專利名稱：一種檢測(cè)土壤微生物多樣性的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物分析的方法，尤其涉及一種檢測(cè)土壤微生物多樣性的分析方法。
背景技術(shù)：
目前，對(duì)土壤微生物的研究主要是借助了分子生物學(xué)的手段，直接從土壤中獲得微生物的宏基因組DNA進(jìn)行分析，該策略使環(huán)境微生物多樣性分析成為一種盡可能全面的方法。近年來，關(guān)于土壤宏基因組DNA提取方法的報(bào)道很多。然而主要側(cè)重于提取土壤中細(xì)菌群落的總DNA的提取，較少關(guān)注土壤中真菌群落總DNA的提取及其提取效果。來自環(huán)境中的樣品含有非常復(fù)雜的成分，尤其是土壤中的腐質(zhì)酸類物質(zhì)在提取過程中不能去除掉， 直接影響后續(xù)的PCR擴(kuò)增。所以大多數(shù)方法初提的DNA都要經(jīng)過回收純化，然而回收的過程或多或少的會(huì)損失部分DNA，尤其是大片段的DNA回收率比較低，有人利用通過透析袋回收純化，純化回收率只能夠達(dá)到65. 34%，仍然喪失了一部DNA，對(duì)于實(shí)際上存在量本來就少的微生物種類后續(xù)的檢測(cè)中就很難檢測(cè)到，因而不能真實(shí)地反土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)。因此，如何減少提取以后的DNA損失是有待于解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決以上的問題而提出一種檢測(cè)結(jié)果清確度高的檢測(cè)土壤微生物多樣性的分析方法，其技術(shù)方案如下一種檢測(cè)土壤微生物多樣性的分析方法，包括以下步驟(1)從土壤中進(jìn)行DNA提??；(2)對(duì)步驟(1)中的DNA提取液中測(cè)出土壤中的DNA的濃度和純度；(3)將土壤中提取的DNA進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增；(4)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳分析。如上所述的一種檢測(cè)土壤微生物多樣性的分析方法，其中提取DNA的條件如下 稱土樣于離心管中，加提取液渦旋混勻后置于冰箱靜止或液氮速凍，取出水浴融化，反復(fù)凍融，加蛋白酶K，搖床振蕩，加SDS，水浴在室溫離心，收集上清，盡可能的不要取到上清與土壤沉淀之間的雜質(zhì)，沉淀加提取液和20% SDS，渦旋水浴一定的時(shí)間，室溫下離心，合并上清；上清中加聚己二醇800混勻，沉淀過夜；然后離心，棄上清，沉淀加入IXTE溶解；用等體積的氯仿異戊醇抽提，離心后收集上清，重復(fù)一次；用NaAc和異丙醇室溫沉淀，離心后棄上清；沉淀用70%乙醇洗滌，離心后棄上清，晾干，加超純水溶解。如上所述的一種檢測(cè)土壤微生物多樣性的分析方法，其中步驟O)中的檢測(cè)方法為取所提取的DNA，0.7%瓊脂糖檢測(cè)，以λ mixl9 (i^rmentas)為Maker，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的0D26Q、OD230> OD260/OD230的值及DNA的純度。如上所述的一種檢測(cè)土壤微生物多樣性的分析方法，其中在步驟(3)中的PCR儀反應(yīng)條件為反應(yīng)總體積為20 μ L 模板DNA lng, PCR buffer 2 μ L，Mg2+2 μ L，引物(10 μ Μ)各 0. 2 μ L，BSA (10mg/mL) 2 μ L, dNTPs (各 IOmM) 0. 3L, Taq 酶(5U/L) 0. 2 μ L, ddH20 補(bǔ)齊至 20 μ L。長(zhǎng)片段擴(kuò)增應(yīng)程序94% 4min ；94°C 40S，46°C 40S，72°C 40S，共循環(huán) 38 次 72°C延伸 IOmin ；4°C保存；取上述的一次擴(kuò)增產(chǎn)物1 μ L，PCR buffer 5 μ L，Mg2+5 μ L，弓丨物(10 μ Μ)各 0. 5μ L, dNTPs (各 IOmM) 0. 7 μ L, BSA (10mg/mL) 2 μ L, Taq 酶(5U/ μ L) 1 μ L, ddH20 補(bǔ)齊至 50μ L。采用降落式 PCR 反應(yīng)程序94°C 4min ；94°C 30S，63°C 30S，72°C 30S，共循環(huán) 15 次；94°C 30S,63°C 30S(每循環(huán) 1 次下降 1)，72°C 30S，共循環(huán) 13 次；94°C 30S,52°C 30S, 72°C 30S ；72°C延伸7min ；4°C保存。擴(kuò)增產(chǎn)物利用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，DL2000作為 Marker ；細(xì)菌16SrDNA 的擴(kuò)增引物 F27 5 ‘ -AGAGTTTGATCMTGGCTCA-3 ‘ ；R1522
5‘ -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 ‘，再利用 V3 區(qū)的引物 F357-GC 5 ‘ -CGCCCGCCGCGCGCGGCG GGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3 ‘和 R518 :5 ‘ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 ‘ 擴(kuò)增 V3 區(qū)；真菌 18SrDNA 的擴(kuò)增引物為 Geoll 5' -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3‘，Geo2 5' -ACCTTGTTACGACTrrrrACTTCC-3‘；擴(kuò)增其中片段用 NS1-GC :5‘ -CGCCCGCCGCGCGCGGGC GGGGCGGGGGCACCGGCCAGTAGTCATATGCTTGTC-3' , NS2 5' -GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3‘。如上所述的一種檢測(cè)土壤微生物多樣性的分析方法，其中所述的提取液由以下組份組成:0. Imol Tris,0. Imol EDTA，0. Imol 磷酸緩沖液，1. 5mol NaCl, 1% CTAB, ρΗ8· O。如上所述的一種檢測(cè)土壤微生物多樣性的分析方法，其中所述的土壤為鹽土或堿性土壤。如上所述的一種檢測(cè)土壤微生物多樣性的分析方法，其中在步驟中的變性梯度凝膠電泳分析采用的基因突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離，分別用濃度為10%，
6%的丙稀酰胺，變性劑范圍為30 % 60 %，電泳150V，6h，EB染色15min后，凝膠成像系統(tǒng)，觀察拍照。利用本發(fā)明的方法對(duì)各種土壤進(jìn)行的檢測(cè)分析，其結(jié)果最接近真實(shí)的微生物狀態(tài)。因?yàn)樵谔幚淼倪^程中，提取的DNA溶液無損失，對(duì)研究土壤中的微生物提供了完美的解決方法。


圖1為四種不種質(zhì)地的土壤總DNA的瓊指糖凝膠檢測(cè)；1.藥用植物根際土，2.羅布泊湖鹽土，3.胡楊根際土，4.棉田土壤。圖2為16S rDNA V3區(qū)的擴(kuò)增結(jié)果和18S rDNA的擴(kuò)增結(jié)果；1、5為藥用植物根際土，2、6羅布泊湖鹽土，3、7胡楊根際土，4、8棉田土壤。圖3為16S rDNA的DGGE檢測(cè)結(jié)果；1.藥用植物根際土，2.羅布泊湖鹽土，3.胡楊根際土，4.棉田土壤。圖4為18S rDNA的DGGE檢測(cè)結(jié)果；1.藥用植物根際土，2.羅布泊湖鹽土，3.胡楊根際土，4.棉田土壤。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)解釋
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實(shí)施例1，土壤DNA的提取稱0. 5g四川省螺髻縣的藥用植物根際土(其pH值為4. 30) 土樣于2ml離心管中，加1. 3ml提取液(0. Imol Tris, 0. Imol EDTA，0. Imol磷酸緩沖液， 1. 5mol NaCl, 1% CTAB，pH8. 0)渦旋混勻后置于_80°C冰箱靜止30min (或液氮速凍5min)， 取出于65%水浴融化，反復(fù)凍融3次；加100 μ L蛋白酶K (lmg/ml)，37°C搖床振蕩30min，加 200 μ L濃度為20%的SDS，65°C水浴2h (期間每15 20min輕輕顛倒混勻)，室溫6000r/ min離心lOmin，收集上清，盡可能的不要取到上清與土壤沉淀之間的雜質(zhì)；沉淀加0. 75ml 提取液和 50μ L20% SDSji^m 10s65°C水浴 lOmin，室溫 6000r/min 離心 lOmin，合并上清； 上清中加0. 5倍體積的聚己二醇800 (50% PEG, 1. 5molNaCl)混勻，沉淀過夜；600r/min離心30min，棄上清，沉淀加入0.5ml 1 X TE溶解；用等體積的氯仿異戊醇Q4 1)抽提， 40C 12000r/min離心20min收集上清，重復(fù)一次；用0. 1倍體積NaAc (3mol/L)和0. 6倍體積異丙醇(_20°C預(yù)冷)室溫沉淀4h，4°C，12000r/min離心20min棄上清；沉淀用70%乙醇洗滌，4V，12000r/min離心20min棄上清，晾干；加50 μ L超純水溶解。土壤DNA濃度及純度的檢測(cè)取5 μ L所提取的DNA，0. 7 %瓊脂糖檢測(cè)，以 λ mixl9 (Fermentas)為 Maker，用紫外分光光度計(jì)(BioPhotometer 6131，Eppendoff)測(cè)定DNA的0D26(1、0D23(1、0D26(1/0D23(1的值及DNA的純度，測(cè)定時(shí)DNA稀釋了 10倍，所提土樣量為 0. 5g，最終換算成每克土壤中所提DNA的量。土壤DNA的PCR反應(yīng)利用細(xì)菌的16SrDNA和真菌的18SrDNA特異引物分析土壤中細(xì)菌和真菌DNA的提取質(zhì)量。細(xì)菌16SrDNA的擴(kuò)增引物F27 5 ‘ -AGAGTTTGATCMTGGCTCA-3 ‘ ；R1522 5 ‘ -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 ‘，再利用 V3 區(qū)的引物 F357-GC 5 ‘ -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCA G-3'和 R518:5' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3‘?dāng)U增 V3 區(qū)；真菌 18SrDNA 的擴(kuò)增引物為 Geoll 5' -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3 ‘ , Geo2 5 ‘ -ACCTTGTTACGACTrrrrACTTCC-3 ‘；擴(kuò)增其中片段用 NSl-GC :5 ‘ -CGCCCGCCGCGCGCGGGCGGGGCGGGGGCACCGGCCAGTAGTCATATGCTTGT C-3' ,NS2 5' -GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3 ‘進(jìn)行。二次擴(kuò)增的引物前均加GC夾子，便于后續(xù)的DGGE分析。長(zhǎng)片段PCR反應(yīng)體系及程序擴(kuò)增反應(yīng)在BioRad公司生產(chǎn)的Mycycle PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)總體積為 20 μ L 模板 DNA lng, PCR buffer 2 μ L，Mg2+2 μ L，引物(10 μ Μ)各 0. 2 μ L，BSA (10mg/mL) 2 μ L, dNTPs (各 IOmM) 0. 3L, Taq 酶(5U/L) 0. 2 μ L, ddH20 補(bǔ)齊至 20 μ L。長(zhǎng)片段擴(kuò)增應(yīng)程序94% 4min ；94°C 40S，46°C 40S，72°C 40S，共循環(huán) 38 次 72°C延伸 IOmin ；4°C保存。PCR 二次擴(kuò)增反應(yīng)體系取一次擴(kuò)增產(chǎn)物1 μ L，PCR buffer 5 μ L，Mg2+5 μ L，引物 (10 μ Μ)各 O. 5 μ L，dNTPs (各 IOmM) 0. 7 μ L, BSA (10mg/mL) 2 μ L, Taq 酶(5U/ μ L) 1 μ L, ddH20 補(bǔ)齊至50 μ L。采用降落式PCR反應(yīng)程序94°C 4min ；94°C 30S，63°C 30S，72°C 30S，共循環(huán) 15 次；94°C 30S，63°C 30S(每循環(huán) 1 次下降 1)，72°C 30S，共循環(huán) 13 次；94°C 30S，52°C 30S, 72°C 30S ；72°C延伸7min ；4°C保存。擴(kuò)增產(chǎn)物利用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，DL2000作為 Marker0PCR反應(yīng)產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析采用Bio-Rad公司Dcode的基因突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離。分別用濃度為10%，6%的丙稀酰胺，變性劑范圍為30% 60%。電泳150V，6h。EB染色15min 后，凝膠成像系統(tǒng)(BioRad, Gel Doc 2000)觀察拍照。實(shí)施例2 本實(shí)施例中的土樣取自新疆羅布泊湖的鹽土，其pH為6. 96，其土壤DNA的提取、土壤DNA濃度及純度的檢測(cè)、土壤DNA的PCR反應(yīng)、PCR反應(yīng)產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE) 分析方法同實(shí)施例1。實(shí)施例3 本實(shí)施例中的土樣取自新疆塔里木河岸的胡楊根際土，其pH為8. 64，其土壤DNA 的提取、土壤DNA濃度及純度的檢測(cè)、土壤DNA的PCR反應(yīng)、PCR反應(yīng)產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析方法同實(shí)施例1。實(shí)施例4 本實(shí)施例中的土樣取自新疆阿克蘇的棉田土，其pH為7. 60，其土壤DNA的提取、土壤DNA濃度及純度的檢測(cè)、土壤DNA的PCR反應(yīng)、PCR反應(yīng)產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE) 分析方法同實(shí)施例1。上述的四種土壤檢測(cè)實(shí)施例DNA的提取效果用上述實(shí)施例方法提取4種不同性質(zhì)的土壤均能提取出DNA如圖1，其不同的土壤，藥用植物根際土、鹽土、胡楊根際土和棉田土編號(hào)分別為1、2、3和4，片段在23kb以上， 與國(guó)內(nèi)外土壤微生物的提取片斷大小吻合。在酸性土壤中有略微拖尾現(xiàn)象，其他的3類土壤中不存在拖尾現(xiàn)象。腐殖酸在230Am處有吸收峰，通過估算OD26tZOD23tl值來確定所提取的 DNA中腐殖酸的污染程度OD26tlAD23tl值越高，表明DNA純度越純，反之，腐殖酸污染越嚴(yán)重。 用此方法所提的DNA的比值在0. 89 1. 23之間，如表一所示，從酸性土壤提取的DNA的OD 較低，而在鹽漬土壤和堿性土壤中提取的DNA的OD比值高一些，表明此方法更適合于提取鹽漬土壤和堿性土壤的DNA。每Ig 土壤中，所提取的DNA的從3. 74 15. 28g,從羅布泊鹽堿土壤中提出的量最少，可能與此種土壤中本身生物量較少有關(guān)。雖然比值低于理想值，此純度能夠滿足后續(xù)分析的需要。表一四種土壤總DNA的提取量和純度。
樣品編號(hào)OD230D260OD230/D260DNA的濃度 (ug/g)每克土壤DNA的量 (wg/g)10.4430.3940.8978.87.8820.1580.1881.1937.43.7430.6100.7141.17142.814.2840.6320.7651.21152.815.28PCR的瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果和DGGE檢測(cè)結(jié)果。
利用細(xì)菌的16SrDNA和真菌的18S rDNA的特異引物對(duì)所提取的4種性質(zhì)的土壤進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得較強(qiáng)的擴(kuò)增結(jié)果，如圖2所示。16S rDNA V3區(qū)的擴(kuò)增的目標(biāo)片段為 230bp左右，對(duì)18S rDNA的擴(kuò)增在550bp左右，在胡楊根際土和棉田土壤中的擴(kuò)增條帶更亮些，說明在這兩個(gè)樣品中的擴(kuò)增更強(qiáng)一些。DGGE圖譜條帶的豐富性和亮弱程度可以反應(yīng)土壤的微生物的多樣性和優(yōu)勢(shì)種類、特殊種類，可利用DGGE技術(shù)分析評(píng)價(jià)該方法所提DNA 的全面性。圖3為土壤細(xì)菌的DGGE圖譜，細(xì)菌的條帶數(shù)達(dá)到40條以上，并且優(yōu)勢(shì)種條帶明顯，條帶集中于整個(gè)凝膠的中間部分。圖4為土壤真菌的DGGE圖譜，真菌的條帶數(shù)達(dá)到30 條以上，優(yōu)勢(shì)種條帶明顯。分析表明細(xì)菌的豐富性較真菌多，不同性質(zhì)的土壤中真菌之間的相似性較細(xì)菌之問的相似性小，條帶集中于整個(gè)凝膠的中間部分，顯示真菌、細(xì)菌均存在較豐富的多樣性。此方法能夠較為靈敏、全面的反應(yīng)土壤微生物的多樣性，也說明所提DNA較為全面。結(jié)論目前提取土壤DNA的方法主要有直接提取法和間接提取法，間接提取純度較高，但提取的種類和數(shù)量較少；直接提取法是直接在土壤中裂解細(xì)胞，使其中內(nèi)含物盡可能的釋放，能夠代表大部分的土著微生物。但是由于土壤中所含物質(zhì)種類較多，量較大，因而提取的質(zhì)量受到很大的影響，許多方法需要對(duì)粗體DNA做純化處理，常用的氯化銫密度梯度超速離心、電泳法、過濾法、試劑盒法?；厥占兓笸斐刹糠諨NA的喪失，可能在土壤中本身存在量較少的種類會(huì)喪失或檢測(cè)不到，影響土壤微生物多樣性的分析。本方法中大量樣品提取改為小量樣品的提取，樣品加入裂解液后_80°C冰箱(或液氮)與65°C反復(fù)凍融，利于細(xì)胞壁較厚的微生物充分破壁，使細(xì)胞含物的充分釋放，在DNA沉淀的過程中采用聚乙二醇(PEG8000)。沉淀DNA分子所用的PEG的濃度也不同，沉淀大片段DNA分子所需 PEG的濃度只需1 %左右，小片段DNA分子所需PEG濃度高達(dá)20%。本實(shí)施例中加入終濃度為17% PEG進(jìn)行沉淀，獲得較好的沉淀效果另外，有人用PEG沉淀結(jié)合堿裂解法提取DNA 可消除肝素對(duì)PCR檢測(cè)結(jié)果的影響DNA，這可能也是本方法不用回收純化而獲得較好質(zhì)量 DNA的一個(gè)原因。目前對(duì)于土壤DNA的提取質(zhì)量方面，一般認(rèn)為所提取的片段在231Λ以上即可，有人報(bào)道每克土壤中所提DNA的量在2. 5 31 μ g之間，本方法所提大小在231Λ以上，DNA的提取量每克土壤中所提取的DNA的從3. 74 15. 28g獲得較穩(wěn)定的提取量。從土壤中盡可能的提取出所有種類微生物的DNA是進(jìn)行土壤微生態(tài)分析的基礎(chǔ)，也是充分發(fā)應(yīng)土壤微生物多樣性的必備條件。提取土壤DNA進(jìn)行微生物多樣性分析的一個(gè)重要的環(huán)節(jié)在于是否能夠進(jìn)行PCR擴(kuò)增。土壤中存在大量的PCR反應(yīng)抑制劑，如腐殖酸、腐殖酸類似物， 重金屬離子等，有人提取粗DNA不經(jīng)過純化，就無法獲得PCR產(chǎn)物。本方法不經(jīng)過純化直接進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過兩次PCR，細(xì)菌16S rDNA特異引物及真菌18rDNA核糖體DNA特異引物均獲得較好的擴(kuò)增結(jié)果。PCR過程中發(fā)現(xiàn)，加入BSA PCR有一定的影響，可能由于本方法不做回收純化，而土壤中有些不確定的物質(zhì)殘留到PCR體系中，從而影響Taq酶的活性，加入了 BSA對(duì)Taq酶有一定的保護(hù)作用從而達(dá)到更好的擴(kuò)增效果。PCR分析中發(fā)現(xiàn)，此方法提取的宏基因組DNA不但能夠擴(kuò)增原核生物的特異基因，也能擴(kuò)增真菌的特異基因，表明該方法能從土壤中同時(shí)有效提取細(xì)菌和真菌總基因組DNA，DGGE分析結(jié)果顯示，土壤細(xì)菌和真菌均表現(xiàn)出較高的多樣性，代表了較豐富的類群。本方法不但適于分析土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)， 同時(shí)也可用于分析真菌等真核微生物的多樣性。本方法從4種不同性質(zhì)的土壤中均有效地提取到DNA，在酸性土壤提取的DNA的雜質(zhì)殘留較多，與土壤偏酸性有關(guān)系，其DNA提取融解液的顏色深，色素殘留較多，但是并不影響后續(xù)的PCR及DGGE分析；從鹽土及堿性土壤中所提的DNA的質(zhì)量較高，說明該方法更適合于鹽堿土壤DNA的提取。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)土壤微生物多樣性的分析方法，包括以下步驟(1)從土壤中進(jìn)行DNA提??；(2)對(duì)步驟(1)中的DNA提取液中測(cè)出土壤中的DNA的濃度和純度；(3)將土壤中提取的DNA進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增；(4)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳分析。
2.如權(quán)利要求1中所述的一種檢測(cè)土壤微生物多樣性的分析方法，其特征在于，提取 DNA的條件如下稱土樣于離心管中，加提取液渦旋混勻后置于冰箱靜止或液氮速凍，取出水浴融化，反復(fù)凍融，加蛋白酶K，搖床振蕩，加SDS，水浴在室溫離心，收集上清，盡可能的不要取到上清與土壤沉淀之間的雜質(zhì)，沉淀加提取液和20% SDS，渦旋水浴一定的時(shí)間，室溫下離心，合并上清；上清中加聚己二醇800混勻，沉淀過夜；然后離心，棄上清，沉淀加入 IXTE溶解；用等體積的氯仿異戊醇抽提，離心后收集上清，重復(fù)一次；用NaAc和異丙醇室溫沉淀，離心后棄上清；沉淀用70%乙醇洗滌，離心后棄上清，晾干，加超純水溶解。
3.如權(quán)利要求1中所述的一種檢測(cè)土壤微生物多樣性的分析方法，其特征在于，步驟O)中的檢測(cè)方法為取所提取的DNA，0. 7%瓊脂糖檢測(cè)，以λ mixl9 (i^rmentas)為 Maker，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的0D26(1、OD230> OD260/OD230的值及DNA的純度。
4.如權(quán)利要求1中所述的一種檢測(cè)土壤微生物多樣性的分析方法，其特征在于，在步驟(3)中的PCR儀反應(yīng)條件為反應(yīng)總體積為20 μ L 模板DNA lng, PCR buffer 2 μ L， Mg2+2yL，弓丨物(10 μ Μ)各 0.2 μ L，BSA(10mg/mL) 2 μ L, dNTPs (各 IOmM) 0. 3L, Taq 酶(5U/ L) 0. 2 μ L，ddH20 補(bǔ)齊至 20 μ L。長(zhǎng)片段擴(kuò)增應(yīng)程序94 % 4min ；94 "C 40S, 46 "C 40S， 720C 40S，共循環(huán)38次72°C延伸IOmin ；4°C保存；取上述的一次擴(kuò)增產(chǎn)物 1 μ L，PCR buffer 5 μ L，Mg2+5 μ L，引物(10 μ Μ)各 0. 5 μ L， dNTPs (各 10mM)0. 7μ L，BSA(10mg/mL)2y L，Taq 酶(5U/μ L) 1 μ L，ddH20 補(bǔ)齊至 50 μ L。采用降落式 PCR 反應(yīng)程序94°C 4min ；94°C 30S，63°C 30S，72°C 30S，共循環(huán) 15 次；94°C 30S， 63°C 30S(每循環(huán) 1 次下降 1)，72°C 30S，共循環(huán) 13 次；94°C 30S，52°C 30S，72°C 30S ；72°C 延伸7min ；4°C保存。擴(kuò)增產(chǎn)物利用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，DL2000作為Marker ；細(xì)菌 16SrDNA 的擴(kuò)增弓丨物 F27 :5 ‘ -AGAGTTTGATCMTGGCTCA-3 ‘ ；R1522 5 ‘ -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 ‘，再利用 V3 區(qū)的引物 F357-GC 5 ‘ -CGCCCGCCGCGCGCGGCG GGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3 ‘和 R518 :5 ‘ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 ‘ 擴(kuò)增 V3 區(qū)；真菌 18SrDNA 的擴(kuò)增引物為 Geoll 5' -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3‘，Geo2 5' -ACCTTGTTACGACTrrrrACTTCC-3‘；擴(kuò)增其中片段用 NS1-GC :5‘ -CGCCCGCCGCGCGCGGGC GGGGCGGGGGCACCGGCCAGTAGTCATATGCTTGTC-3' , NS2 5' -GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3‘。
5.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)土壤微生物多樣性的分析方法，其特征在于，所述的提取液由以下組份組成0. ImolTris,0. Imol EDTA，0. Imol磷酸緩沖液，1. 5molNaCl,l% CTAB, pH 為 8. O。
6.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)土壤微生物多樣性的分析方法，其特征在于所述的土壤為鹽土或堿性土壤。
7.如權(quán)利要求2中所述的一種檢測(cè)土壤微生物多樣性的分析方法，其特征在于在步驟中的變性梯度凝膠電泳分析采用的基因突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離，分別用濃度為10%，6%的丙稀酰胺，變性劑范圍為30% 60%，電泳150V，6h，EB染色15min 后，凝膠成像系統(tǒng)，觀察拍照。
全文摘要
本發(fā)明本發(fā)明涉及一種生物分析的方法，尤其涉及一種檢測(cè)土壤微生物多樣性的分析方法。該方法包括以下步驟(1)從土壤中進(jìn)行DNA提取；(2)對(duì)步驟(1)中的DNA提取液中測(cè)出土壤中的DNA的濃度和純度；(3)將土壤中提取的DNA進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增；(4)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳分析。利用本發(fā)明的方法對(duì)各種土壤進(jìn)行的檢測(cè)分析，其結(jié)果最接近真實(shí)的微生物狀態(tài)。因?yàn)樵谔幚淼倪^程中，提取的DNA溶液無損失，對(duì)研究土壤中的微生物狀態(tài)提供了完美的解決方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102399855SQ201010277480
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月9日
發(fā)明者丁國(guó)才 申請(qǐng)人:上海海帝園藝有限公司