專利名稱：：一站式pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種核酸擴(kuò)增和檢測的新方法，屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)自1990年由美國科學(xué)家、諾貝爾化學(xué)獎得主KarryBankMullis博士發(fā)明以來(Mullis，K.B.1990.Theunusualoriginofthepolymerasechainreaction.SciAm262,56-61.),Η^ηΤ^^Βfe]^!,目的基因片段的指數(shù)級復(fù)制，現(xiàn)在已經(jīng)成為體外核酸擴(kuò)增的最主要手段，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域。在Mullis博士提出的“PCR”概念的基礎(chǔ)上，科學(xué)家們探索、發(fā)展出了幾十種PCR的衍生技術(shù)，比如重組PCR，不對稱PCR，原位PCR等，極大地方便了生物學(xué)科研工作者開展各胃舌云力(Wei,K.,Wei,S.,Moralejo,D.H.,Yamada,Τ.,0gino,T.,andMatsumoto,K.AnefficientmultiplexPCRsuitableforlargescaletypinginlinkagemapping.JVetMedSci1999，61，849-851.)。作為一項重要的常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)，PCR在實際應(yīng)用中往往會碰到如下問題(I)PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率還不夠高；(2)PCR擴(kuò)增的靈敏度有限；(3)在進(jìn)行大規(guī)模文庫篩選等實驗時，加入點樣緩沖液并混勻樣品這一步驟會消耗大量時間和精力；(4)用于核酸染色的染料如EB，SYBRGreen等具有毒性，不僅直接危害實驗人員的身體健康，同時也造成不同程度的環(huán)境污染(Huang，Q.，andFu,W.L.ComparativeanalysisoftheDNAstainingefficienciesofdifferentfluorescentdyesinpreparativeagarosegelelectrophoresis.ClinChemLabMed2005，43，841-842.)。因此，發(fā)展一種高效、無毒、操作便捷的PCR方法，是實踐中面臨的主要挑戰(zhàn)之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種無毒和高效的PCR反應(yīng)的新方法。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題，所提供的技術(shù)方案是一種新型PCR反應(yīng)方法，依次包括如下步驟(1)兼容染料混合物(compatibledyemix)的配制，所述兼容染料混合物由聚蔗糖400(Ficoll400)、甲酚紅、檸檬黃和Gelred組成；(2)PCR主體混合物(mastermix)的配制，所述主體混合物由兼容染料混合物、dNTP、TaqDNA聚合酶和反應(yīng)緩沖液組成；(3)PCR反應(yīng)體系的配置；(4)PCR反應(yīng)條件的設(shè)定與運行；(5)PCR產(chǎn)物的檢測。所述聚蔗糖400(FicO11400)以蔗糖和環(huán)氧氯丙烷為原料，利用蔗糖和3_氯-1，2_環(huán)氧丙烷共聚作用制成的一種水溶性高聚物，分子量約為4X105。在本發(fā)明中，聚蔗糖3400的工作濃度為2%(質(zhì)量/體積)，既有沉降劑的作用，又可以保護(hù)TaqDNA聚合酶在不斷熱激的條件下保持較高的活性，從而提高擴(kuò)增效率。所述甲酚紅(Cresolred)是一種三芳基甲烷染料，分子式是C21H18O5S,分子量382.43。其紅棕色或紅綠色粉末，能溶于堿溶液，微溶于甲醇和乙醇，幾乎不溶于丙酮和苯。在本發(fā)明中，甲酚紅的工作濃度是0.004%(質(zhì)量/體積)，用作電泳指示劑。所述檸檬黃(Tartrazine)為橙黃色的無臭顆?；蚍勰?，易溶于水、甘油、丙二醇，微溶于乙醇，不溶于油脂。溶于水呈黃色。在本發(fā)明中，檸檬黃的工作濃度為0.016%(質(zhì)量/體積)，用作電泳指示劑。所述的Gelred為近年來發(fā)明的EB的替代品，具有高靈敏度和無毒易處理的雙重優(yōu)點，在實際的核酸檢測中已得到越來越廣闊的應(yīng)用。而且，Gelred的激發(fā)波長和發(fā)射波長相同，因此凡是適用于EB的凝膠成像系統(tǒng)也適用于Gelred染色的核酸檢測。本發(fā)明中所用Gelred購自美國Biocompare公司，原液的濃度為10000X，本發(fā)明中Gelred的工作濃度是0.25X(質(zhì)量/體積)。所述dNTP為dATP，dCTP，dGTP，dTTP四種脫氧核糖三磷酸的混合物，貯存濃度為40mmol/l(10mmol/l/每種)，每種脫氧核糖三磷酸的工作濃度為lmmol/1。所述的TaqDNA聚合酶是嗜熱性細(xì)菌Thermusaquaticus來源的熱穩(wěn)定重組型TaqDNA聚合酶，分子量為94KD。擴(kuò)增片段的長度可達(dá)5kb(簡單模板)。延伸速度為0.9-1.2kb/分鐘(70-75°C)。該酶具有5’一3’聚合酶活性，無3’一5’外切酶活性。所述的反應(yīng)緩沖液的配方和工作濃度如下MgSO42mmol/lKCl10mmol/l(NH4)2SO48mmol/lTris-HCl(pH9.0)10mmol/lNP-400.05vol%所述PCR反應(yīng)的運行包括常規(guī)PCR，多重PCR，半定量PCR，長片段PCR，高GC含量PCR等。所述的PCR產(chǎn)物檢測主要是指瓊脂糖凝膠電泳。在制備瓊脂糖凝膠時不需要額外添加核酸染料，也不需要單獨制備或貯存核酸染料。所述的PCR產(chǎn)物檢測所用的凝膠成像系統(tǒng)，只要適合EB的成像檢測，即可適用于使用本發(fā)明所獲得PCR產(chǎn)物的檢測。所述的PCR產(chǎn)物的純化過程是指乙醇沉淀、硅膠膜過濾。使用本發(fā)明獲得的PCR產(chǎn)物，均帶有A尾，可以進(jìn)行T/A克隆。經(jīng)測序證明，本發(fā)明不會引起堿基突變，可以滿足基因克隆等實驗的要求。本發(fā)明方法是通過在常規(guī)PCR反應(yīng)體系中添加沉降劑、指示劑、染色劑實現(xiàn)的，不僅可有效提高PCR反應(yīng)的效率和靈敏度，還實現(xiàn)了PCR反應(yīng)后產(chǎn)物的直接點樣電泳和無毒即時染色。所添加的沉降劑、指示劑、染色劑對PCR反應(yīng)本身沒有任何負(fù)面影響，且均為常見的化學(xué)試劑，價格便宜，易于保存，使用方便；該方法還實現(xiàn)了與多種下游分子生物學(xué)操作的兼容性，具有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明的有益效果在于1)使用本發(fā)明實施PCR反應(yīng)時，不僅反應(yīng)體系的配制簡便易行，易于掌握，而且擴(kuò)增效率和靈敏度高，副作用少，大大提高了PCR反應(yīng)的成功率。2)本發(fā)明預(yù)先混合了電泳所需的指示劑和沉降劑，因而實現(xiàn)了在PCR反應(yīng)之后可以直接吸取產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，省去了傳統(tǒng)PCR反應(yīng)之后需要另外加入點樣緩沖液并混勻樣品再進(jìn)行電泳的步驟，大大減少了操作時間，提高了工作效率。特別是在進(jìn)行高通量實驗如菌落PCR時，快捷、省時、高效的效果更為明顯。3)本發(fā)明預(yù)先混合了無毒的核酸染料Gelred，研究人員在進(jìn)行PCR產(chǎn)物的檢測時只需要制備瓊脂糖凝膠即可，不需要額外制備或配制專門的核酸染色液，有效降低實驗人員接觸有毒物質(zhì)的風(fēng)險。而且其激發(fā)和發(fā)射光譜與EB—致，所以適用于EB的凝膠成像系統(tǒng)也適用于本發(fā)明的PCR產(chǎn)物成像檢測，無需更換現(xiàn)有的成像設(shè)備。4)使用本發(fā)明獲得的PCR產(chǎn)物，兼容多種下游操作，可直接進(jìn)行乙醇沉淀，濃縮、回收目的片段；可直接使用商業(yè)化的PCR產(chǎn)物純化試劑盒，純化、回收目的片段?；厥掌蔚牡寐?、純度與常規(guī)PCR反應(yīng)具有相似的結(jié)果。圖1一站式PCR和常規(guī)PCR產(chǎn)物的電泳遷移率對比。圖2—站式PCR和PCR試劑盒擴(kuò)增能力對比。圖3—站式PCR和常規(guī)PCR高效擴(kuò)增復(fù)雜模板對比。圖4一站式PCR和常規(guī)PCR下游實驗對比。具體實施例方式一種新型PCR反應(yīng)方法，依次包括如下步驟(1)兼容染料混合物(compatibledyemix)的配制，所述兼容染料混合物由聚蔗糖400(Ficoll400)、甲酚紅、檸檬黃和Gelred組成；(2)PCR主體混合物(mastermix)的配制，所述主體混合物由兼容染料混合物、dNTP、TaqDNA聚合酶和反應(yīng)緩沖液組成；(3)PCR反應(yīng)體系的配置；(4)PCR反應(yīng)條件的設(shè)定與運行；(5)PCR產(chǎn)物的檢測。下面以具體的實施例說明一站式PCR的操作流程和實際用途。實施例1，5X兼容染料混合物的配制(IOOml)(1)干凈的燒杯中加入80mlPCR級別的純水；(2)稱取IOgFicoll400干粉，加入上述純水中，注意一邊加入一邊用磁力攪拌器旋轉(zhuǎn)混勻，不要使Ficoll400結(jié)塊，否則影響后續(xù)點樣的沉降效果；(3)稱取0.02g甲酚紅，加入到步驟(2)的溶液中，磁力攪拌助溶；(4)稱取0.08g檸檬黃，加入到步驟(3)的溶液中，磁力攪拌助溶；(5)將步驟(4)的溶液放到70°C溫箱中高溫加熱助溶，時間為1小時，期間每隔10分鐘左右用力搖勻，此時可看到溶液呈現(xiàn)透明的黃紅色，為正常顏色；(6)將步驟(5)的溶液取出冷卻后，加入適量PCR級別的純水定容至IOOml；(7)在步驟(6)的溶液中加入10000XGelred原液12.5ul，此時Gelred的濃度為1.25X。(8)將步驟(7)的溶液用0.45um濾膜過濾，此溶液即為5X兼容染料混合物溶液。其中，甲酚紅和檸檬黃購自美國Amresco公司，聚蔗糖400購自美國Sigma公司，Gelred購自美國Biocompare公司，純度為分子生物學(xué)級別。5X兼容染料混合物溶液配制完畢后，避光條件下在2-8°C可長期保存。在配制5X兼容染料混合物溶液的過程中，應(yīng)注意各個組分充分溶解，最終的狀態(tài)呈現(xiàn)為透明的黃紅色，略黏稠。實施例2，2XPCR主體混合物配制2XPCR主體混合物配制，各成分和使用量如下表所示5X兼容染料混合物4ulIOX反應(yīng)緩沖液2uldNTP(10mmol/l每種)0.5ulTaqDNA聚合酶(5units/ul)0.2ulPCR級別純水3.3ul_總體積IOul按照上表順序依次混勻各組分，可按比例放大配制。其中，TaqDNA聚合酶，dNTP，IOX反應(yīng)緩沖液均購自上海申能博彩生物科技有限公司。2XPCR主體混合物可用1.5ml離心管分裝，Iml/管，避光條件下在_20°C可長期保存。2XPCR主體混合物的正常顏色為深紅色。實施例3—站式PCR不影響產(chǎn)物的電泳遷移率(圖1)(1)以人Hela細(xì)胞cDNA為模板(以2μg總RNA制備)，擴(kuò)增β-actincDNA0.lkb，0.2kb，0.3kb，0.4kb，0.5kb，0.75kb的片段。反應(yīng)體系的配制如下2XPCR主體混合物IOul上游引物(IOuM)0.5ul下游引物(IOuM)0.5ul模板cDNA1μ1水8ul總體積20ul(2)反應(yīng)條件為940C2min預(yù)變性940C15sec變性)580C15sec退火[30個循環(huán)720CImin延伸—72"C5min總延伸(3)PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μ1產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。由圖1的結(jié)果可知，一站式PCR對PCR產(chǎn)物的電泳遷移率沒有影響。實施例4一站式PCR具有高效擴(kuò)增能力(圖2)(1)以人Hela細(xì)胞cDNA為模板(以2yg總RNA制備)，梯度稀釋(1/1，1/10，1/100)后擴(kuò)增-actin0.4kb的片段。反應(yīng)體系為2XPCR主體混合物IOul上游引物(IOuM)0.5ul下游引物(IOuM)0.5ul模板cDNAIul水8ul總體積20ul(2)反應(yīng)條件為940C2min預(yù)變性940C580C15sec變性、15sec退火30sec延伸30個循環(huán)720C72"C5min總延伸(3)同時，以商品化的PCR試劑盒作為對照，分別是上海申能博彩TaqDNA聚合酶，立陶宛Fermentas公司的DreamTaqDNA聚合酶，上海DBI公司的藍(lán)色PCR主體混合物。反應(yīng)體系的配制和條件同上。力。(4)PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μ1產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。由圖2的結(jié)果可知，與商品化的PCR試劑盒相比，一站式PCR具備高效的擴(kuò)增能實施例5—站式PCR可高效擴(kuò)增復(fù)雜模板(圖3)(1)人Η19RNA的GC含量在80%左右。以含有Η19RNA的質(zhì)粒為模板，采用--站式PCR和常規(guī)PCR分別擴(kuò)增相應(yīng)的片段，比較二者對復(fù)雜模板的擴(kuò)增能力。反應(yīng)體系如下2XPCR主體混合物IOul上游引物(IOuM)0.5ul下游引物(IOuM)0.5ul質(zhì)粒DNAlul(10ng/ul)水8ul總體積20ul(2)反應(yīng)條件為940C2min預(yù)變性7940C15sec變性)580CI5Sec退火[30個循環(huán)720C2min延伸—72"C5min總延伸(3)PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μ1產(chǎn)物用的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。由圖3的結(jié)果可知，二者在擴(kuò)增復(fù)雜模板方面，均具有較高的擴(kuò)增效率，說明一站式PCR適合復(fù)雜條件的PCR反應(yīng)。實施例6—站式PCR兼容下游實驗(圖4)(1)以乙醇沉淀和硅膠膜純化的方法檢測一站式PCR是否可以兼容下游的操作。以人Hela細(xì)胞cDNA為模板(以2μg總RNA制備)，采用一站式PCR和常規(guī)PCR擴(kuò)增β-actin0.4kb的片段。反應(yīng)體系為2XPCR主體混合物IOul上游引物(IOuM)0.5ul下游引物(IOuM)0.5ul模板cDNAIul水8ul總體積20ul(2)反應(yīng)條件為940C2min預(yù)變性940C15sec變性〕580C15sec退火[30個循環(huán)720C30sec延伸一72"C5min總延伸(3)反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物實施下列兩組實驗(i)在PCR產(chǎn)物中加入1/10體積的醋酸鈉(pH值為5.2)和2倍體積乙醇，冰浴放置15分鐘。用臺式離心機(jī)以12000g的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，沉淀用等體積的雙蒸水回溶。(ii)硅膠膜純化試劑盒購自上海杰瑞生物科技有限公司。簡要步驟為在PCR產(chǎn)物中加入3倍體積的結(jié)合緩沖液，然后加到硅膠膜柱子中，離心去除上清液，用等體積雙蒸水將吸附于硅膠膜上的PC產(chǎn)物回溶。由圖4的結(jié)果可知，一站式PCR中添加的各種化學(xué)成分對乙醇沉淀和硅膠膜純化的實驗效果沒有任何負(fù)面影響，說明一站式PCR與PCR反應(yīng)的下游實驗是兼容的。8權(quán)利要求一站式PCR方法，其特征在于依次包括如下步驟(1)兼容染料混合物的配制，所述兼容染料混合物由聚蔗糖400、甲酚紅、檸檬黃和Gelred組成；(2)PCR主體混合物的配制，所述主體混合物由兼容染料混合物、dNTP、TaqDNA聚合酶和反應(yīng)緩沖液組成；(3)PCR反應(yīng)體系的配置；(4)PCR反應(yīng)條件的設(shè)定與運行；(5)PCR產(chǎn)物的檢測。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一站式PCR方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)的運行方法包括常規(guī)PCR、多重PCR、半定量PCR、長片段PCR和高GC含量PCR。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一站式PCR方法，其特征在于所述聚蔗糖400的工作濃度為2%(質(zhì)量/體積)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一站式PCR方法，其特征在于所述甲酚紅的工作濃度是0.004%(質(zhì)量/體積)。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一站式PCR方法，其特征在于所述檸檬黃的工作濃度為0.016%(質(zhì)量/體積)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一站式PCR方法，其特征在于所述Gelred的工作濃度是0.25X(質(zhì)量/體積)。全文摘要本發(fā)明屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種新型PCR反應(yīng)方法，依次包括如下步驟1)兼容染料混合物的配制，所述兼容染料混合物由聚蔗糖400、甲酚紅、檸檬黃和Gelred組成；2)PCR主體混合物的配制，所述主體混合物由兼容染料混合物、dNTP、TaqDNA聚合酶和反應(yīng)緩沖液組成;3)PCR反應(yīng)體系的配置；4)PCR反應(yīng)條件的設(shè)定與運行；5)PCR產(chǎn)物的檢測。本發(fā)明方法實現(xiàn)了PCR反應(yīng)后的直接點樣電泳和即時染色。此外，本發(fā)明使用了無毒的核酸染料，是一種低成本、高效率、無毒性的PCR反應(yīng)新方法。使用本發(fā)明得到的PCR產(chǎn)物，可以直接進(jìn)行多種下游操作如乙醇沉淀、硅膠膜產(chǎn)物純化等。本發(fā)明方法適用于與PCR有關(guān)的基因表達(dá)檢測、基因克隆等方面的研究。文檔編號C12Q1/68GK101921867SQ20101027615公開日2010年12月22日申請日期2010年9月9日優(yōu)先權(quán)日2010年9月9日發(fā)明者張嘉農(nóng),畢延震,馬鈞申請人:武漢大學(xué)