專利名稱：用于向下調節(jié)促炎標記物的組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物包括獲自Boswellia(乳香樹)物種的乳香酸 (Boswellic acid)成分(部分，fraction)和多糖成分。該組合物在呈現(xiàn)增強的生物活性， 特別是向下調節(jié)(下調)促炎標記物方面是協(xié)同的。本發(fā)明還涉及多糖成分單獨或與乳香酸成分組合(聯(lián)合)在抑制PGE2中的應用。
背景技術：
在沒有免疫系統(tǒng)的準確調節(jié)的情況下，存活是不可能的。促炎細胞因子的產生是在發(fā)育、組織再生、愈合、創(chuàng)傷或感染過程中協(xié)同免疫和代謝反應的關鍵生理過程并且是保護我們的身體免于出血、局部缺血、癌癥和膿毒癥的關鍵生理進程。促炎細胞因子，如白介素(IL)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)的受控產生激發(fā)有益的炎性反應，所述炎性反應促使局部凝血以限制感染和組織損傷(Ulloaand Tracey，20(^)。然而，這些細胞因子的不受限制的產生比初始損傷更加危險，并且它是導致人類發(fā)病率和死亡率的主要原因之一。這種過程的一個最顯著的實例是“嚴重膿毒癥”，是重病護理病區(qū)中死亡的重要原因和發(fā)達社會中死亡的主要原因之一(Martin et al.，2003)。嚴重膿毒癥的特征在于過量產生促炎細胞因子，其誘發(fā)系統(tǒng)性炎癥、新血管功能障礙和致命性多器官衰竭(Van der Poll andLowry, 1995 ；Hotchkiss and Karl, 2003 ；Rice and Bernard, 2005) 這種效應通過研究來闡明， 所述研究表明中和促炎細胞因子(單克隆抗-TNF抗體和IL-I受體拮抗劑)已證實在炎性病癥如類風濕性關節(jié)炎、克羅恩病、強直性脊柱炎和牛皮癬方面是成功的(Feldmarm，2002 ； Ulloa and Tracey,2005 ；Rutgeerts et al. ,2006 ；Ulloa andMessmer,2006)。除細胞因子以外，其他的介體如組胺、前列腺素類、白細胞三烯(白三烯)、緩激肽等在炎癥中也發(fā)揮作用。因此，它們用作標記物并可用于診斷疾病病癥，尤其是它們以升高水平存在的那些病癥。因此，調節(jié)標記物以精確控制免疫系統(tǒng)是必要的。齒葉乳香樹(Boswelliaserrata) (N. 0. Burseraceae)的樹膠脂(稱為“Dhup，，)、 印度藍丹andian Frankincense)或印度乳香Qndianolibanum)用于宗教儀式和香料應用中已有悠久的歷史。在Ayurvedic傳統(tǒng)中長久已知的印度藍丹的保健應用已經(jīng)成為西方世界的焦點，過去三十年間，導致樹膠脂滲出物的標準化提取物的廣泛應用。這樣的提取物被用作膳食補充劑(飲食補充劑，dietarysupplements)和化妝品中的成分以支持(維持) 健康性老化。膳食補充劑中的最普遍應用是關節(jié)健康支持產品以支持正常的關節(jié)功能和活動。近來的科學證據(jù)越來越多地支持齒葉乳香樹的保健效應。典型地，齒葉乳香樹的樹膠含油樹脂提取物被報道含有類倍半萜烯精油(8-12% w/w)、多糖05-60% w/w)、和高級類萜05-35% w/w)。樹膠脂提取物中的生物標記物成分是稱為乳香酸的一組五環(huán)三萜烯化合物。
乳香酸已表明可抑制酶5-脂肪氧合酶，這種酶催化由花生四烯酸形成促炎白細胞三烯。除了該機制之外，乳香酸還可降低酶，人白細胞彈性蛋白酶(HLE)的活性。這種雙重作用是乳香酸獨有的(Safayhi，H et al.，1997)。由于在多種炎癥和基于超敏性人類疾病中通過中性粒細胞刺激來同時提高白細胞三烯的形成和HLE釋放，因此通常認為通過乳香酸進行的兩種促炎酶的已報道的阻斷和它們對補體蛋白質的有利效果以及肥大細胞的穩(wěn)定化活性可能是Boswellia提取物的保健效應的基本原理，其在多次臨床前和臨床研究中被證明。齒葉乳香樹樹膠脂的提取物的特性一般為樹脂性的，并且生物標記物乳香酸 (親脂性化合物)不溶于水。US2003/0186932描述了一種分離自齒葉乳香樹的樹膠脂提取物中的水溶性生物活性成分。其進一步披露了該成分與乳香酸以等比率(1 1)的組合對于抗關節(jié)炎活性表現(xiàn)出加性效應而不是協(xié)同效應。US7582314描述了一種通過給予包含乳香酸和元素硒的組合物來治療牛皮蘚影響的個體的方法。US20080275117描述了一種通過以大于65%的量使用包含乳香酸和/或它們的乙酸酯的組合物來治療關節(jié)炎的方法。該組合物還聲稱進一步包括多糖和乙酸正辛酯、因香酚(incensole)、因香酚醋酸酯(incensole acetate)、里哪醇、莰醇(龍腦)、莰烯、欖香烯、 石竹烯、因香酚氧化物(incensole oxide)、氧化因香酚醋酸酯(incensoleoxide acetate) 或它們的組合。本發(fā)明包括一種組合物，該組合物包含獲自Boswellia物種的乳香酸成分和多糖成分，在向下調節(jié)(下調)/抑制促炎標記物中表現(xiàn)出增強作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物包含獲自Boswellia物種的乳香酸(Boswellic acid)成分和多糖成分，用于向下調節(jié)(下調)促炎標記物如TNF-α、IL_li3、氧化一氮(一氧化一氮，nitric oxide) ,IFN-γ和LTB4。乳香酸成分以約60%的濃度存在，而多糖成分以約40%的濃度存在。與單獨的成分相比，包含乳香酸成分和多糖成分的組合物表現(xiàn)出其活性的增強。本發(fā)明進一步涉及多糖成分單獨或與乳香酸成分組合在抑制PGE2中的應用。


圖1 獲自Boswellia物種的多劑量乳香酸成分對來自處理的kilb/c小鼠的血漿中胞外的體內TNF-a和IL-I β測定(評估)的影響。圖2 獲自Boswellia物種的多劑量多糖成分對來自處理的kilb/c小鼠的血漿中胞外的體內TNF-α和IL-I β測定的影響。圖3 多劑量的組合物對來自處理的balb/c小鼠血漿中胞外的體內TNF-a和 IL-I β測定的影響。圖4 獲自Boswellia物種的多劑量乳香酸成分對來自處理的kilb/c小鼠血漿中胞外的體內NO測定的影響。圖5 獲自Boswellia物種的多劑量多糖成分對來自處理的kilb/c小鼠血漿中胞外的體內NO測定的影響。圖6 多劑量組合物對來自處理的balb/c小鼠血漿中胞外的體內NO測定的影響。圖7:乳香酸成分、多糖成分和組合物在大鼠(注射的爪)中結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculli)誘導的炎性關節(jié)炎中的比較抗關節(jié)炎活性(預防性)。圖8 在以分級的劑量水平用乳香酸成分、多糖成分和組合物處理的大鼠中，來自結核分枝桿菌誘導的炎性關節(jié)炎中關節(jié)炎爪的組織勻漿的上清液中TNF-α的表達。圖9 在以分級的劑量水平用乳香酸成分、多糖成分和組合物處理的大鼠中，來自結核分枝桿菌誘導的炎性關節(jié)炎中關節(jié)炎爪的組織勻漿的上清液中PGE2的表達。圖10 在以分級的劑量水平用乳香酸成分、多糖成分和組合物處理的大鼠中，來自結核分枝桿菌誘導的炎性關節(jié)炎中關節(jié)炎爪的組織勻漿的上清液中LTB4的表達。圖11 乳香酸成分、多糖成分和組合物對結核分枝桿菌誘導的炎性關節(jié)炎動物的脾細胞中通過流式細胞術的胞內IFN-Y表達的影響。圖12 乳香酸成分、多糖成分和組合物(有效劑量)在大鼠(注射的爪)中結核分枝桿菌誘導的確定的炎性關節(jié)炎中的抗關節(jié)炎活性(治療性)。圖13 示出了乳香酸成分和本發(fā)明的組合物的水溶性的比較。圖14 示出制備本發(fā)明的組合物的步驟的流程圖。
具體實施例方式本發(fā)明涉及一種協(xié)同組合物(增效組合物)，其包含約60%濃度的乳香酸成分和約40%濃度的多糖成分、可選地連同藥用賦形劑。在本發(fā)明的另一種實施方式中，乳香酸成分和多糖成分獲自Boswellia物種。在本發(fā)明的又一種實施方式中，乳香酸成分包括β -乳香酸、乙酰基-β -乳香酸、 11-酮- β -乳香酸和乙?；?11-酮- β -乳香酸。在本發(fā)明的又一種實施方式中，多糖成分包括半乳糖、阿拉伯糖、D-葡糖醛酸和 4-0-甲基-葡糖醛酸阿拉伯糖基-半乳聚糖G-O-methyl-glucuronoarabino-galactan)。在本發(fā)明的又一種實施方式中，藥用賦形劑選自包括抗粘附劑、粘合劑、涂布劑、 崩解劑、填充劑和稀釋劑、調味劑(芳香劑)、著色劑、助流劑、潤滑劑、防腐齊 、吸附齊 、甜味劑以及它們的組合的組。在本發(fā)明的又一種實施方式中，該組合物被配制成選自包括液體、錠劑、糖錠、粉劑、顆粒、膠囊、片劑、貼劑、凝膠、乳液、膏劑、洗劑、牙膏(dentrifice)、滴劑、混懸液、糖漿、 酏劑、植物劑(phyotceuticals)和營養(yǎng)劑(neutraceuticals)的組中的劑型。本發(fā)明還涉及一種用于制備協(xié)同組合物的方法，該組合物包含濃度為約60%的乳香酸成分和濃度為約40%的多糖成分，可選地具有藥用賦形劑，所述方法包括以下步驟-由BoswelIia物種獲得乳香酸成分和多糖成分；-合并濃度為約60%的乳香酸成分和濃度為約40%的多糖成分，可選地連同藥用賦形劑，以獲得該組合物。在本發(fā)明的又一種實施方式中，乳香酸成分包括β -乳香酸、乙?；?β -乳香酸、 11-酮- β -乳香酸和乙?；?11-酮- β -乳香酸。在本發(fā)明的又一種實施方式中，多糖成分包括半乳糖、阿拉伯糖、D-葡糖醛酸和4-0-甲基-葡糖醛酸阿拉伯糖基(glucuronoarabino)-半乳聚糖。本發(fā)明涉及一種用于向下調節(jié)/抑制促炎標記物的方法，所述方法包括給予需要其的受試者組合物的步驟，該組合物包含濃度為約60%的乳香酸成分和濃度為約40%的多糖成分，可選地連同藥用賦形劑。在本發(fā)明的又一種實施方式中，乳香酸成分和多糖成分獲自Boswellia物種。在本發(fā)明的又一種實施方式中，受試者是動物，包括人類。在本發(fā)明的又一種實施方式中，促炎標記物選自包括TNF-α、IL-I β、IFN-γ、氧化一氮和LTB4的組。本發(fā)明涉及一種用于向下調節(jié)/抑制PGE2的方法，所述方法包括給予需要其的受試者組合物的步驟，該組合物包含單獨的多糖成分或與乳香酸成分的組合，可選地連同藥用賦形劑。在本發(fā)明的又一種實施方式中，乳香酸成分和多糖成分獲自Boswellia物種。在本發(fā)明的又一種實施方式中，受試者是動物，包括人類。本發(fā)明還涉及一種膳食補充劑，其單獨或組合包含上面提及的組合物。本發(fā)明相對于現(xiàn)有的傳統(tǒng)Boswellia提取物表現(xiàn)出改善，為制造商提供了更大的水溶性形式，其具有增強的關節(jié)健康支持潛力。該組合物賦予活性成分獨特的釋放分布。除乳香酸以外，(Boswellia提取物常規(guī)標準化的有效組分)，來自齒葉乳香樹的樹膠脂的多糖成分也具有生物活性并且是水溶性的。多糖成分增強了提取物中乳香酸的保健(衛(wèi)生) 作用，如體外和體內研究所揭示的，其水平超過僅為加性的期望值。包含獲自Boswellia物種的乳香酸成分和多糖成分的組合物表現(xiàn)出促炎標記物的向下調節(jié)。與組合物的單獨組分相比，該組合物在向下調節(jié)促炎細胞因子或介體中表現(xiàn)出增強的活性，因而具有增效(協(xié)同)特性。Boswellia物種的多糖成分是水溶活性的并因此提高乳香酸的溶解性(圖13)，降低較高濃度下乳香酸的毒性并允許持續(xù)的抗炎作用。用乙醇提取BoswelIia樹膠，并用酸-堿接著通過水洗來處理乙醇提取物以給出乳香酸成分。棄除在該過程中獲得的己烷殘留物(油成分(油部分))。在用乙醇提取 Boswellia樹膠后剩余的殘渣用蒸餾水提取并用醇沉淀以獲得多糖成分。將乳香酸成分和多糖成分分別以約60%和40%的濃度合并以獲得本發(fā)明的組合物(圖14)。乳香酸成分包括β-乳香酸、乙?；?β-乳香酸、11-酮-β-乳香酸和乙?；?11-酮-β -乳香酸。多糖成分包括半乳糖、阿拉伯糖、D-葡糖醛酸和4-0-甲基-葡糖醛酸阿拉伯糖基(glucuronoarabino) -半乳聚糖。該組合物可以可選地包含藥用賦形劑，其選自包括抗粘附劑、粘合劑、涂布劑、崩解劑、填充劑和稀釋劑、調味劑、著色劑、助流劑、潤滑劑、防腐劑、吸附劑、甜味劑以及它們的組合的組。本發(fā)明的組合物被配制成選自包括液體、錠劑、糖錠、粉劑、顆粒、膠囊、片劑、貼劑、凝膠、乳液、膏劑、洗劑、牙膏、滴劑、混懸液、糖漿、酏劑、植物劑和營養(yǎng)劑的組中的劑型。測試該組合物抑制/向下調節(jié)/減少促炎標記物如TNF- α、IL-I β、氧化一氮、 IFN- y、PGE2和LTB4水平的潛力。TNF- α (腫瘤壞死因子-α )是參與系統(tǒng)性炎癥并刺激急性階段反應的細胞因子。 TNF產生的調節(jié)關系到各種人類疾病、以及癌癥。其在LPS誘導的敗血性休克的發(fā)病機制中起到非常重要的作用。IL-I β是最有效的促炎細胞因子之一，其參與生理性免疫反應和各種免疫病理性障礙的發(fā)展。檢測IL-I β的水平可用于監(jiān)測和診斷各種疾病，包括炎癥、免疫疾病和骨病。氧化一氮合適水平的氧化一氮產生在保護器官如肝臟免受局部缺血損害方面是重要的。然而，持續(xù)水平的NO產生導致直接組織毒性并促進與敗血性休克相關的血管塌陷 (血管萎陷)。NO的慢性表達與各種癌和炎性病癥包括小兒糖尿病、多發(fā)性硬化、關節(jié)炎和潰瘍性結腸炎相關。通過向下調節(jié)/減少細胞因子或其它介體，該組合物發(fā)現(xiàn)可有效用于各種疾病/ 障礙(表現(xiàn)出升高水平的這些細胞因子或其他介體)如關節(jié)炎、潰瘍性結腸炎、炎性腸綜合癥、哮喘(呼吸障礙)等的管理。借助于以下實施例將更進一步詳細地描述本發(fā)明。然而，這些實施例不應被解釋成限制本發(fā)明的范圍。實施例1 生物活性評估急性安全性研究急性口服毒性研究在小鼠中按照OECD指導原則No. 423 [經(jīng)濟合作與發(fā)展組織。關于化學測試的OECD指導原則。指導原則423，急性口服毒性-急性毒性分類方法，米用，1996 年 3 月 22 日(Organization for Economic Cooperation and Development. OECDguidelines for testing of chemicals. Guideline 423, acute oral toxicity-acute toxic class method, adopted, March 22，1996) ]?！? 白勺 24/j、^t 內周期性地單獨觀察動物，其中在最初的4小時內特別注意，并且之后每日一次，同時觀察總共14天?？诜o予各組雌性小鼠的2000mg/kg的口服(p. o.)單一劑量組合物在這些測試動物的總體一般性行為方面并沒有表現(xiàn)出任何變化。還評估了 5000mg/kg的口服(ρ. ο.) 單一劑量。當與載體對照組的實驗動物相比時，以這種高口服劑量并沒有觀察到死亡或正常行為的任何變化。體外研究實施例1 鼠中性粒細胞中胞內的體外TNF- α測定對測試材料進行體外研究，由此，進行流式細胞計數(shù)研究以確定多劑量乳香酸成分、多糖成分和本發(fā)明的組合物對從全血中通過histopaque梯度分離的鼠中性粒細胞中胞內TNF-α細胞因子表達的影響。用LPS刺激細胞并在(X)2恒溫箱中用測試材料以梯度濃度(μ g/ml)溫育細胞3 小時。將滲透性溶液(permeabilising solution)加入到細胞中，然后對其溫育10分鐘。 然后用結合的抗-小鼠TNF-α單克隆抗體標記細胞并在黑暗下進行另外的30分鐘的溫育。在用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗后，直接在BD-CantoII流式細胞儀(Beckton-Dickinson Biosciences,CA,USA)上獲取樣品。熒光激發(fā)器(fluorescence trigger)設置為門控中性粒細胞群的FLl參數(shù)(10，000個事件)并且熒光補償、數(shù)據(jù)分析和數(shù)據(jù)顯示使用CellQuest Pro 軟件進行[Clara, B. , R. C. Arancha, G.M.Andre ‘ s, P. Atanasio, A. Julia, and 0. Alberto. 2003. A new method for detectingTNF-α -secreting cells using direct immunofluorescence surfacemembrane stainings. J. Immuno. Methods 264 :77-87.] [Khurshid A. Bhat, Bhahwal A. Shah, Kuldeep K. Gupta, Anjali Pandey, Sarang Bani,Subhash C. Taneja. Semi-synthetic analogs of pinitol as potential inhibitors of TNF-a cytokine expression in human neutrophils. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19 2009，1939-1943]。根據(jù)表1、表2和表3 (流式細胞計數(shù)研究)中給出的結果， 清楚的是，當與單獨的乳香酸成分和多糖成分相比時，該組合物對于鼠分離的中性粒細胞響應LPS刺激物的TNF-α細胞因子分泌上表現(xiàn)出最大的抑制效應。用25、50、100、200、400 和800 μ g/ml濃度的乳香酸成分、多糖成分和組合物體外處理的中性粒細胞在200 μ g/ml 的劑量水平下分別表現(xiàn)出30. 52%,29. 31%和59. 83%的TNF-α抑制。由數(shù)據(jù)可清楚地證實，與單獨的成分相比，以相同劑量水平的組合物表現(xiàn)出增強的抑制TNF-a的活性。表1 獲自Boswellia物種的多劑量乳香酸成分對鼠中性粒細胞中胞內TNF-α表達的影響
權利要求
1.一種協(xié)同組合物，包括濃度為約60%的乳香酸成分和濃度為約40%的多糖成分、可選地連同藥用賦形劑。
2.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中，所述乳香酸成分和所述多糖成分獲自 Boswellia 物種。
3.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中，所述乳香酸成分包括乳香酸、乙?；?β-乳香酸、11-酮-β-乳香酸和乙?；?11-酮-β-乳香酸。
4.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中，所述多糖成分包括半乳糖、阿拉伯糖、D-葡糖醛酸和4-0-甲基-葡糖醛酸阿拉伯糖基-半乳聚糖。
5.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中，所述藥用賦形劑選自包括抗粘附劑、粘合劑、 涂布劑、崩解劑、填充劑和稀釋劑、調味劑、著色劑、助流劑、潤滑劑、防腐劑、吸附劑、甜味劑以及它們的組合的組。
6.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中，所述組合物被配制成選自包括液體、錠劑、糖錠、粉劑、顆粒、膠囊、片劑、貼劑、凝膠、乳液、膏劑、洗劑、牙膏、滴劑、混懸液、糖漿、酏劑、植物劑和營養(yǎng)劑的組中的劑型。
7.一種用于制備協(xié)同組合物的方法，所述組合物包括濃度為約60%的乳香酸成分和濃度為約40%的多糖成分、可選地連同藥用賦形劑，所述方法包括以下步驟由Boswellia物種獲得乳香酸成分和多糖成分；合并濃度為約60%的所述乳香酸成分和濃度為約40%的所述多糖成分、可選地連同藥用賦形劑，以獲得所述組合物。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中，所述乳香酸成分包括β-乳香酸、乙?；?β-乳香酸、11-酮-β-乳香酸和乙酰基-11-酮-β-乳香酸。
9.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中，所述多糖成分包括半乳糖、阿拉伯糖、D-葡糖醛酸和4-0-甲基-葡糖醛酸阿拉伯糖基-半乳聚糖。
10.一種用于向下調節(jié)/抑制促炎標記物的方法，所述方法包括給予需要其的受試者組合物的步驟，所述組合物包括濃度為約60%的乳香酸成分和濃度為約40%的多糖成分、 可選地連同藥用賦形劑。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中，所述乳香酸成分和所述多糖成分獲自 Boswellia 物種。
12.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中，所述受試者是動物，包括人類。
13.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中，所述促炎標記物選自包括TNF-a、IL-Ιβ、 IFN- γ、氧化一氮和LTB4的組。
14.一種用于向下調節(jié)/抑制PGE2的方法，所述方法包括給予需要其的受試者組合物的步驟，所述組合物包括單獨的多糖成分或多糖成分與乳香酸成分的組合、可選地連同藥用賦形劑。
15.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中，所述多糖成分和所述乳香酸成分獲自 Boswellia 物種。
16.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中，所述受試者是動物，包括人類。
17.一種膳食補充劑，包含權利要求1和/或權利要求14中的所述的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于向下調節(jié)促炎標記物的組合物。該組合物包括特定濃度的獲自Boswellia物種的乳香酸成分和多糖成分，與單獨的乳香酸成分和多糖成分相比，該組合物表現(xiàn)出其活性的增強。本發(fā)明進一步包括多糖成分單獨或與乳香酸成分組合在抑制PGE2中的應用。
文檔編號A23L1/30GK102218075SQ201010275989
公開日2011年10月19日 申請日期2010年9月1日 優(yōu)先權日2010年3月2日
發(fā)明者安賈莉·潘迪, 穆罕默德·馬吉德, 薩朗·巴尼, 貝納·巴特 申請人:穆罕默德·馬吉德