專利名稱：應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)豬細(xì)小病毒疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn) 豬細(xì)小病毒疫苗的方法。
背景技術(shù)：
豬細(xì)小病毒病(porcine parvovirus，PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要疾病之一。 懷孕母豬主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱仔等，以頭胎母豬最為嚴(yán)重，給全球的養(yǎng)豬業(yè) 造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對豬細(xì)小病毒的防治主要是以免疫預(yù)防為主，由于PPV血清型 單一及其高免疫原性，使得疫苗接種成為控制該病感染的一種行之有效的方法。目前在我國廣泛應(yīng)用的疫苗為豬細(xì)小病毒滅活疫苗，疫苗的生產(chǎn)采用的是傳統(tǒng)的 轉(zhuǎn)瓶工藝，該工藝在我疫苗行業(yè)已經(jīng)使用了數(shù)十年，其操作技術(shù)相對簡單和成熟。但是每個 轉(zhuǎn)瓶均是獨(dú)立的細(xì)胞培養(yǎng)單元，每瓶細(xì)胞的質(zhì)量、病毒產(chǎn)量和滴度都不同，導(dǎo)致疫苗批間差 異大，而且操作勞動強(qiáng)度大，生產(chǎn)效率低，隱性污染引起的高內(nèi)毒素等缺點(diǎn)，已經(jīng)越來越不 適應(yīng)當(dāng)前疫苗大規(guī)模生產(chǎn)的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了克服豬細(xì)小病毒疫苗現(xiàn)有生產(chǎn)方法的缺陷，提供一種應(yīng)用生物反應(yīng)器 工業(yè)化生產(chǎn)豬細(xì)小病毒疫苗的方法，其優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備占地面積小、生產(chǎn)規(guī)模大；自動化控制程 度高，生產(chǎn)效率好；培養(yǎng)設(shè)備密閉，不易污染；副產(chǎn)物少，疫苗的副反應(yīng)小；生產(chǎn)的病毒液效 價高，疫苗質(zhì)量穩(wěn)定。本發(fā)明的技術(shù)方案為應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)豬細(xì)小病毒疫苗的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)將微載體和生物反應(yīng)器滅菌后，加入細(xì)胞生長液，接種制苗用細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待微載體 上的細(xì)胞形成致密的單層，接種豬細(xì)小病毒，并繼續(xù)培養(yǎng)，使病毒繁殖；所述的制苗用細(xì)胞 為對豬細(xì)小病毒毒株敏感的細(xì)胞，且細(xì)胞為IBRS-2、PK-15或ST細(xì)胞；⑵待細(xì)胞病變達(dá)到 80%以上時，停止培養(yǎng)，收獲病毒液；C3)對收獲的病毒液進(jìn)行超濾濃縮和病毒滅活；(4)通 過柱層析方法純化滅活的病毒制成疫苗。所述的生物反應(yīng)器設(shè)定參數(shù)為pH 6. 5 7. 8、溫度33 37°C、溶氧30 80%、 攪拌速度30 lOOrpm。考慮到細(xì)胞培養(yǎng)的最適條件，優(yōu)選的pH 6. 9 7. 3、細(xì)胞培養(yǎng)階段 溫度設(shè)定37°C，病毒培養(yǎng)階段溫度設(shè)定35°C、溶氧50%、攪拌速度30 lOOrpm。所述病毒的接種量為0. 0001 0. 1M0I。所述的微載體為Cytodex系列微載體，微載體的使用密度為2 25g/L。所述的生物反應(yīng)器為攪拌式生物反應(yīng)器。所述的生物反應(yīng)器容積為14 150L。制苗用細(xì)胞可采用14L 40L或14L 40L 150L逐級放大的培養(yǎng)模式，即通過胰酶將14L生物反應(yīng)器培養(yǎng)的細(xì)胞消化下來，作為 種子細(xì)胞接種到40L的生物反應(yīng)器，再將40L的反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞消化下來作為種子細(xì)胞接種到150L生物反應(yīng)器，如此形成生物反應(yīng)器之間的逐級放大培養(yǎng)過程，從而避免了單 純的用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)種子細(xì)胞而容易造成污染和增加勞動強(qiáng)度的缺陷；或，直接用14L、40L或 150L的生物反應(yīng)器培養(yǎng)病毒。所述的生物反應(yīng)器的培養(yǎng)采用批式、流加或灌注培養(yǎng)的方式，灌注的速率根據(jù)細(xì) 胞的密度以每天0. 5 4個工作體積。本發(fā)明采用生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞的高密度培養(yǎng)，生產(chǎn)豬細(xì)小病毒 疫苗，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝相比，自動化控制程度高，生產(chǎn)可實(shí)時監(jiān)控；節(jié)省人力，降低 成本；生產(chǎn)用地少，規(guī)模易于擴(kuò)大；生產(chǎn)的病毒滴度高，批間差異小，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，副反應(yīng)


圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。圖加為細(xì)胞接種后4h的微載體細(xì)胞圖片。圖2b為接毒后細(xì)胞狀態(tài)的微載體細(xì)胞圖片圖3為細(xì)胞生長曲線。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明一個具體的實(shí)施方案，以進(jìn)一步的闡述本發(fā)明，但不能解釋為限制 本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1生物反應(yīng)器美國NBS公司14L和40L生物反應(yīng)器；微載體=Cytodex-I (美國通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部)；豬細(xì)小病毒冊-I株；細(xì)胞生長液含體積濃度為8%小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技術(shù)有限公 司)；病毒維持液含體積濃度為小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技術(shù)有限公 司)；細(xì)胞培養(yǎng)分別在14L生物反應(yīng)器內(nèi)，按照10g/L的濃度加入Cytodexl，水化后， 用pH7. 2的磷酸鹽緩沖液PBS淘洗2遍，滅菌，接種IBRS-2細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)的方法參數(shù) 為pH7. 2、溫度37°C、D050%、攪拌速度30 IOOrpm ；每天定時取樣觀察細(xì)胞生長情況，進(jìn) 行細(xì)胞計數(shù)，測定葡萄糖的消耗，當(dāng)細(xì)胞的密度達(dá)到1. 5X 106/ml時，開始灌注，灌注的速度 依據(jù)細(xì)胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0. 5 4個工作體積，以維持細(xì)胞的生長，培養(yǎng)4 5天，細(xì)胞的密度達(dá)到7 X 106/ml。微載體培養(yǎng)的放大待14L生物反應(yīng)器細(xì)胞的密度達(dá)到7X 106/ml，將長滿細(xì)胞的 微載體收集到特定密閉容器中，用含質(zhì)量濃度為0. 02% EDTA的pH7. 2的PBS緩沖液清洗 細(xì)胞兩次，加入37°C預(yù)熱的含質(zhì)量濃度為0. 02% EDTA、質(zhì)量濃度為0. 25%胰酶的胰酶消化 液，消化8min，排出多余的胰酶溶液，加入細(xì)胞生長液，終止殘余胰酶的消化，啟動容器攪拌 使其充分分散消化的細(xì)胞，然后將消化分散的細(xì)胞懸液接種到40L的生物反應(yīng)器，按照上 述的培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。4
病毒繁殖當(dāng)40L生物反應(yīng)器細(xì)胞的密度達(dá)到8X106/ml，更換成病毒維持液，按 照0. 01M0I接種豬細(xì)小病毒；接毒后他開始灌注培養(yǎng)，以維持病毒繁殖所必需的營養(yǎng)物質(zhì)， 待細(xì)胞病變達(dá)到80%以上時，同時收獲病毒液，測定病毒含量8. Ol0gTCID5ciAil，，將收獲的 病毒液置于2 8°C中，并保存在-20°C。病毒濃縮、純化、配苗將上述收獲的病毒液用10萬截留分子量的超濾膜包濃縮 10倍，按滅活劑與病毒濃縮液體積比為1 2000加入質(zhì)量濃度為37%甲醛溶液滅活劑進(jìn) 行滅活后，再經(jīng)過凝膠層析柱^^11虹0^ 4FF柱層析得到純化疫苗；按抗原和油佐劑1 1 比例加入油佐劑，乳化配制成滅活疫苗。油佐劑的配制為94% (V/V)白油、6% (V/V)的 Span-80,2% (g/V)硬脂酸鋁。實(shí)施例2生物反應(yīng)器美國NBS公司14L和40L生物反應(yīng)器；微載體=Cytodex-I (美國通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部)；豬細(xì)小病毒冊-I株；細(xì)胞生長液含體積濃度為8%小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技術(shù)有限公 司)；病毒維持液含體積濃度為小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技術(shù)有限公 司)；細(xì)胞培養(yǎng)分別在14L生物反應(yīng)器內(nèi)，按照10g/L的濃度加入Cytodex-Ι，水化后， 用pH7. 2的磷酸鹽緩沖液PBS淘洗2遍，滅菌，接種PK-15細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)的方法參數(shù) 為pH7. 2、溫度37°C、D050%、攪拌速度30 IOOrpm ；每天定時取樣觀察細(xì)胞生長情況，進(jìn) 行細(xì)胞計數(shù)，測定葡萄糖的消耗，當(dāng)細(xì)胞的密度達(dá)到1.5X 106/ml時，開始灌注，灌注的速度 依據(jù)細(xì)胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0. 5 4個工作體積，以維持細(xì)胞的生成，培養(yǎng)4天， 細(xì)胞的密度達(dá)到7 X 106/ml。微載體培養(yǎng)的放大待14L生物反應(yīng)器細(xì)胞的密度達(dá)到7X 106/ml，將長滿細(xì)胞的 微載體收集到特定密閉容器中，用含質(zhì)量濃度為0. 02% EDTA的pH7. 2的PBS緩沖液清洗 細(xì)胞兩次，加入37°C預(yù)熱的含質(zhì)量濃度為0. 02% EDTA、質(zhì)量濃度為0. 25%胰酶的胰酶消化 液，消化lOmin，排出多余的胰酶溶液，加入細(xì)胞生長液，終止殘余胰酶的消化，啟動容器攪 拌使其充分分散消化的細(xì)胞，然后將消化分散的細(xì)胞懸液接種到40L的生物反應(yīng)器，按照 上述的培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。病毒繁殖當(dāng)40L生物反應(yīng)器細(xì)胞的密度達(dá)到8X106/ml，更換成病毒維持液，按 照0. 01M0I接種豬細(xì)小病毒；接毒后他開始灌注培養(yǎng)，以維持病毒繁殖所必需的營養(yǎng)物質(zhì)， 待細(xì)胞病變達(dá)到80%以上時，同時收獲病毒液，測定病毒含量7. 81ogTCID5(1/ml，將收獲的 病毒液置于2 8°C中，并保存在-20°C。病毒濃縮、純化、配苗將上述收獲的病毒液用10萬截留分子量的超濾膜包濃縮 50倍，按滅活劑與病毒濃縮液體積比為1 2000加入37%甲醛溶液滅活劑進(jìn)行滅活后，再 經(jīng)過凝膠層析柱kpharose 4FF柱層析得到純化疫苗；按抗原和油佐劑1 1比例加入油 佐劑，乳化配制成滅活疫苗，油佐劑的配制為94% (V/V)白油、6% (V/V)的Span-80，2% (g/V)硬脂酸鋁。實(shí)施例3
生物反應(yīng)器美國NBS公司14L和40L生物反應(yīng)器；微載體=Cytodex-I (美國通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部)；豬細(xì)小病毒冊-I株；細(xì)胞生長液含體積濃度為8%小牛血清的DMEM/F12 ；病毒維持液含體積濃度為1 %小牛血清的DMEM/F12 ；細(xì)胞培養(yǎng)分別在14L生物反應(yīng)器內(nèi)，按照10g/L的濃度加入Cytodexl，水化后， 用pH7. 2的磷酸鹽緩沖液PBS淘洗2遍，滅菌，接種ST細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)的方法參數(shù)為 PH7. 2、溫度37°C、D050%、攪拌速度30 IOOrpm ；每天定時取樣觀察細(xì)胞生長情況，進(jìn)行 細(xì)胞計數(shù)，測定葡萄糖的消耗，當(dāng)細(xì)胞的密度達(dá)到1 1.5X106/ml時，開始灌注，灌注的 速度依據(jù)細(xì)胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0.5 4個工作體積，培養(yǎng)4d，細(xì)胞的密度達(dá)到 7X106/ml。微載體培養(yǎng)的放大待14L生物反應(yīng)器細(xì)胞的密度達(dá)到7X 106/ml，將長滿細(xì)胞的 微載體收集到特定密閉容器中，用含質(zhì)量濃度為0. 02% EDTA的pH7. 2的PBS緩沖液清洗 細(xì)胞兩次，加入37°C預(yù)熱的含質(zhì)量濃度為0. 02% EDTA、質(zhì)量濃度為0. 25%胰酶的胰酶消化 液，消化lOmin，排出多余的胰酶溶液，加入細(xì)胞生長液，終止殘余胰酶的消化，啟動容器攪 拌使其充分分散消化的細(xì)胞，然后將消化分散的細(xì)胞懸液接種到40L的生物反應(yīng)器，按照 上述的培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。病毒繁殖當(dāng)40L生物反應(yīng)器細(xì)胞的密度達(dá)到8X106/ml，更換成病毒維持液，按 照0. 01M0I接種豬細(xì)小病毒；接毒后他開始灌注培養(yǎng)，以維持病毒繁殖所必需的營養(yǎng)物質(zhì)， 待細(xì)胞病變達(dá)到80%以上時，同時收獲病毒液，測定病毒含量7. 81ogTCID5(1/ml，將收獲的 病毒液置于2 8°C中，并保存在-20°C。病毒濃縮、純化、配苗將上述收獲的病毒液用10萬截留分子量的超濾膜包濃縮 30倍，按滅活劑與病毒濃縮液體積比為1 2000加入質(zhì)量濃度為37%甲醛溶液滅活劑進(jìn) 行滅活后，再經(jīng)過凝膠層析柱^^11虹0^ 4FF柱層析得到純化疫苗；按抗原和油佐劑1 1 比例加入油佐劑，乳化配制成滅活疫苗。油佐劑的配制為94% (V/V)白油、6% (V/V)的 Span-80,2% (g/V)硬脂酸鋁。
權(quán)利要求
1.應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)豬細(xì)小病毒疫苗的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)將微載體和生物反應(yīng)器滅菌后，加入細(xì)胞生長液，接種制苗用細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待微載體 上的細(xì)胞形成致密的單層，接種豬細(xì)小病毒，并繼續(xù)培養(yǎng)，使病毒繁殖；所述的制苗用細(xì)胞 為對豬細(xì)小病毒毒株敏感的細(xì)胞，且細(xì)胞為IBRS-2、PK-15或ST細(xì)胞；⑵待細(xì)胞病變達(dá)到 80%以上時，停止培養(yǎng)，收獲病毒液；(3)對收獲的病毒液進(jìn)行超濾濃縮和病毒滅活；(4)通 過柱層析方法純化滅活的病毒制成疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)豬細(xì)小病毒疫苗的方法，其特征 在于所述的生物反應(yīng)器設(shè)定參數(shù)為pH 6. 5 7. 8、溫度33 37°C、溶氧30 80%、攪拌 速度30 lOOrpm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)豬細(xì)小病毒疫苗的方法，其特征 在于病毒的接種量為0. 0001 0. IMOI。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3之一所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)豬細(xì)小病毒疫苗的方 法，其特征在于所述的生物反應(yīng)器容積為14 150L ；或，制苗用細(xì)胞經(jīng)過14L 40L或 14L 40L 150L逐級放大培養(yǎng)后，于40L或150L生物反應(yīng)器培養(yǎng)狂犬病毒；或，直接用 14L、40L或150L的生物反應(yīng)器培養(yǎng)病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 3之一所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)豬細(xì)小病毒疫苗的方 法，其特征在于所述的微載體為Cytodex系列微載體，微載體的使用密度為2 25g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 3之一所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)豬細(xì)小病毒疫苗的方 法，其特征在于所述的生物反應(yīng)器為攪拌式生物反應(yīng)器。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 3之一所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)豬細(xì)小病毒疫苗的方 法，其特征在于所述的生物反應(yīng)器的培養(yǎng)采用批式、流加或灌注培養(yǎng)的方式，灌注的速率 根據(jù)細(xì)胞的密度為每天0. 5 4個工作體積。
全文摘要
本發(fā)明提供一種應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)豬細(xì)小病毒疫苗的方法，包括如下步驟(1)將微載體和生物反應(yīng)器滅菌后，加入細(xì)胞生長液，接種制苗用細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待微載體上的細(xì)胞形成致密的單層，接種豬細(xì)小病毒，并繼續(xù)培養(yǎng)，使病毒繁殖；(2)待細(xì)胞病變達(dá)到80％以上時，停止培養(yǎng)，收獲病毒液；(3)對收獲的病毒液進(jìn)行超濾濃縮和病毒滅活；(4)通過柱層析方法純化滅活的病毒制成疫苗。本發(fā)明具有工藝參數(shù)可控性好，細(xì)胞密度高，病毒效價高，疫苗安全性好、質(zhì)量穩(wěn)定可靠，生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12R1/93GK102038945SQ20101028213
公開日2011年5月4日 申請日期2010年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月15日
發(fā)明者劉漢平, 朱薇, 李偉, 李晶梅, 溫文生, 漆世華, 秦紅剛, 靖志強(qiáng) 申請人:武漢中博生物股份有限公司