專利名稱：一種利用實驗室飼養(yǎng)的蜜蜂幼蟲培養(yǎng)蜜蜂球囊菌的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及了一種培養(yǎng)蜜蜂球囊菌的方法，更具體地涉及了一種利用實驗室飼養(yǎng) 的蜜蜂幼蟲培養(yǎng)蜜蜂球囊菌的方法。
背景技術：
白堊病是一種蜜蜂真菌性疾病，它是由蜜蜂球囊菌引起的。該病原菌主要是在幼蟲期 伴隨著蜜蜂的食物一起進入蜜蜂幼蟲的消化道內，在整個幼蟲期基本不會蜜蜂發(fā)病，只是 在幼蟲發(fā)育完全之后，進入蛹期開始，菌絲迅速在蜜蜂幼蟲體內生長，充斥整個蜜蜂幼蟲體 內，導致蜜蜂死亡，形成的菌絲最后突破蜜蜂的表皮，在蜜蜂體內、體外形成包囊，內含數量 眾多的孢子，一般每只蜜蜂幼蟲可形成IO9個孢子，這些孢子又可作為下一輪侵染其他蜜蜂 幼蟲的病原開始新一輪的侵染過程。在自然情況下，這些蜜蜂球囊菌的孢子可以存活幾十 年，蜂群內蜜蜂個體之間存在著非常密切的交互哺育的生物學特性，哺育蜂飼喂蜜蜂的幼 蟲，成年蜜蜂之間的相互飼喂等等，蜜蜂球囊菌孢子伴隨這一過程迅速在蜂群內所有的蜜 蜂個體內傳播。在一個蜂場內不同的蜂群之間因蜂農常規(guī)的蜂群管理措施以及蜜蜂的謎巢 等行為導致蜜蜂球囊菌孢子在不同的蜂群之間傳播。同時，又因蜜蜂的轉地放蜂等養(yǎng)蜂生 產活動，可促進蜜蜂白堊病在更大的地域范圍內傳播和流行。雖然蜜蜂球囊菌對成年蜜蜂 的危害不大，但球囊菌的孢子通過飼料和成年蜜蜂哺育喂食蜜蜂幼蟲時傳染給蜜蜂幼蟲， 嚴重危害時，導致蜜蜂幼蟲的大量死亡，使得蜂群不能夠發(fā)展壯大，其生產蜂產品的能力和 在農業(yè)中的授粉效能無法發(fā)揮，給養(yǎng)蜂業(yè)打來沉重的打擊。鑒于此，過去數十年來，為應對蜜蜂球囊菌的危害，科技工作者和蜂農開展多種多 樣的防治工作，世界范圍內，包括一些改善了的養(yǎng)蜂管理措施、多種多樣的化學藥物、植物 源抑菌劑的開發(fā)利用、新型抗生素等等方法應用于蜜蜂球囊菌的防治，但由于種種原因，至 今還沒有有效防控蜜蜂白堊病危害的技術與方法。因此，業(yè)界還需加大科研的力度，探究蜜 蜂球囊菌流行和侵染蜜蜂的途徑，尋找其致病過程中可以利用的環(huán)節(jié)，開發(fā)可以有效控制 球囊菌生長的技術和方法。為研究蜜蜂球囊菌及其侵染蜜蜂的過程和途徑，球囊菌的培養(yǎng)是必不可少的一項 工作。過去的養(yǎng)蜂和研究實踐中，已經開發(fā)形成了一些可以有效培養(yǎng)蜜蜂球囊菌的方法。比 如，自然情況下，球囊菌就可以侵染蜜蜂，我們可以從蜂群中收集染病的蜜蜂幼蟲及生長的 球囊菌，但這種培養(yǎng)的球囊菌是以飼養(yǎng)的蜂群為對象，我們無法控制蜜蜂幼蟲是否攝入、哪 個日齡的蜜蜂攝入以及攝入球囊菌孢子的數量等等，受多種不可控條件的制約。因此蜂群 內球囊菌的感染和生長過程無法控制，給相關的研究帶來困難。針對蜜蜂球囊菌生長的特點，目前已經有利用培養(yǎng)基進行體外培養(yǎng)的技術與方法 (Appl. Envir. Microbiol. , Jul 1987; 53: 1679 - 1684;)，為蜜蜂球囊菌相關生物學 的研究做了很多工作。但這些體外的球囊菌培養(yǎng)方法與其在蜜蜂體內的生長情況還是不一 樣的。由于培養(yǎng)基質的不同，球囊菌的生長特性是不一樣的。尤其對于研究工作來講，需要 了解球囊菌在蜜蜂體內萌發(fā)、生長和侵染的各個環(huán)節(jié)，一般蜂群接種培養(yǎng)的方法對球囊菌 的進入蜜蜂體內的時間和進程無法控制，而利用各種培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的方式不是在蜜蜂體內，不能代表侵染蜜蜂的生理過程，因而都不能滿足工作的需要。

發(fā)明內容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種利用實驗室飼養(yǎng)的蜜蜂幼蟲培養(yǎng)蜜蜂球囊 菌的方法，具有重要的科學意義。本發(fā)明利用實驗室飼養(yǎng)的蜜蜂幼蟲培養(yǎng)蜜蜂球囊菌的方法，包括以下步驟
(1)蜜蜂幼蟲的實驗室飼養(yǎng)
利用24孔板來飼喂蜜蜂的幼蟲直至蜜蜂幼蟲發(fā)育完全；培養(yǎng)箱培育條件溫度為 34. 5°C，濕度彡80% ；化蛹后，用濾紙吸干體表的飼料后，置入墊有濾紙的24孔板內完成蛹 期的發(fā)育；
(2)接種孢子的準備
接種用的孢子來自于患病蜂群的染病幼蟲，采集這些形成孢子的染病幼蟲，用勻漿器 磨碎幼蟲，移至加有滅菌水的燒杯內，加玻璃珠，攪拌4小時以上，制備成接種用的孢子母 液；
(3)接種:
將準備好的孢子母液加入調配好的蜜蜂幼蟲的飼料內，使孢子終濃度為IO4-IO6個/毫 升；接種的對象為第3-5日齡的蜜蜂幼蟲；接種方法為在給第3-5日齡的蜜蜂幼蟲更換飼 料時，將混有孢子的飼料飼喂蜜蜂24小時，隨后就轉為正常的沒有孢子的飼料飼喂；
(4)低溫處理
接種時采用30°C處理4個小時的低溫處理，之后轉入正常的培養(yǎng)箱內進行飼養(yǎng)。其中所述飼喂蜜蜂幼蟲的飼料配方按重量比為蜂王漿50%，無菌水37%，蜂蜜12%， 酵母浸膏1% ；所述蜜蜂幼蟲的實驗室飼養(yǎng)具體方法為從蜂箱內移取2日齡的蜜蜂幼蟲至 盛有蜜蜂幼蟲飼料的24孔板內，置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，以后每24小時，重新制備一份加有飼 料的24孔板且把蜜蜂幼蟲移入，放入培養(yǎng)箱直至蜜蜂幼蟲發(fā)育完全。所述接種時，接種的對象優(yōu)選為第四日齡的蜜蜂幼蟲；接種方法為在給第四日 齡蜜蜂幼蟲更換飼料時，將混有孢子的飼料飼喂蜜蜂24小時，第五日齡及隨后就轉為正常 的沒有孢子的飼料飼喂。本發(fā)明的顯著優(yōu)點
1.本發(fā)明在實驗室內飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲的方法，該方法可以讓我們
不依賴于蜂群，在實驗室內開展蜜蜂幼蟲的飼喂工作。2.蜜蜂染白堊病幼蟲體內形成了大量的包囊和孢子，其分 布是不均勻的，為保證孢子的均一和飼喂蜜蜂后每只蜜蜂的攝入量一致，要制備分散良好 的球囊菌孢子懸浮液。本發(fā)明提供了一種制備接種用蜜蜂球囊菌孢子的方法。3.本發(fā)明提供了一種給蜜蜂幼蟲接種蜜蜂球囊菌孢子的 安全有效方法。自然情況下，蜜蜂球囊菌對蜜蜂幼蟲的感染就是通過污染了的食物進入蜜 蜂體內的。本發(fā)明利用這一特性，將球囊菌孢子混入蜜蜂的飼料內，通過蜜蜂自身的取食行 為自動攝入球囊菌孢子，省力、有效。4.本發(fā)明提供了一種為便于球囊菌生長而采取的對蜜蜂 幼蟲的處理方法。本發(fā)明中在蜜蜂幼蟲接種球囊菌孢子后，進行適當的低溫處理，大大促進
4了球囊菌的生長速度和效率。


圖1為在實驗室利用24孔板飼養(yǎng)的不同發(fā)育時期的蜜蜂幼蟲；其中A、B、C、D、E 分別表示第3、4、5、6日齡和剛化蛹的蜜蜂幼蟲。圖2為用實驗室飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲培養(yǎng)的蜜蜂球囊菌。
具體實施例方式
本發(fā)明利用實驗室飼養(yǎng)的蜜蜂幼蟲培養(yǎng)蜜蜂球囊菌的方法，包括以下步驟 蜜蜂幼蟲的實驗室飼養(yǎng)
實驗室內利用24孔板來飼喂蜜蜂的幼蟲。飼料配方為蜂王漿占50%，無菌水37%，蜂蜜 12%，酵母浸膏1%。培育條件溫度為34. 5°C，濕度>80%。具體操作方法為按配方調制能 夠完成一次發(fā)育的蜜蜂的人工飼料量，按蜜蜂日齡的大小加適量飼料到24孔板內，剩余飼 料至于冰箱內保存。從蜂箱內移取2日齡的蜜蜂幼蟲至盛有飼料的24孔板內，置于培養(yǎng)箱 內培養(yǎng)，以后每24小時，重新制備一份加有飼料的24孔板且把蜜蜂幼蟲移入，放入培養(yǎng)箱 直至蜜蜂幼蟲發(fā)育完全，化蛹后，用濾紙吸干體表的飼料后，置入墊有3層濾紙的24孔板內 完成蛹期的發(fā)育，具體培養(yǎng)的各日齡蜜蜂幼蟲見圖1，可見各日齡的蜜蜂幼蟲均能正常生長 發(fā)育并化蛹。利用這種方法培養(yǎng)的蜜蜂幼蟲都能夠正常發(fā)育，與在蜂箱內哺育的蜜蜂幼蟲 發(fā)育情況基本一致。在此基礎上可以開展許多以蜜蜂幼蟲為對象的活體實驗，避免了蜂群 內諸多不可控制因素的制約。接種孢子的準備
接種用的孢子來自于患病蜂群的染病幼蟲，采集這些形成孢子的染病幼蟲，用勻漿器 磨碎幼蟲，移至加適量滅菌水的燒杯內，加玻璃珠，在磁力攪拌器上攪拌4小時以上，制備 成接種用的孢子母液。這一過程旨在將蜜蜂幼蟲體內形成的包囊打破，釋放內部大量的孢 子。完全釋放后，在生物顯微鏡下進行孢子計數，確定孢子母液的濃度后備用。接種
將準備好的孢子母液加入調配好的蜜蜂飼料內，使孢子終濃度為IO4-IO6個/毫升。接 種的對象為第3-5日齡的蜜蜂幼蟲(若接種幼蟲太小，容易引起蜜蜂的死亡，且球囊菌隨后 的生長不一致)。方法為給達到接種日齡的蜜蜂幼蟲更換飼料時就將混有孢子的飼料飼喂 蜜蜂24小時即可，隨后就轉為正常的沒有孢子的飼料飼喂。處理
由于蜜蜂球囊菌的生長受溫度的影響較大，正常蜜蜂幼蟲的培養(yǎng)溫度為34. 5°C。本發(fā) 明研究發(fā)現只需30°C短至2個小時的低溫處理就足以大大促進蜜蜂球囊菌的生長。這里我 們采用30°C處理4個小時比較穩(wěn)妥的低溫處理，之后轉入正常的培養(yǎng)箱內進行飼養(yǎng)。這樣接種球囊菌孢子飼養(yǎng)的蜜蜂幼蟲，攝入孢子的數量可以得到很好的控制，且 在不同的蜜蜂幼蟲之間基本沒有差異，可以在任何日齡隨意對蜜蜂幼蟲接種。接種的蜜蜂 幼蟲可以完成幼蟲期的發(fā)育，在進入預蛹期(第六日齡)之后，接入的孢子開始萌發(fā)并迅速 在蜜蜂體內生長，在第7日齡基本所有的蜜蜂幼蟲都長滿了球囊菌的菌絲(如圖2所示)。通 過這種方式培養(yǎng)蜜蜂球囊菌成功率極高，全部蜜蜂幼蟲均可成功的長出蜜蜂球囊菌菌絲， 且其生長情況基本一致。為相關的研究與實踐工作提供了較好的素材與方法，可以在球囊菌侵染蜜蜂的不同階段取樣，研究蜜蜂球囊菌侵染機理和過程。
權利要求
一種利用實驗室飼養(yǎng)的蜜蜂幼蟲培養(yǎng)蜜蜂球囊菌的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)蜜蜂幼蟲的實驗室飼養(yǎng)利用24孔板來飼喂蜜蜂的幼蟲直至蜜蜂幼蟲發(fā)育完全；培養(yǎng)箱培育條件溫度為34.5℃，濕度≥80%；化蛹后，用濾紙吸干體表的飼料后，置入墊有濾紙的24孔板內完成蛹期的發(fā)育；(2)接種孢子的準備接種用的孢子來自于患病蜂群的染病幼蟲，采集這些形成孢子的染病幼蟲，用勻漿器磨碎幼蟲，移至加有滅菌水的燒杯內，加玻璃珠，攪拌4小時以上，制備成接種用的孢子母液；(3)接種將準備好的孢子母液加入調配好的蜜蜂幼蟲的飼料內，使孢子終濃度為104 106個/毫升；接種的對象為第3 5日齡的蜜蜂幼蟲；接種方法為在給第3 5日齡的蜜蜂幼蟲更換飼料時，將混有孢子的飼料飼喂蜜蜂24 小時，隨后就轉為正常的沒有孢子的飼料飼喂；(4)低溫處理接種時采用30℃處理4個小時的低溫處理，之后轉入正常的培養(yǎng)箱內進行飼養(yǎng)。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述飼喂蜜蜂幼蟲的飼料配方按重量比 為蜂王漿50%，無菌水37%，蜂蜜12%，酵母浸膏1%。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述蜜蜂幼蟲的實驗室飼養(yǎng)具體方法為 從蜂箱內移取2日齡的蜜蜂幼蟲至盛有蜜蜂幼蟲飼料的24孔板內，置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，以 后每24小時，重新制備一份加有飼料的24孔板且把蜜蜂幼蟲移入，放入培養(yǎng)箱直至蜜蜂幼 蟲發(fā)育完全。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述接種時，接種的對象為第3-5日齡的 蜜蜂幼蟲；接種方法為在給第3-5日齡蜜蜂幼蟲更換飼料時，將混有孢子的飼料飼喂蜜蜂 24小時，隨后就轉為正常的沒有孢子的飼料飼喂。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用實驗室飼養(yǎng)的蜜蜂幼蟲培養(yǎng)蜜蜂球囊菌的方法，該方法通過蜜蜂幼蟲的實驗室飼養(yǎng)，利用蜜蜂球囊菌孢子對蜜蜂接種，并在低溫下處理，接種的蜜蜂幼蟲可以完成幼蟲期的發(fā)育。通過這種方式培養(yǎng)蜜蜂球囊菌成功率極高，全部蜜蜂幼蟲均可成功的長出蜜蜂球囊菌菌絲，且其生長情況基本一致。本發(fā)明的方法省力、有效，可以在短時間內批量獲得生長狀態(tài)基本一致的蜜蜂球囊菌，為相關的研究與實踐工作提供了較好的素材與方法。
文檔編號C12N1/14GK101946752SQ20101027677
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月9日 優(yōu)先權日2010年9月9日
發(fā)明者李江紅, 梁勤, 鄭志陽, 陳大福 申請人:福建農林大學