專利名稱：一種測定維生素h的生物學(xué)檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定維生素H的生物學(xué)檢測方法。
背景技術(shù)：
維生素H，又稱生物素，是人體不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，常被用作醫(yī)藥及食品添加劑等。隨著人們對維生素H生理功能的認(rèn)識，維生素H已廣泛地用于畜牧業(yè)生產(chǎn)和研究中，來提高家禽的生產(chǎn)性能和飼料利用率。此外，維生素H還應(yīng)用在非放射性標(biāo)記技術(shù)及發(fā)酵工業(yè)等領(lǐng)域。目前檢測維生素H的方法主要有微生物法、高效液相色譜、熒光法和酶聯(lián)免疫法等。報道的微生物法有比濁法和濾紙片法。但是現(xiàn)有的檢測結(jié)果來看，其檢測結(jié)果準(zhǔn)確度和靈敏度不令人滿意，誤差大，并且需要龐大的儀器和設(shè)備。而管碟法則操作簡單，不需要昂貴的食品，但其一般常用于抗生素類物質(zhì)的檢測，而在維生素H含量檢測方面還未有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種操作簡單，準(zhǔn)確度和靈敏度高，不需要昂貴的檢測儀器的一種測定維生素H的生物學(xué)檢測方法，為了實現(xiàn)該技術(shù)目的，技術(shù)方案如下一種測定維生素H含量的生物檢測方法，包含以下步驟a.配制指示菌懸液；b.在培養(yǎng)皿中加入步驟a中配制好的指示菌懸液，將若干個濃度已知的維生素H 的標(biāo)準(zhǔn)溶液放入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)一定時間后，測量出指示菌生長圈的生長直徑，繪制出維生素H的濃度的對數(shù)與指示菌生長直徑的標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算出回歸方程；c.將未知濃度的維生素H的溶液經(jīng)過a b的步驟處理后得出的指示菌生長直徑代入步驟b中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，查出未知濃度的維生素H的濃度，或通過回歸方程計算。如上所述的測定維生素H含量的生物檢測方法，其中步驟a中的配制指示菌懸液的步驟為取產(chǎn)氨短桿菌保藏斜面，接種至新鮮牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面，30°C培養(yǎng)18 20h,連續(xù)活化2 3次后，用無菌生理鹽水洗下菌苔，并適當(dāng)稀釋，使菌懸液在600nm波長處的吸光度為1.5左右。如上所述的測定維生素H含量的生物檢測方法，其中在步驟b中的已知濃度的維生素 H 的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別為 15 μ g/L、30 μ g/L、45 μ g/L、60 μ g/L、75 μ g/L、90 μ g/L、105 μ g/ L、120 μ g/L、135 μ g/L的9個濃度維生素H標(biāo)準(zhǔn)溶液。如上所述的測定維生素H含量的生物檢測方法，其中步驟b中培養(yǎng)指示菌的步驟為在90mm的無菌培養(yǎng)皿中先加入20mL下層培養(yǎng)基，凝固后再加入5mL含適量指示菌液的上層培養(yǎng)基，在凝固的培養(yǎng)基平板上等距離均勻放置4個牛津杯，在平板相對的2個牛津杯中各加入標(biāo)記為中心濃度的75 μ g/L的維生素H標(biāo)準(zhǔn)液，另外2個加入其它一種濃度的維生素H標(biāo)準(zhǔn)液，加樣量均為200 μ L，所述的9種維生素H標(biāo)準(zhǔn)液，每個濃度1式3皿，30°C培養(yǎng)48h，分別計算全部培養(yǎng)皿中心濃度生長圈平均直徑，每種濃度標(biāo)準(zhǔn)液培養(yǎng)皿中心濃度生長圈的平均直徑及其各自濃度標(biāo)準(zhǔn)液生長圈的平均直徑，全部培養(yǎng)皿中心濃度生長圈平均
3直徑與每種濃度標(biāo)準(zhǔn)液培養(yǎng)皿中心濃度生長圈的平均直徑之差與各自濃度標(biāo)準(zhǔn)液生長圈的平均直徑之和是標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中的指示菌生長圈的生長直徑。如上所述的測定維生素H含量的生物檢測方法，其中所述的下層培養(yǎng)基組成為 葡萄糖 1. Og/mL,硫酸胺 0. 4/mL,尿素 0. 1/mL, K2HPO4O. 13/mL, MgSO4O. 03/mL,瓊脂 2/mL， ZnCl28mg/L, VB15mg/L, D-泛酸鈣 lOmg/L, pH7. 2 7. 4。如上所述的測定維生素H含量的生物檢測方法，其中在步驟b中加入的上層指示菌與下層培養(yǎng)基的體積比為8%。本方法靈敏度和準(zhǔn)確度較高，RSD4. 984% 7. 573%，結(jié)果較好，可以滿足一般檢測維生素H濃度需要。且該方法簡便快速，無需大型儀器便于推廣應(yīng)用。


圖1為生物素濃度對數(shù)值與生長圈直徑之間的線性曲線。
具體實施例方式下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細(xì)解釋。本具體實施例中使用的材料或試劑來源如下(一)材料供試菌種產(chǎn)氨短桿菌(Corynebcterium ammoniagenes) 1. 0925，購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。培養(yǎng)基產(chǎn)氨短桿菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。檢測平板采用合成培養(yǎng)基。下層培養(yǎng)基(g/dL)葡萄糖 1. 0，硫酸胺 0. 4，尿素 0. 1，K2HPO4O. 13，MgSO4O. 03，瓊脂 2，ZnCl28mg/ L，VB^mg/L, D-泛酸鈣10mg/L, ρΗ7· 2 7. 4。上層培養(yǎng)基除瓊脂1. 4g/dL含量外，其余成分同下層培養(yǎng)基。(二)試劑D_維生素H標(biāo)準(zhǔn)品(上海三杰生物技術(shù)有限公司)；瓊脂為日本進口分裝(上海思吉生物制品有限公司)；Vbi (BR，上海伯奧生物科技有限公司)；D-泛酸鈣(BR， 中國醫(yī)藥集團上海化學(xué)試劑公司)；其余均為分析純試劑。主要儀器設(shè)備生物潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；756型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)，Icm比色皿；生化培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海申騰生物技術(shù)有限公司)；電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；手提式壓力蒸氣滅菌器(上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司)。檢測實施例一 . (1)指示菌懸液的制備取產(chǎn)氨短桿菌保藏斜面，接種至新鮮牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面，30°C培養(yǎng)18 20h。連續(xù)活化2 3次后，用無菌生理鹽水洗下菌苔，并適當(dāng)稀釋，使菌懸液在600nm波長處的吸光度為1. 5左右。(2)維生素H標(biāo)準(zhǔn)液的制備取維生素H標(biāo)準(zhǔn)品適量，精確稱量，用蒸餾水稀釋制備 15、30、45、60、75、90、105、120、135μ g/L 的 9 個濃度維生素 H 標(biāo)準(zhǔn)溶液。二 .標(biāo)準(zhǔn)曲線制作(1)在90mm的無菌培養(yǎng)皿中先加入20mL下層培養(yǎng)基，凝固后再加入5mL含適量指示菌液的上層培養(yǎng)基。在凝固的培養(yǎng)基平板上等距離均勻放置4個牛津杯，在平板相對的2個牛津杯中各加入75 μ g/L的維生素H標(biāo)準(zhǔn)液(中心濃度)，另外2個加入其它一種濃度的維生素H標(biāo)準(zhǔn)液，加樣量均為200L。步驟一中所述的9種維生素H 標(biāo)準(zhǔn)液，每個濃度1式3皿，30°C培養(yǎng)48h。①測定維生素H時，在雙層平板的上層培養(yǎng)基中加入菌懸液的量會影響生長圈的大小和質(zhì)量，為了確定培養(yǎng)基中指示菌液的加入量，按步驟一中的指示菌液制備方法制作的菌懸液，分別以4 %、6 %、8 %、10 %和12 %的體積比加入上層培養(yǎng)基中，按1. 2. 3標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法制作培養(yǎng)皿，培養(yǎng)結(jié)果見表1。由表1可見菌濃度為8%以上時，指示菌生長較密，生長圈清晰，因此本實驗確定菌液加入量為8%。表一菌懸液加量對生長圈生長情況的影響
懸菌液加量/%平板生長圈生長情況、4模糊6較清晰8清晰10清晰12清晰由表可以看出菌濃度為8%以上時，指示菌生長較密，生長圈清晰，因此本實驗確定菌液加入量為8%。(2)測量指示菌生長圈直徑大小，分別計算全部培養(yǎng)皿中心濃度生長圈平均直徑 (T)，每種濃度標(biāo)準(zhǔn)液培養(yǎng)皿中心濃度生長圈的平均直徑Ui)及其各自濃度標(biāo)準(zhǔn)液生長圈的平均直徑4。為減少不同培養(yǎng)皿及不同批次檢測的誤差，各濃度維生素H標(biāo)準(zhǔn)液生長圈的平均直徑Cli需要進行修正，修正直徑Di的計算方法為Di = ‘+(Τ-、)。以維生素H濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，生長圈平均修正直徑為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)根據(jù)步驟二 .(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作中的方法，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。由圖1 可見，除最后2點(即120和135 μ g/L兩點)有所偏離外，其余各點濃度基本成直線關(guān)系。 當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的維生素H濃度取值范圍分別為15 90 μ g/L、15 105 μ g/L、15 120 μ g/ L、15 135 μ g/L,得到的各回歸方程見表2。由圖1和表2可見，降低維生素H上限濃度， 縮小維生素H檢測范圍，可提高可信限率和r的值。當(dāng)維生素H濃度范圍取15 90 μ g/L 時，得到劑量濃度(C)的對數(shù)與生長圈直徑(D)線性關(guān)系較良好，因此本具體實施例確定維生素H濃度范圍取15 90 μ g/L，其線性方程為D = 16. 3281ogC_9. 8654, r = 0. 9933。表二 不同的線性范圍和回歸系數(shù)
權(quán)利要求
1.一種測定維生素H含量的生物檢測方法，包含以下步驟a.配制指示菌懸液；b.在培養(yǎng)皿中加入步驟a中配制好的指示菌懸液，將若干個濃度已知的維生素H的標(biāo)準(zhǔn)溶液放入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)一定時間后，測量出指示菌生長圈的生長直徑，繪制出維生素H 的濃度的對數(shù)與指示菌生長直徑的標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算出回歸方程；c.將未知濃度的維生素H的溶液經(jīng)過a b的步驟處理后得出的指示菌生長直徑代入步驟b中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，查出未知濃度的維生素H的濃度，或通過回歸方程計算。
2.如權(quán)利要求1所述的測定維生素H含量的生物檢測方法，特征在于，步驟a中的配制指示菌懸液的步驟為取產(chǎn)氨短桿菌保藏斜面，接種至新鮮牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面，30°C 培養(yǎng)18 20h，連續(xù)活化2 3次后，用無菌生理鹽水洗下菌苔，并適當(dāng)稀釋，使菌懸液在 600nm波長處的吸光度為士 1.5。
3.如權(quán)利要求1所述的測定維生素H含量的生物檢測方法，特征在于在步驟b中的已知濃度的維生素H的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別為15 μ g/L,30 μ g/L,45 μ g/L,60 μ g/L,75 μ g/L, 90 μ g/L、105 μ g/L、120 μ g/L、135 μ g/L的9個濃度維生素H標(biāo)準(zhǔn)溶液。
4.如權(quán)利要求1所述的測定維生素H含量的生物檢測方法，特征在于，步驟b中培養(yǎng)指示菌的步驟為在90mm的無菌培養(yǎng)皿中先加入20mL下層培養(yǎng)基，凝固后再加入5mL含適量指示菌液的上層培養(yǎng)基，在凝固的培養(yǎng)基平板上等距離均勻放置4個牛津杯，在平板相對的2個牛津杯中各加入標(biāo)記為中心濃度的75 μ g/L的維生素H標(biāo)準(zhǔn)液，另外2個加入其它一種濃度的維生素H標(biāo)準(zhǔn)液，加樣量均為200 μ L，所述的9種維生素H標(biāo)準(zhǔn)液，每個濃度 1式3皿，30°C培養(yǎng)48h，分別計算全部培養(yǎng)皿中心濃度生長圈平均直徑，每種濃度標(biāo)準(zhǔn)液培養(yǎng)皿中心濃度生長圈的平均直徑及其各自濃度標(biāo)準(zhǔn)液生長圈的平均直徑，全部培養(yǎng)皿中心濃度生長圈平均直徑與每種濃度標(biāo)準(zhǔn)液培養(yǎng)皿中心濃度生長圈的平均直徑之差與各自濃度標(biāo)準(zhǔn)液生長圈的平均直徑之和是標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中的指示菌生長圈的生長直徑。
5.如權(quán)利要求4所述的測定維生素H含量的生物檢測方法，特征在于，所述的下層培養(yǎng)基組成為葡萄糖 1. Og/mL，硫酸胺 0. 4/mL，尿素 0. 1/mL，K2HPO4O. 13/mL，MgSO4O. 03/mL，瓊脂 2/mL, ZnCl28mg/L, VB^mg/L, D-泛酸鈣 lOmg/L, ρΗ7· 2 7· 4。
6.如權(quán)利要求1所述的測定維生素H含量的生物檢測方法，特征在于在步驟b中加入的上層指示菌與下層培養(yǎng)基的體積比為8%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定維生素H的生物學(xué)檢測方法，通過維生素H濃度的對數(shù)值與生長圈直徑的線性關(guān)系，建立一種快速簡便檢測維生素H含量的方法。本方法可以為微生物法檢測維生素H含量提供一種新的選擇，并且靈敏度和準(zhǔn)確度較高，RSD4.984％～7.573％，檢測結(jié)果可以滿足一般檢測維生素H濃度需要，該方法簡便快速，無需大型儀器便于推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/02GK102399849SQ20101027744
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月9日
發(fā)明者丁國才 申請人:上海海帝園藝有限公司