專利名稱：嗜熱脂肪芽孢桿菌dna聚合酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA聚合酶，具體涉及一種嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶、基因、質(zhì)粒、 融合蛋白、用途和嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶的制備方法。
背景技術(shù)：
DNA是大多數(shù)生物物種的遺傳物質(zhì)。DNA聚合酶的功能主要是進(jìn)行DNA復(fù)制和修 復(fù)。目前已經(jīng)克隆了多種生物物種的DNA聚合酶，包括一些嗜熱生物的DNA聚合酶。從嗜 熱生物中分離的DNA聚合酶具有較高的熱穩(wěn)定性，例如從Thermus aquaticus中獲得的Taq DNA聚合酶在95°C的半衰期為1. 6小時。環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplication of DNA，簡稱 LAMP)是在恒溫(63 65°C )條件下45 90分鐘內(nèi)完成。這種比較溫和的溫度條件以及 沒有溫度循環(huán)使所需儀器簡單化，克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測時間長、容易污染及檢測成 本高等缺點(diǎn)。而且，這種檢測方法對檢測人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，實(shí)際操作極為簡便，不 需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。因此需要尋找一種DNA 聚合酶來適應(yīng)LAMP檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個發(fā)明目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種嗜熱脂肪芽孢 桿菌DNA聚合酶的基因。一種嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶的基因，所述的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶 基因的核苷酸編碼序列如SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明的另一個發(fā)明目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種質(zhì)粒。一種含有上述嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶的基因的質(zhì)粒pMal-C5X/bst。pMal系統(tǒng)是一種高效的蛋白融合表達(dá)及純化系統(tǒng)。pMal載體含有編碼麥芽糖結(jié) 合蛋白(Maltose Binding Protein, MBP)的大腸桿菌mal E基因，其下游的多克隆位點(diǎn)便 于目的基因插入，表達(dá)N端帶有MBP的融合蛋白(1，2，3)。通過〃 Ptac"強(qiáng)啟動子和mal E 翻譯起始信號使克隆基因獲得高效表達(dá)，并利用MBP對麥芽糖的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)融合蛋白 的一步親和純化。此系統(tǒng)的pMal載體在鄰近多克隆位點(diǎn)處含有一段編碼特異性蛋白酶識別位點(diǎn)的 序列，從而便于純化后將目的蛋白與MBP切割分離(5)。為了實(shí)現(xiàn)這個目的，多克隆位點(diǎn)中 有一個限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)正好位于特異性蛋白酶識別位點(diǎn)處，同時也是目的基因插入 的位點(diǎn)。pMal系列載體可從1升的培養(yǎng)液中表達(dá)出IOOmg的融合蛋白。大部分情況下，表 達(dá)出的融合蛋白是可溶的，因?yàn)镸BP已經(jīng)被證實(shí)可提高大腸桿菌中表達(dá)蛋白的可溶性(6)。 盡管沒有一種表達(dá)系統(tǒng)適用于所有基因克隆，但PMal蛋白融合表達(dá)和純化系統(tǒng)經(jīng)證實(shí)在 被檢測的已知蛋白中，有超過75%能表達(dá)出穩(wěn)定產(chǎn)量。Current Protocols in Molecular
3Biology (3)中有一章對pMal載體的使用作了深入分析。本發(fā)明采用該表達(dá)系統(tǒng)可以表達(dá)麥芽糖結(jié)合蛋白與嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合 酶的融合蛋白。所表達(dá)的融合蛋白可以用直鏈淀粉親和層析進(jìn)行純化，所得產(chǎn)物純度很高。 另外，據(jù)報道麥芽糖結(jié)合蛋白可以提高融合蛋白的可溶性，有利于融合蛋白的純化。本發(fā)明的另一個發(fā)明目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種DNA聚合酶。一種嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶，所述的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶的氨基 酸序列如SEQ ID NO 2所示。由于嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，并且具有較高的鏈置換活性 因此能夠用于高溫測序和核酸等溫擴(kuò)增。本發(fā)明嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶在65°C的半 衰期為8分鐘。本發(fā)明還提供了上述的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶在核酸擴(kuò)增反應(yīng)的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個發(fā)明目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種融合蛋白。一種融合蛋白，其具有上述的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶，所述的融合蛋白還 具有麥芽糖結(jié)合蛋白。所表達(dá)的融合蛋白可以用直鏈淀粉親和層析進(jìn)行純化，所得產(chǎn)物純度很高。另外， 麥芽糖結(jié)合蛋白可以提高融合蛋白的可溶性，有利于融合蛋白的純化。本發(fā)明還提供了上述的融合蛋白在嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶純化的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶的制備方法，所述的純化方法 包括如下步驟(1)擴(kuò)增如SEQ ID NO 1所示的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶基因的核苷酸編碼 序列；(2)將步驟(1)得到的核苷酸編碼序列克隆到pMal-C5x表達(dá)載體中，得到重組質(zhì) 粒 pMal-c5x/bst ；(3)在大腸桿菌中表達(dá)重組質(zhì)粒pMal-C5X/bst，獲得麥芽糖結(jié)合蛋白和嗜熱脂肪 芽孢桿菌DNA聚合酶大片段的融合蛋白；(4)采用直鏈淀粉親和層析純化步驟(3)得到的融合蛋白；(5)將純化后的融合蛋白進(jìn)行蛋白酶酶解，得到如SEQ ID NO 2所示的嗜熱脂肪芽 孢桿菌DNA聚合酶。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。LAMP 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(Loop-Mediated Isothermal Amplification)DNA 脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid)PCR 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction)EDTA 乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)DTT 二硫蘇糖醇(Dithiothreitol)ATCC 美國模式菌種收集中心(American Type Culture Collection)OD 光密度(Optical Density)dNTP(deoxyribonucleoside triphosphate)
嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株ATCC12980購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。實(shí)施例1.用PCR方法擴(kuò)增嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶大片段基因根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶基因設(shè)計了引物，以嗜熱脂肪 芽孢桿菌基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。所使用的條件為94°C 3分鐘；30個循環(huán)的94°C 0. 5 分鐘，50°C 0. 5分鐘，72°C 3分鐘；最后72°C 7分鐘。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得了約 1.8kb的擴(kuò)增片段。經(jīng)測序，如SEQ ID NO 1所示，為1761bp。實(shí)施例2.克隆擴(kuò)增片段到pMal-c5X表達(dá)載體中將實(shí)施例1的擴(kuò)增片段用FspI和BamHI酶切，pMal_c5x載體(購自NEB公司) 用XmnI和BamHI酶切。片段和載體混合之后加入T4 DNA連接酶，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a菌株。經(jīng)過酶切鑒定和測序，獲得了所需的克隆pMal-C5X/bst。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到TBI菌 株中進(jìn)行蛋白表達(dá)。實(shí)施例3.嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶大片段的表達(dá)將實(shí)施例2的含有表達(dá)質(zhì)粒pMal-C5X/bst的大腸桿菌在生長至0D600為0. 5時 加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，2小時之后離心收集菌體。實(shí)施例4.嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶大片段的純化將實(shí)施例3 收集得到的菌體在20mM Tris PH6. 8, IOOmM NaCl, ImM EDTA, ImM DTT, 0. 1體積％ Triton X100, lmg/ml溶菌酶緩沖液中裂解30分鐘，12000rpm離心30分鐘收集 上清液后與直鏈淀粉樹脂混合，4°C吸附60分鐘。直鏈淀粉樹脂以20mM Tris PH6. 8, IOOmM NaCl, 0. 3mM DTT緩沖液洗滌后，將重組蛋白用20mM Tris PH6. 8, IOOmM NaCl，IOmM麥芽糖 洗脫下來。洗脫的蛋白中加入ImMCaCl2及2呢蛋白酶Factor Xa，4°C切割20小時即獲得 嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶大片段。所述的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶大片段具有如 SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。實(shí)施例5.核酸等溫擴(kuò)增(LAMP)反應(yīng)條件為20mM Tris-HCl pH 8. 8, IOmM(NH4)2SO4, IOmM KCl,8mMMgS04,0. 1 % Triton X-100,0. 8Μ甜菜堿，1. 6mM dNTP，引物BIP和FIP各 1. 6 μ M，引物B3和F3各0. 2 μ M， 33ng實(shí)施例4得到的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶大片段以及模板DNA。65°C反應(yīng)60分 鐘之后加入2μ1 IOOOx Sybr Green I染料，反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色則為擴(kuò)增陽性。結(jié)果顯示實(shí) 施例4得到的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶大片段與商品化的NEB公司生產(chǎn)的Bst聚合酶 (大片段)一樣，都能夠用于核酸等溫擴(kuò)增(LAMP)。但相比起商品化的產(chǎn)品，本發(fā)明中提及 的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶大片段，檢測靈敏度高2個數(shù)量級。下面以檢測沙門氏菌 為例。培養(yǎng)沙門氏菌，經(jīng)菌落平板計數(shù)，選擇第9個稀釋度進(jìn)行讀數(shù)，平均菌落數(shù)為 126cfu,推算細(xì)菌原液濃度為1. 26 X IO11CfuAiL,用商品化的Bst聚合酶(大片段)，其它所 有條件不變，可檢測到第5個稀釋度，為1.26X 106cfU/mL。用本發(fā)明中提及的嗜熱脂肪芽 孢桿菌DNA聚合酶大片段，檢測靈敏度提高2個數(shù)量級，為1.26X 104cfU/mL。靈敏度改善 明顯。最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保 護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
一種嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶的基因，其特征在于，所述的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶基因的核苷酸編碼序列如SEQ ID NO 1所示。
2.一種含有權(quán)利要求1所述的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶的基因的質(zhì)粒pMal-C5x/bst ο
3.一種嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶，其特征在于，所述的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合 酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
4.如權(quán)利要求3所述的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶在核酸等溫擴(kuò)增反應(yīng)的應(yīng)用。
5.一種融合蛋白，其具有權(quán)利要求3所述的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶，所述的融合 蛋白還具有麥芽糖結(jié)合蛋白。
6.如權(quán)利要求5所述的融合蛋白在嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶純化的應(yīng)用。
7.一種嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，所述的純化方法包括 如下步驟(1)擴(kuò)增如SEQID NO 1所示的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶基因的核苷酸編碼序列；(2)將步驟(1)得到的核苷酸編碼序列克隆到pMal-C5x表達(dá)載體中，得到重組質(zhì)粒 pMal-c5x/bst ；(3)在大腸桿菌中表達(dá)重組質(zhì)粒pMal-C5X/bst，獲得麥芽糖結(jié)合蛋白和嗜熱脂肪芽孢 桿菌DNA聚合酶大片段的融合蛋白；(4)采用直鏈淀粉親和層析純化步驟(3)得到的融合蛋白；(5)將純化后的融合蛋白進(jìn)行蛋白酶酶解，得到如SEQID NO 2所示的嗜熱脂肪芽孢桿 菌DNA聚合酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶、基因、質(zhì)粒、融合蛋白、用途和嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶的制備方法。所述的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶能夠進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，且令該反應(yīng)更容易進(jìn)行，檢測靈敏度更高。所述的融合蛋白有利于嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶的純化。
文檔編號C12N15/10GK101948853SQ20101027605
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日
發(fā)明者周毅, 曹以誠, 杜正平 申請人:廣州華峰生物科技有限公司