專利名稱：實時熒光定量pcr檢測基孔肯亞病毒核酸的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明提供一種利用實時熒光定量PCR檢測基孔肯亞病毒核酸的方法。
背景技術(shù)：
基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)是單股正鏈RNA病毒，屬于披膜病毒科 (Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus)，引起基孔肯雅熱(Chikungunyafever，CHIK)。該 病為一種急性傳染病，通過伊蚊傳播給人，在臨床上以發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛、皮疹和輕度出血為 特征。1953年首次從坦桑尼亞的1例發(fā)熱患者的血液中分離出基孔肯雅病毒。20世紀 60-90年代，在非洲中部和南部的許多國家該病均有流行，并分離到CHIK病毒，如蘇丹、烏 干達、剛果民主共和國、中非共和國、馬拉維、津巴布韋、肯尼亞和南非；西非的塞內(nèi)加爾、貝 寧、幾內(nèi)亞共和國、科特迪瓦和尼日利亞等；在東南亞，1999年印度尼西亞首次暴發(fā)CHIK， 2001-2003年此地再次出現(xiàn)該病流行；在印度洋島嶼，近幾年，印度洋島嶼出現(xiàn)大規(guī)模的 CHIK暴發(fā)流行。2005年，科摩羅島發(fā)生大暴發(fā)流行并迅速傳播到整個印度洋的其他島嶼； 在歐洲，2007年7月，意大利拉文納省的2個村莊發(fā)生CHIK ；2004-2007年，亞洲和非洲等 地區(qū)的CHIK暴發(fā)流行不斷發(fā)生，其中2006年全球共發(fā)生CHIK患者大約200萬例。值得注 意的是我國的臺灣地區(qū)在1967年和2006年曾發(fā)生過CHIK流行，2008年我國大陸首次發(fā)現(xiàn) 的CHIK輸入性病例。但截至目前我國尚無CHIK本土流行的確切報道?？v觀歷史，CHIK已 經(jīng)成為全球區(qū)日益嚴重的公共衛(wèi)生問題。目前，針對外來傳染病的實驗室快速檢測技術(shù)主要采用的是免疫學檢測及核酸檢 測技術(shù)，尤其以PCR技術(shù)為代表的核酸檢測技術(shù)，能夠非常靈敏的檢測出各種疫病病原體 的核酸。但是由于PCR擴增技術(shù)經(jīng)常帶來特異性問題，各國科學家和技術(shù)人員都在PCR技術(shù) 基礎上，結(jié)合其它新技術(shù)，努力改善PCR技術(shù)的特異性和敏感度。近年來，基于PCR技術(shù)及 ABI Taqman探針雜交技術(shù)發(fā)展起來的實時熒光PCR技術(shù)極大地改善了傳統(tǒng)PCR技術(shù)的特異 性和敏感性以及抗污染的能力，已經(jīng)越來越廣泛的應用到各種疫病的檢驗檢疫中。隨著探 針技術(shù)的進一步發(fā)展完善，一種新型的Hydro Easy Probes的出現(xiàn)，能夠有效的改進Taqman 探針本底信號高的缺點，并且進一步提高檢測的靈敏度。本發(fā)明擬采用新型HydroEasy Probes設計技術(shù)，開發(fā)基孔肯雅病毒的熒光PCR檢測診斷方法，為國境口岸的基孔肯雅病 毒的快速檢測提供有力保障。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種實時熒光定量PCR檢測基孔肯亞病毒核酸的方法。該 方法利用實時熒光定量PCR檢測技術(shù)，設計了一對引物和探針對病毒樣本進行實時定量檢 測。該方法檢測特異性好，靈敏度高。本發(fā)明實時熒光定量PCR檢測基孔肯亞病毒核酸的方法，首先包括獲得檢測基孔 肯亞病毒核酸的引物和探針的步驟，該步驟具體為(1)收集篩選基孔肯亞病毒全基因組序列，利用生物信息學軟件對其進行同源性比對，在其保守區(qū)設計引物；(2)根據(jù)PCR擴增 區(qū)域內(nèi)的核苷酸序列設計特異性探針，并登錄GENEBANK中檢測探針的特異性；(3)對待檢 測物進行實時定量分析。在本發(fā)明上述方法中，所篩選的基孔肯亞病毒可以是NCBI公布的所有基孔肯亞 病毒全基因組序列。另外，本發(fā)明的方法中，可以利用DNASTAR軟件進行序列的同源性比 對。比對結(jié)果見

圖1。圖中陰影部分為全序列中某個高保守區(qū)。在本發(fā)明引物和探針設計中，首先在比對的序列保守區(qū)設計上下游引物，根據(jù)引 物設計原理，在保守區(qū)之間設計上游和下游引物，其中在下游引物的第5位和第25位存在 簡并性，設計位于擴增區(qū)域內(nèi)的特異的探針，其中在探針的第19位和第21位存在簡并性。 引物和探針在合成時，探針5'端連接FAM熒光基團，3'端連接BHQ非熒光基團。引物的特 異性增強。引物和探針序列見表1。表 權(quán)利要求
實時熒光定量PCR檢測基孔肯亞病毒核酸的方法，其特征在于，該方法利用實時熒光定量PCR檢測技術(shù)，通過設計一對引物和探針對病毒樣本進行實時定量檢測，所設計引物和探針序列如下
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法包括引物和探針的獲得，對基孔肯 亞病毒核酸的檢測；其中，引物和探針的獲得步驟為(1)收集篩選基孔肯亞病毒全基因組 序列，利用生物信息學軟件進行同源性比對，并在其保守區(qū)設計引物，(2)根據(jù)PCR擴增區(qū) 域內(nèi)的核苷酸序列設計特異性探針，并登錄 GENEBANK檢測探針的特異性；對基孔肯亞病毒 核酸的檢測步驟為首先提取病毒的核酸，然后利用所設計的引物和探針對待檢測物進行 實時熒光定量PCR檢測。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述RT-PCR擴增具體為配制一定組分濃度 的25 μ L PCR反應體系。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣本包括蚊蟲、蝙蝠、人血清及組織、細 胞培養(yǎng)液、野生靈長類、家畜等。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述實時熒光定量PCR檢測技術(shù)中，所述 探針上連接的熒光基團包括FAM-BHQ、FAM-TAMARA。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述RT-PCR反應適用于ABI實時PCR系統(tǒng)、 BioRad實時PCR檢測系統(tǒng)、Stratagene定量多聚酶鏈反應儀來完成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種實時熒光定量PCR檢測基孔肯亞病毒核酸的方法，該方法包括引物和探針的獲得及基孔肯亞病毒核酸的檢測。本發(fā)明具有特異性好，靈敏度高等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/70GK101935715SQ20101027664
公開日2011年1月5日 申請日期2010年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月8日
發(fā)明者姚李四, 張曉龍, 燕清麗 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院