捕捉探針點樣時檢測的特異性和敏感性。Iectic 基因和CaMV35S啟動子的捕捉探針(濃度分別為0. 001，0. 01，0. 1，1 μ M，分別手工點樣 200nl于芯片表面上(左欄)。CaMV35S啟動子的PCR產(chǎn)物(濃度分別為100 μ 1的反應(yīng)體 系中含0，0· 1，1，10和IOOfmol)分別加樣于五個同樣的芯片上(右欄)。B顯示了計算機控制的移液器進行捕捉探針點樣時檢測的特異性和敏感性。每 個點點樣40nl的Ι.ΟμΜ探針溶液。捕捉探針的點樣順序顯示在左欄，其中Μ是生物 素-dA20，正對照標記；點1-4是內(nèi)源基因=LLectin凝集素(大豆)；2. Ivrl(玉米)； 3. Accg8 (油菜)；4. Sadl (棉花)；點5-8是篩選標記5. CaMV35S promoter,花椰菜花葉病 毒的35S啟動子；6. NOS terminator ；胭脂堿合成酶基因終止子；7. nptll，新霉素-3，-磷 酸轉(zhuǎn)移酶基因；8.⑶S gene ；點9_12是鑒定標記9. CrylAb，蘇云金芽孢桿菌殺蟲毒蛋白 cryIAbB)基因；10. CrylAc，蘇云金芽孢桿菌殺蟲毒蛋白cryAc基因；11. BAR (pat)草丁膦 乙酰轉(zhuǎn)移酶基因；12. cp4-印sps，農(nóng)桿菌CP4的5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因。Accg8 PCR 擴增子(濃度分別每IOOul反應(yīng)體系含0，0. l，l，10，100fmol)用于5個同樣的芯片上。圖3顯示了用可視薄膜感受器芯片對遺傳修飾作物進行檢測的結(jié)果。其中A是遺傳修飾作物種子中的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源基因的PCR產(chǎn)物的凝膠電泳檢測圖；B是PCR產(chǎn)物的混合物與芯片進行雜交，對遺傳修飾作物的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源基因進 行檢測的結(jié)果照片。圖4顯示了用可視薄膜感受器芯片對水稻、擬南芥、番茄中的SNP標記進行檢測的 結(jié)果。其中A顯示了四個SNP捕捉探針的點樣位置(左欄)和不同水稻(indica and japonica)的SNP檢測結(jié)果代表圖(右欄)；B顯示了兩個生態(tài)型特異的SNP(1_4)和COPl基因的兩個點突變(5_8)的捕捉 探針的點樣位置(左欄)，以及Col，Ler，copl-4，copl-6的PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果代表圖(右 欄)；C顯示了番茄育種圖中的兩個母本和六個F2子代的SNP基因分型圖。圖5顯示了樣品中的特異SNP分子的豐度與芯片檢測信號強度的相關(guān)性。其中上部為芯片檢測結(jié)果圖，下部為定量圖，當兩種SNP的比例范圍小于1000時，信號 與兩種PCR產(chǎn)物的相對量成比例關(guān)系。圖6是用可視薄膜感受器芯片SNP技術(shù)對一個新的突變進行染色體作圖的示意 圖。以擬南芥2號染色體下部的COPl位點為例，其中A收集突變體分離的F2代群體并進行作圖過程的說明。F2代群體匯集為一個池， 提取DNA，進行基因組范圍的SNP標記分離分析。
B擬南芥Col-和Ler-生態(tài)型2號染色體中特異的SNP頻率。SNP標記在靠近COPl 位點時，會偏向產(chǎn)生原始突變的親本。
具體實施例方式下面通過具體實驗及其結(jié)果進一步說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。材料與方法1.可視薄膜感受器芯片的設(shè)計和制作可視薄膜感受器芯片的薄膜硅質(zhì)基片購自Inverness Medical-Biostar, Louiville,C0. USA，是直徑10厘米、表面覆蓋475埃氮化硅的晶片。利用旋轉(zhuǎn)涂布方式在晶 片表面涂布145埃T型聚氨基堿性聚二甲基硅氧烷，此層吸收了聚(苯丙氨酸-賴氨酸)。 將含有聚(苯丙氨酸-賴氨酸)的晶片在25毫升含1-10 μ M的琥珀酰亞氨基煙酸沙星的 0. IM硼酸鈉(ρΗ8. 2)中處理2小時，去離子水洗干凈，備用。在寡核苷酸的5’端合成乙醛 亞磷酸胺。用0. IM硼酸鈉(ρΗ7. 8)將乙醛標記的寡核苷酸稀釋為不同濃度，取l_200nl點 樣至晶片上。室溫(20-25°C)反應(yīng)2小時后，用去離子水浸洗晶片，60°C浸于0. SDS中 2小時，水洗，干燥。制備好的芯片可以在室溫保存6個月。在本發(fā)明的具體實驗中，對于檢測遺傳修飾作物(GMO)中的特異核苷酸序列，在 GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索序列來設(shè)計PCR引物和捕捉探針。PCR引物來自于四個轉(zhuǎn)基因作物 大豆、玉米、油菜籽、棉花，序列如表1所示。反向引物的5’端標記有生物素用來顯示結(jié)果。 捕捉探針的5’端有乙醛基團修飾，可以與薄膜上的胼基團反應(yīng)，從而將捕捉探針固定于芯 片上，以10個脫氧腺嘌呤為間隔，與互補于靶序列的40個核苷酸成為一條鏈。寡核苷酸由 Invitrogen (USA)合成。表1. GMO檢測中所用PCR引物和捕捉探針的寡核苷酸序列
權(quán)利要求
一種利用可視薄膜感受器芯片檢測特異DNA序列的方法，包括以下步驟1)將特異序列的單鏈寡核苷酸探針通過乙醛共價結(jié)合于肼衍生的可視薄膜感受器芯片表面，該探針從5’到3’端依次是10 12個堿基的脫氧腺嘌呤殘基和35 50個堿基的與特異DNA序列完全匹配的正向鏈序列；2)PCR擴增待測樣品的目標DNA序列，其中反向引物5’端帶有共價結(jié)合的生物素；3)將變性后的PCR產(chǎn)物與芯片進行雜交，洗滌；4)芯片與辣根過氧化物酶標記的生物素抗體雜交，洗滌；5)在芯片上加辣根過氧化物酶的底物進行反應(yīng)，水洗，干燥后觀察結(jié)果，芯片表面從金色變?yōu)樗{色或紫色表明樣品中含有該特異DNA序列。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測特異DNA序列的方法，其特征在于，所述步驟1)具體通過 下列步驟實現(xiàn)1-1)利用旋轉(zhuǎn)涂布方式在構(gòu)成可視薄膜感受器芯片的薄膜硅質(zhì)基片表面涂布145埃 T型聚氨基堿性聚二甲基硅氧烷，然后將含有聚(苯丙氨酸-賴氨酸)的芯片在含1-10 μ M 的琥珀酰亞氨基煙酸沙星的ΡΗ8. 2的0. IM硼酸鈉溶液中處理2小時，去離子水洗干凈，備 用；1-2)合成探針，該探針從5’到3’端依次是10-12個堿基的脫氧腺嘌呤殘基和35-50 個堿基的與特異DNA序列完全匹配的正向鏈序列，并用乙醛基團修飾探針的5’端；1-3)將5’端帶有乙醛基團的探針稀釋為不同濃度，取l_200nl點樣至芯片上，室溫反 應(yīng)2小時后用去離子水浸洗，60°C浸于0. 1% SDS中2小時，水洗，干燥。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測特異DNA序列的方法，其特征在于，所述步驟3)雜交液為 5 X SSC和5mg/ml酸解酪蛋白溶液，45°C雜交10-15分鐘后用0. 1 X SSC溶液室溫洗滌芯片。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測特異DNA序列的方法，其特征在于，所述步驟4)雜交液為 5XSSC、5mg/ml酸解酪蛋白及10%甘油溶液，在雜交液中18_25°C溫育5min后用0. IXSSC 溶液室溫洗滌芯片。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測特異DNA序列的方法，其特征在于，所述步驟5)所用的辣 根過氧化物酶的底物為四甲基聯(lián)苯胺，室溫反應(yīng)5min。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用可視薄膜感受器芯片技術(shù)檢測特異核苷酸序列和SNP標記(或點突變)的方法。將特異序列的單鏈寡核苷酸作為捕捉探針通過乙醛共價結(jié)合于肼衍生的感受器芯片表面；然后通過生物素標記的PCR產(chǎn)物與捕捉探針雜交，可以鑒定特異的DNA序列，或者捕捉探針、在生物素標記的檢測探針和PCR產(chǎn)物同時進行雜交和連接反應(yīng)，可以鑒定位點突變序列(如SNP位點)；最后將芯片與辣根過氧化物酶標記的生物素抗體溫育，加底物顯色，如果PCR產(chǎn)物中存在特異目標序列，那么芯片的表面會有肉眼可辨的顏色變化，金色變?yōu)樗{色或紫色。這項檢測技術(shù)快速、準確、低廉、靈敏度高、特異性強，并且低通量和高通量可自由選擇，非常經(jīng)濟實惠。
文檔編號C12Q1/68GK101942516SQ20101027593
公開日2011年1月12日 申請日期2007年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月28日
發(fā)明者白淑蘭, 鄧興旺, 鐘曉波, 魏寧 申請人:鄧興旺