專利名稱：提高乳酸菌膽鹽水解酶活性的方法和培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體而言屬于乳酸菌膽鹽水解酶活性的提高方法。
背景技術：
乳酸菌是一類古老而又新穎的細菌。早在公元前3世紀，我們的祖先就用它來制 作泡菜和腌菜，近代無菌動物學、悉生生物學、厭氧技術和其它高新技術的發(fā)展，又發(fā)現(xiàn)了 一些新的類群，即目前的研究熱點-益生乳酸菌，千百年的消費習慣證明了這些菌群的安 全性和可靠性。乳酸菌的益生作用可分為營養(yǎng)作用、生理作用和抗菌作用，這些作用使得乳 酸菌在保健品、食品領域得到廣泛應用，如乳酸菌口服制劑、乳酸菌發(fā)酵食品等。人體血清高膽固醇含量被認為是誘發(fā)高血壓、冠心病等眾多心血管疾病的重要因 素。統(tǒng)計表明，心腦血管疾病是目前引起人們死亡的主要殺手，而且其患病率和死亡率仍 呈逐年上升的趨勢。膽固醇含量每高于正常膽固醇含量lmmol，患冠心病的幾率就會增加 35%左右，而冠心病致死的幾率也會增加到45%。即使是將膽固醇含量降低1%，研究數(shù)字 都表明了，減少患冠心病的幾率達到2% 3%。一個世紀以來的動物實驗資料以及人類的 病理、遺傳和代謝方面的研究結果表明，血清總膽固醇(TC)和冠心病(CHD)等心血管疾病 發(fā)病率之間始終存在一種強陽性的、連續(xù)的、獨立的等級性關系，覆蓋的膽固醇濃度很廣， 包括正常或輕度升高者。人體臨床試驗提供了膽固醇和動脈粥樣硬化緊密聯(lián)系的決定性證 據(jù)。在美國脂類研究所開展的臨床冠狀血管病初級干預試驗，經過7年多時間的研究發(fā)現(xiàn)， 低密度脂蛋白膽固醇水平下降12. 5%，可以相應的降低心肌梗塞發(fā)病率19%。目前已經證 實，降低血清膽固醇水平可使患冠心病等心血管疾病的危險性有所減少，同時可使心絞痛 發(fā)生率以及需要冠狀動脈搭橋手術率等明顯下降。1977年，Gilliland對腸道乳桿菌降膽固醇作用進行了研究，提出乳桿菌在生長 過程中通過降解膽鹽促進膽固醇的分解代謝，從而降低膽固醇含量的觀點。隨后Rasic等 也證實了嗜酸乳桿菌和兩雙歧桿菌對膽固醇的脫除作用。大量的人體及動物實驗也證明了 乳酸菌的降膽固醇作用。上述效果來源于大多數(shù)乳酸菌在代謝過程中所產生的膽鹽水解 酶(BSH)，研究發(fā)現(xiàn)，該酶能水解結合態(tài)?；撬崮扄}和甘氨酸膽鹽，將其轉變成氨基酸和游 離膽酸，同時部分膽固醇還與去結合態(tài)膽鹽結合產生共沉淀，從而在一定程度上減少人體 對膽固醇的吸收，對人體膽固醇的代謝起到調節(jié)作用，從而起到降低血液膽固醇、血脂的作 用。此外該酶還可增強乳酸菌對胃酸、膽汁的耐受性、在腸道中的存活能力和持續(xù)繁殖能 力，即增加乳酸菌在腸道中的存活率和穩(wěn)定性。因此提高乳酸菌膽鹽水解酶的活性，對增強 乳酸菌降膽固醇功能、提高其人體腸道中的存活幾率和穩(wěn)定性等益生特性是十分必要的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種提高乳酸菌膽鹽水解酶活性的方法。本發(fā)明同時提供提 高乳酸菌膽鹽水解酶活性的培養(yǎng)基。本發(fā)明的技術要點在于采用定向底物誘導、營養(yǎng)強化(增加細胞膜通透性以及添加乳酸菌生長因子)的方法，以提高乳酸菌膽鹽水解酶的活性。從而提高乳酸菌膽固醇 降解能力以及增強其定植人體腸道的能力和穩(wěn)定性。本發(fā)明所提供的提高乳酸菌膽鹽水解酶活性的方法，具體包括如下步驟①定向誘導將待處理的具備產膽鹽水解酶能力的乳酸菌活化，使菌體濃度達到 108CFU/mL，以2% (體積百分數(shù))的比例加到MRSO液體培養(yǎng)基中進行耐受培養(yǎng)，每傳代一 次膽固醇的濃度增加0. 15% (質量百分數(shù))，五次定向培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中膽固醇的含量達 到(質量百分數(shù))，即；選擇生長良好的乳酸菌，將其在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測定其 在誘導馴化前后的膽鹽水解酶活性變化，從中篩選出酶活提高一倍以上的菌株進行以下實 驗；②營養(yǎng)強化在定向誘導后，將篩選出的膽鹽水解酶活性提高一倍以上的乳酸菌 菌株，按2% (體積百分數(shù))的比例接種到MRSl中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間12-48小時；所述培養(yǎng)基的配方如下MRS液體培養(yǎng)基蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO4 2. 0g, NaOAc 5. 0g, MgSO4 0. 2g，檸檬酸三銨 2. Og,蒸餾水 I OOOmL ；MRSO液體培養(yǎng)基在MRS液體培養(yǎng)基中，添加0. 25 1. 0 % (質量百分數(shù))水溶性 膽固醇及0.5% (質量百分數(shù))膽鹽(牛磺膽酸鈉)；本申請中所述的0.25 1.0% (質量 百分數(shù))水溶性膽固醇具體是指0. 25 1. 0% (質量百分數(shù))的濃度是隨使用過程而逐 步添加，在使用過程中共五次定向培養(yǎng)，第一次培養(yǎng)膽固醇濃度為0. 25% (質量百分數(shù))， 之后每培養(yǎng)一次膽固醇的濃度增加0. 15% (質量百分數(shù))，最后一次培養(yǎng)基中膽固醇的含 量達到(質量百分數(shù))；MRSl液體培養(yǎng)基在MRSO液體培養(yǎng)基中，添加0. 1-0. 2% (質量百分數(shù))土溫80， 及1-3% (體積百分數(shù))的50% (體積百分數(shù))鮮榨番茄汁；鮮榨番茄汁是50% (體積百分數(shù))鮮榨番茄汁，先將番茄切成小塊，加1倍的水 打漿，過濾，濾液于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明同時要求保護下述兩種培養(yǎng)基(I)用于提高乳酸菌膽鹽水解酶活性的培養(yǎng)基，配方如下MRSl液體培養(yǎng)基在MRSO液體培養(yǎng)基中，添加0. 1-0. 2% (質量百分數(shù))土溫80， 及1-3% (體積百分數(shù))的50% (體積百分數(shù))鮮榨番茄汁；MRSO液體培養(yǎng)基在MRS液體培養(yǎng)基中，添加0. 25 1. 0% (質量百分數(shù))水溶 性膽固醇及0. 5% (質量百分數(shù))膽鹽(?；悄懰徕c)；所述的MRS液體培養(yǎng)基配方蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5. Og,葡萄糖20. Og, K2HPO4 2. 0g, Na0Ac5. 0g, MgSO4 0. 2g，檸檬酸三銨 2. 0g，蒸餾水 IOOOmL ；MRS培養(yǎng)基是一種常規(guī)培養(yǎng)基，MRSO和MRSl是在此基礎上改良的。所述的鮮榨番茄汁是先將番茄切成小塊，加1倍的水打漿，過濾，濾液于4°C冰箱 保存?zhèn)溆谩?II)用于提高乳酸菌膽鹽水解酶活性的培養(yǎng)基，配方如下MRSO液體培養(yǎng)基在MRS液體培養(yǎng)基中，添加0. 25 1. 0 % (質量百分數(shù))水溶 性膽固醇及0.5% (質量百分數(shù))膽鹽(牛磺膽酸鈉)；所述的膽固醇添加濃度隨使用過程 而逐步添加，共五次定向培養(yǎng)，第一次培養(yǎng)膽固醇濃度為0.25% (質量百分數(shù))，之后每培養(yǎng)一次膽固醇的濃度增加0. 15% (質量百分數(shù))，最后一次培養(yǎng)基中膽固醇的含量達到 (質量百分數(shù))；所述的MRS液體培養(yǎng)基配方蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5. Og,葡萄糖20. Og, K2HPO4 2. 0g, NaOAc 5. 0g, MgSO4 0. 2g，檸檬酸三銨 2. 0g，蒸餾水 IOOOmL ；將乳酸菌接入到MRSl中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入土溫80刺激因子能促進酶產量的增 加。主要是刺激因子可以改進細胞膜的滲透性，增強氧的傳遞速度，改善菌體對氧的利用， 促進菌體產酶能力；鮮榨番茄汁營養(yǎng)豐富，含有多種生長因子，對乳酸菌具有生長激活和促 進產酸的作用，可增加膽鹽水解酶活力。對于不了解是否產膽鹽水解酶的乳酸菌，可以在進行上述提高乳酸菌膽鹽水解酶 活性的步驟之前，先進行產膽鹽水解酶乳酸菌篩選，具體方法如下在MRS2固體培養(yǎng)基表面放置牛津杯，牛津杯中加入待測乳酸菌菌液，37°C培養(yǎng) 72h，觀察牛津杯周圍有無白色沉淀圈產生。將牛津杯周圍的白色沉淀輕輕刮下，用茚三酮 方法檢測是否有藍紫色反應發(fā)生，有藍紫色反應發(fā)生的可確定產膽鹽水解酶，并可測定酶 活大小。通常白色沉淀圈越大，膽鹽水解酶酶活越高。所述的MRS2固體培養(yǎng)基在普通的MRS液體培養(yǎng)基中，加入2% (質量百分數(shù))的 瓊脂，3% (質量百分數(shù))的膽鹽(?；悄懰徕c)，1% (質量百分數(shù))的水溶性膽固醇，2% (質量百分數(shù))的CaCl2。有益效果大量的試驗證實，采用本發(fā)明所述的方法處理具備產膽鹽水解酶能力的乳酸菌， 可使其乳酸菌膽鹽水解酶活性提高1. 5 3. 5倍；當處理乳酸菌為CGMCC NO 1. 580干酪乳桿菌干酪亞種時，獲得的效果最優(yōu)，可使 其乳酸菌膽鹽水解酶活性提高3. 5倍。
具體實施例方式以下為本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明所述的方法不局限于下列實施例，本領域普通 技術人員所知的具備產膽鹽水解酶能力的乳酸菌均可作為本發(fā)明所述的材料。在本發(fā)明中，膽鹽水解酶活力的測定采用基于如下原理的方法通過結合膽鹽降 解后釋放的氨基酸量的多少來確定。即該酶活力與氨基酸的生成量成正比?？刹捎密崛?顯色法測定氨基酸的含量。水合茚三酮與氨基酸反應，水合茚三酮被還原成還原型水合茚 三酮。氨基酸被氧化脫羧，產生醛，二氧化碳和氨。然后，氨、水合茚三酮和還原型水合茚三 酮三者作用生成藍紫色絡合物，該化合物顏色的深淺與氨基酸的含量成正比，采用比色法 通過測定570nm處的光密度，測定氨基酸的含量。膽鹽水解酶活性測定的具體方法為收集沉淀菌體，超聲波破碎細胞3min，取ImL 菌液離心lOmin，取0. ImL上清液+1.8mL pH6緩沖液+0. ImL膽鹽37°C搖床培養(yǎng)30min，培養(yǎng) 后加2. OmL 15%三氯乙酸終止酶反應，取2. OmL菌液離心，取ImL上清液+ImL蒸餾水+ImL 茚三酮，沸水浴16min，20°C冷卻20min，立即加入5mL稀釋液，于570nm測OD值。膽鹽水解 酶以每分鐘生成Immol的氨基酸定義為一個酶活力單位。實施例ICGMCC NO 1. 580干酪乳桿菌干酪亞種乳酸菌膽鹽水解酶活性提高方法①定向誘導將待處理的CGMCC NO 1. 580干酪乳桿菌干酪亞種活化，使菌體濃度達到108CFU/mL，以2%的比例加到MRSO液體培養(yǎng)基中進行耐受培養(yǎng)，每傳代一次膽固醇的 濃度增加0. 15%，五次定向培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中膽固醇的含量達到；選擇生長良好的乳酸 菌，將其在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測定其在誘導馴化前后的膽鹽水解酶活性變化，從中篩 選出酶活提高一倍以上的菌株進行以下操作；②營養(yǎng)強化在定向誘導后，將篩選出的膽鹽水解酶活性提高一倍以上的乳酸菌 菌株，按2%的比例接種到MRSl中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間12-48小時；所述培養(yǎng)基的配方如下MRS液體培養(yǎng)基蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO4 2. 0g, NaOAc 5. 0g, MgSO4 0. 2g，檸檬酸三銨 2. Og,蒸餾水 IOOOmL ；MRSO液體培養(yǎng)基在MRS液體培養(yǎng)基中，添加水溶性膽固醇及0. 5%膽鹽；所述 的膽固醇添加濃度隨使用過程而逐步添加，共五次定向培養(yǎng)，第一次培養(yǎng)膽固醇濃度為 0. 25%，之后每培養(yǎng)一次膽固醇的濃度增加0. 15%，最后一次培養(yǎng)基中膽固醇的含量達到 1% ；MRSl液體培養(yǎng)基在MRSO液體培養(yǎng)基中，添加0. 1-0. 2%土溫80，及的50%
鮮榨番茄汁；鮮榨番茄汁先將番茄切成小塊，加1倍的水打漿，過濾，濾液于4°C冰箱保存?zhèn)溆?。測定其培養(yǎng)前后的膽鹽水解酶活性，觀察酶活變化情況，數(shù)據(jù)見表1-1.表 1-權利要求
提高乳酸菌膽鹽水解酶活性的方法，包括如下步驟①定向誘導將待處理的具備產膽鹽水解酶能力的乳酸菌活化，使菌體濃度達到108CFU/mL，以2％的比例加到MRSO液體培養(yǎng)基中進行耐受培養(yǎng)，每傳代一次膽固醇的濃度增加0.15％，五次定向培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中膽固醇的含量達到1％；選擇生長良好的乳酸菌，將其在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測定其在誘導馴化前后的膽鹽水解酶活性變化，從中篩選出酶活提高一倍以上的菌株進行以下實驗；②營養(yǎng)強化在定向誘導后，將篩選出的膽鹽水解酶活性提高一倍以上的乳酸菌菌株，按2％的比例接種到MRS1中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間12 48小時；所述培養(yǎng)基的配方如下MRS液體培養(yǎng)基蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO4 2.0g，NaOAc 5.0g，MgSO4 0.2g，檸檬酸三銨2.0g，蒸餾水1000mL；MRSO液體培養(yǎng)基在MRS液體培養(yǎng)基中，添加0.25～1.0％水溶性膽固醇及0.5％膽鹽(?；悄懰徕c)；MRS1液體培養(yǎng)基在MRSO液體培養(yǎng)基中，添加0.1 0.2％土溫80，及1 3％的50％鮮榨番茄汁；鮮榨番茄汁先將番茄切成小塊，加1倍的水打漿，過濾，濾液于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的待處理乳酸菌為CGMCCN01. 580干 酪乳桿菌干酪亞種。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的待處理乳酸菌為CGMCCN01. 2467嗜 酸乳桿菌。
4.用于提高乳酸菌膽鹽水解酶活性的培養(yǎng)基，配方如下在MRSO液體培養(yǎng)基中，添加0. 1-0. 2% 土溫80，及的50%鮮榨番茄汁； MRSO液體培養(yǎng)基在MRS液體培養(yǎng)基中，添加0. 25 1. 0%水溶性膽固醇及0. 5%膽 鹽(牛磺膽酸鈉)；所述的MRS液體培養(yǎng)基配方蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5. Og,葡萄糖20. Og, K2HPO4 2. 0g, NaOAc 5. 0g, MgSO4 0. 2g，檸檬酸三銨 2. 0g，蒸餾水 IOOOmL ；所述的鮮榨番茄汁是先將番茄切成小塊，加1倍的水打漿，過濾，濾液于4°C冰箱保存
5.用于提高乳酸菌膽鹽水解酶活性的培養(yǎng)基，配方如下MRSO液體培養(yǎng)基在MRS液體培養(yǎng)基中，添加水溶性膽固醇及0. 5%膽鹽；所述的膽固 醇添加濃度隨使用過程而逐步添加，共五次定向培養(yǎng)，第一次培養(yǎng)膽固醇濃度為0. 25%，之 后每培養(yǎng)一次膽固醇的濃度增加0. 15%，最后一次培養(yǎng)基中膽固醇的含量達到；所述的MRS液體培養(yǎng)基配方蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5. Og,葡萄糖20. Og, K2HPO4 2. 0g, NaOAc 5. 0g, MgSO4 0. 2g，檸檬酸三銨 2. 0g，蒸餾水 IOOOmL0
全文摘要
提高乳酸菌膽鹽水解酶活性的方法和培養(yǎng)基，本發(fā)明的技術要點在于采用定向底物誘導、營養(yǎng)強化(增加細胞膜通透性以及添加乳酸菌生長因子)的方法，以提高乳酸菌膽鹽水解酶的活性。從而提高乳酸菌膽固醇降解能力以及增強其定植人體腸道的能力和穩(wěn)定性。大量的試驗證實，采用本發(fā)明所述的方法處理具備產膽鹽水解酶能力的乳酸菌，可使其乳酸菌膽鹽水解酶活性提高1.5～3.5倍；當處理乳酸菌為CGMCC NO 1.580干酪乳桿菌干酪亞種時，獲得的效果最優(yōu)，可使其乳酸菌膽鹽水解酶活性提高3.5倍。
文檔編號C12N1/38GK101942411SQ20101027998
公開日2011年1月12日 申請日期2010年9月8日 優(yōu)先權日2010年9月8日
發(fā)明者侯紅漫, 張公亮, 紀旭 申請人:大連工業(yè)大學