專利名稱：一種新型分離宮頸脫落細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離宮頸脫落細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于乳腺癌，居女性惡性腫瘤的第二 位，其死亡率居?jì)D科惡性腫瘤的首位。近年來，宮頸癌患者以每年2% 4%的速度增長，與 此同時，相對于發(fā)達(dá)國家，在發(fā)展中國家，由于宮頸篩查工作不完善，宮頸癌的發(fā)病率是發(fā) 達(dá)國家的6倍，并且其中80%的患者確診時已是浸潤癌，而宮頸癌存在著一個較長的可逆 轉(zhuǎn)癌前病變期，所以早期發(fā)現(xiàn)癌前病變進(jìn)行干預(yù)治療是防治宮頸癌的關(guān)鍵?，F(xiàn)階段篩查宮頸癌的主要方法包括宮頸刮片脫落細(xì)胞學(xué)檢查、宮頸上皮液基細(xì)胞 學(xué)檢查等，但也存在一定的局限性，在上述兩種細(xì)胞學(xué)檢查中，涂片內(nèi)所見的癌前病變是從 良性到惡性的一個漸變階段的綜合征象，包括1、宮頸涂片內(nèi)的角化細(xì)胞數(shù)目持續(xù)增多，涂 片的細(xì)胞呈雌激素持續(xù)影響的現(xiàn)象，角化程度相當(dāng)于周期中期排卵前的最高水平；2、有異 型的或早熟的角化細(xì)胞；3、細(xì)胞巨大，或細(xì)胞細(xì)?。?、核異常巨大，活躍而不成熟，核染色 質(zhì)濃染，胞漿內(nèi)常有顆粒；5、有各層鱗狀上皮細(xì)胞的核分葉與多核；6、底層細(xì)胞增生，核周 常有暈；7、嚴(yán)重的儲備細(xì)胞增生。目前臨床上采用的較為廣泛的宮頸上皮液基細(xì)胞學(xué)檢查在標(biāo)本程序化的處理過 程中，細(xì)胞只經(jīng)過一次分離處理就直接進(jìn)入制片步驟，雖然也在一定程度上分離了粘液、血 細(xì)胞、炎性細(xì)胞等，但制片后，鏡下仍可見部分粘液，尤其是炎性的中性粒細(xì)胞，影響異常細(xì) 胞的檢出率，假陰性、假陽性以及不滿意涂片率較高，不能為臨床提供較為準(zhǔn)確的輔助診斷
fn息ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為避免上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足之處，提供一種新型分離宮頸脫落細(xì) 胞的方法，以期提高制成涂片的質(zhì)量，幫助檢驗(yàn)醫(yī)師得出準(zhǔn)確結(jié)論，以及輔助臨床醫(yī)師的診 斷。本發(fā)明解決技術(shù)問題采用如下技術(shù)方案
本發(fā)明分離宮頸脫落細(xì)胞的方法的特點(diǎn)是按如下步驟操作
a、取宮頸脫落細(xì)胞于PBS磷酸緩沖液中，渦旋混勻得細(xì)胞懸液；
b、將步驟a所得細(xì)胞懸液加入粘液分離液中；經(jīng)離心、棄上清液后再次加入PBS磷酸緩 沖液，重懸沉淀物，得到重懸的細(xì)胞懸液；
C、將步驟b所得重懸的細(xì)胞懸液加入中性粒細(xì)胞分離液Ficoll中，經(jīng)離心、棄上清液， 所得沉淀物即為純凈細(xì)胞。本發(fā)明分離宮頸脫落細(xì)胞的方法的特點(diǎn)也在于
所述步驟a中的PBS磷酸緩沖液的體積百分比濃度為10%，用量為5ml ； 所述步驟b中的粘液分離液用量為3ml ；用于重懸沉淀物的PBS磷酸緩沖液按體積百
3分比的濃度為10%，用量為3ml ；
所述步驟c中的中性粒細(xì)胞分離液Ficoll的用量為3ml。本發(fā)明分離宮頸脫落細(xì)胞的方法的特點(diǎn)還在于
所述步驟b中離心的條件為100-4000g，時間為10秒-10分鐘；所述步驟c中的離心 條件為200-10000g，時間為10-30分鐘。所述步驟b中離心的條件為200g，時間為2分鐘；所述步驟c中的離心條件為 2000g，時間為20分鐘。所述各步驟均在常溫下進(jìn)行。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在
1、本發(fā)明通過兩步法分離純化細(xì)胞，大大提高了制成涂片的質(zhì)量，提高臨床宮頸脫落 細(xì)胞標(biāo)本分離的清晰度；
2、本發(fā)明方法適合于大規(guī)模的細(xì)胞分離，其效果穩(wěn)定、可靠；
3、以本發(fā)明方法分離的細(xì)胞可以直接用于基因組提取、核型分析、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)基 因、細(xì)胞誘導(dǎo)分化、細(xì)胞治療等研究，同時也可用于密度梯度分離液制備、不同質(zhì)量分子或 化合物的分離等用途；
4、本發(fā)明方法在細(xì)胞生物學(xué)、功能基因組學(xué)、臨床治療等領(lǐng)域中具有較高的實(shí)際應(yīng)用 價值，市場前景廣闊；尤其為子宮頸癌癌前病變的初篩以及防治提供有力的指導(dǎo)意義，臨床 價值深遠(yuǎn)。


圖la、圖Ib為使用常規(guī)液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)LCT制備的宮頸脫落細(xì)胞形態(tài)學(xué)標(biāo)本； 圖2a、圖2b為用本發(fā)明方法制備的宮頸脫落細(xì)胞形態(tài)學(xué)標(biāo)本；
圖3為利用本發(fā)明方法分離出的人子宮頸脫落細(xì)胞在體外培養(yǎng)時的圖片。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例中的分離宮頸脫落細(xì)胞的方法按如下步驟操作
1、使用宮頸脫落細(xì)胞專用刷，刷頭輕壓于宮頸口，順同一方向旋轉(zhuǎn)2-3圈，以此刷取宮 頸脫落細(xì)胞，將刷取物置于5ml的體積百分比濃度為10%的PBS磷酸緩沖液中，渦旋混勻得 細(xì)胞懸液；
2、將步驟1所得細(xì)胞懸液沿管壁加入3ml的粘液分離液中；經(jīng)離心、棄上清液后，向離 心后的沉淀物中加入3ml體積百分比濃度為10%的PBS磷酸緩沖液，重懸沉淀物，得到重懸 的細(xì)胞懸液；
3、將步驟2所得重懸的細(xì)胞懸液沿管壁加入3ml中性粒細(xì)胞分離液Ficoll中，經(jīng)離 心、棄上清液，離心后的沉淀物即為所得的純凈細(xì)胞。以上各步驟均在常溫下進(jìn)行；步驟2中離心的條件為100-4000g，優(yōu)先為 200g;離心時間為10秒-10分鐘，優(yōu)選的離心時間是2分鐘；步驟3中的離心條件為 200-10000g，優(yōu)選為2000g，離心時間為10-30分鐘，優(yōu)選的離心時間為20分鐘，所用的粘液 分離液及Ficoll液均為市售的細(xì)胞分離液。使用本實(shí)施例方法，在七天的時間內(nèi)完成對將近210對宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本的分離操作，95%以上的粘液、血液和中性粒細(xì)胞等混雜成分可被分離除去，獲得了滿意的效果。圖la、lb為使用常規(guī)液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)LCT制備的宮頸脫落細(xì)胞形態(tài)學(xué)標(biāo)本，脫落 細(xì)胞被較多的中性粒細(xì)胞掩蓋，使閱片清晰度下降；由圖Ia和圖Ib兩圖相比，可見由常規(guī) 液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)LCT制出的標(biāo)本效果不穩(wěn)定。圖2a、圖2b為用本發(fā)明方法制備的宮頸脫落細(xì)胞形態(tài)學(xué)標(biāo)本，粘液、血液以及中 性粒細(xì)胞的分離清除率達(dá)到95%以上，且效果穩(wěn)定可靠。對本實(shí)施例分離所得的子宮頸鱗狀上皮細(xì)胞用常規(guī)的方法(即BSA-DMEM培養(yǎng)液+ 青霉素、鏈霉素10萬U/ml+2. 5 μ g/ml兩性霉素B)進(jìn)行原代培養(yǎng)，在細(xì)胞鋪板后一天用顯 微鏡觀察，觀察結(jié)果如圖3所示。觀察結(jié)果顯示細(xì)胞在分離后生長狀態(tài)良好，形態(tài)學(xué)上具有 完整性，使宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本中存在的粘液、血液以及中性粒細(xì)胞得到有效的去除，增加原 代培養(yǎng)的純凈度，提高后續(xù)實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量。
權(quán)利要求
一種新型分離宮頸脫落細(xì)胞的方法，其特征是按如下步驟操作a、取宮頸脫落細(xì)胞于PBS磷酸緩沖液中，渦旋混勻得細(xì)胞懸液；b、將步驟a所得細(xì)胞懸液加入粘液分離液中；經(jīng)離心、棄上清液后再次加入PBS磷酸緩沖液，重懸沉淀物，得到重懸的細(xì)胞懸液；c、將步驟b所得重懸的細(xì)胞懸液加入中性粒細(xì)胞分離液Ficoll中，經(jīng)離心、棄上清液，所得沉淀物即為純凈細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離宮頸脫落細(xì)胞的方法，其特征是所述步驟a中的PBS磷酸緩沖液的體積百分比濃度為10%，用量為5ml ；所述步驟b中的粘液分離液用量為3ml ；用于重懸沉淀物的PBS磷酸緩沖液按體積百 分比的濃度為10%，用量為3ml ；所述步驟c中的中性粒細(xì)胞分離液Ficoll的用量為3ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離宮頸脫落細(xì)胞的方法，其特征是所述步驟b中離心的條 件為:100-4000g,時間為10秒-10分鐘；所述步驟c中的離心條件為:200-10000g,時間為 10-30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離宮頸脫落細(xì)胞的方法，其特征是所述步驟b中離心的條 件為200g，時間為2分鐘；所述步驟c中的離心條件為2000g，時間為20分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離宮頸脫落細(xì)胞的方法，其特征是所述各步驟均在常溫下 進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型分離宮頸脫落細(xì)胞的方法，其特征是首先取宮頸脫落細(xì)胞于PBS磷酸緩沖液中，渦旋混勻得細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液加入粘液分離液中；經(jīng)離心、棄上清液后再次加入PBS磷酸緩沖液，重懸沉淀物，得到重懸的細(xì)胞懸液；將重懸的細(xì)胞懸液加入中性粒細(xì)胞分離液Ficoll中，經(jīng)離心、棄上清液，得離心后的沉淀物即為純凈細(xì)胞。本發(fā)明方法極大地純化了臨床提取的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本，操作步驟簡便，適合于大規(guī)模的細(xì)胞分離，效果穩(wěn)定、可靠，可以得到高純度的目的細(xì)胞，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價值，市場前景廣闊。
文檔編號C12N5/071GK101914486SQ20101027686
公開日2010年12月15日 申請日期2010年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月9日
發(fā)明者馮定慶, 凌斌, 衛(wèi)瑩, 周穎, 姚鳳球, 朱園園, 朱靖, 李彩榮, 李敏, 沈國棟, 王青元, 許乾乾, 雷蕾 申請人:安徽省立醫(yī)院