專利名稱：毛白楊中的MYB類轉(zhuǎn)錄因子PtrMYB01及其cDNA的克隆方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及到生物基因技術(shù)領(lǐng)域中克隆技術(shù)，具體涉及到毛白楊中一個新的MYB類轉(zhuǎn)錄因子及其cDNA的克隆。
背景技術(shù)：
毛白楊Populus tomentosa Carr為楊柳科楊屬植物，落葉喬木，高達30米，胸徑達2米，是我國特有的鄉(xiāng)土樹種。毛白楊分布范圍很廣，北起我國遼寧南部、內(nèi)蒙古，南至長江流域，以黃河中下游為適生區(qū)。毛白楊樹干高大、適應(yīng)性強、纖維較長，是重要的民用和工業(yè)木材。另外毛白楊具有清熱利濕，止咳化痰的藥效，對肝炎、痢疾、淋濁、咳嗽痰喘都有一定療效.由于毛白楊具有如此巨大的應(yīng)用價值，研究人員在提高毛白楊產(chǎn)量方面做了大量研究。賈之春等O010)將來源于益母草的LJAMP2基因轉(zhuǎn)入毛白楊中，顯著增加了毛白楊對潰瘍病的抗性，提高了毛白楊的產(chǎn)量。LHu等000 將mtlD基因轉(zhuǎn)入毛白楊中，明顯的增強了其抗鹽性，擴大了毛白楊的栽種范圍。自Paz-Ares等從單子葉植物玉米中克隆出與色素合成相關(guān)的ZmMYBCl基因以來， 大量MTO類基因從各種植物中得以分離鑒定。其中在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)超過198個MTO家族基因，玉米基因組中有超過80個MYB轉(zhuǎn)錄因子，而棉花中發(fā)現(xiàn)大約有200個MYB轉(zhuǎn)錄因子。 功能研究表明，MTO參與了植物次生代謝，激素和環(huán)境因子應(yīng)答，并對細胞分化、細胞周期以及葉片等器官形態(tài)建成具有重要的調(diào)節(jié)作用。在MTO轉(zhuǎn)錄因子的眾多生理作用中，抗逆性作用尤其引起了研究人員的關(guān)注。近年來也在植物中鑒定出了許多參與植物抗逆脅迫應(yīng)答的MTO轉(zhuǎn)錄因子新基因。 如厚葉旋蒴苣苔中的BcMYBl受干旱強烈誘導(dǎo)，同時能對PEG、高鹽、低溫等脅迫產(chǎn)生一定程度的應(yīng)答，但在外源脫落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJa)、水楊酸(SA)的處理下，其表達量卻很低，說明可能通過一種不依賴ABA的途徑參與調(diào)控基因表達從而對干旱產(chǎn)生應(yīng)答。擬南芥的AtMYB2和AtMYB60也被證實參與植物的耐旱脅迫過程。擬南芥中的MYB68基因在根中柱鞘細胞中特異表達，高溫脅迫下，根中MYB68活性增強，而MYB68突變體的生長活力比野生型低，說明參與高溫應(yīng)答反應(yīng)。水稻中的0sMYB4基因的高量表達能顯著提高轉(zhuǎn)基因植物對干旱、高鹽、UV輻射等的耐受性。擬南芥中的MYB家族成員基因LAFl、AtMYB2UPAPl 及PAP2等均參與光信號傳導(dǎo)途徑，在黃酮醇生物合成途徑中，查爾酮合酶(OB)、查爾酮黃烷酮異構(gòu)酶(CFI)、黃烷酮羥化酶(F3H)和黃酮醇合酶(FLQ這4個基因的啟動子中均含有大量的光調(diào)節(jié)元件(LRUs)，擬南芥中這4個基因一致應(yīng)答光誘導(dǎo)。植物抗逆性的分子機制研究表明，植物的抗逆性是由多基因控制的，而且許多脅迫因子對植物的傷害結(jié)果具有一致性，如干旱脅迫與鹽脅迫引起組織脫水。擬南芥的AtMYB2轉(zhuǎn)錄因子，在逆境下表達增強，同時也增強了干旱應(yīng)答基因rd22和AtADHl的表達。在干旱脅迫下AtMYB2也作為ABA 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活子發(fā)揮功能。Eleonora Cominelli等人證明得知AtMYB60在擬南芥葉片保衛(wèi)細胞中表達并調(diào)節(jié)擬南芥葉片氣孔開閉中起到積極的作用，使得過量表達AtMYB60的擬南芥植株具有高度抗旱性。同時，Jong-Sug Park等人證明AtMYB60在生菜中的異位表達使得生菜葉片失去了原本的暗紅色，已知生菜葉片中的暗紅色源自于黃酮代謝過程中的DFR基因的表達產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。通過進一步實驗，Jong-Sug Park等人證明AtMYB60在生菜黃酮代謝過程中抑制了 DFR基因的表達，使得黃酮代謝過程受阻，所以失去了葉片的暗紅色。由此可知， AtMYB60在植物中不僅有調(diào)節(jié)氣孔開閉從而加強植株抗旱性的功能，還能調(diào)節(jié)葉片中黃酮代謝過程中關(guān)鍵酶基因的表達，是植物生長過程中非常重要的一個轉(zhuǎn)錄因子。而本發(fā)明中從毛白楊中新發(fā)現(xiàn)的PtrMYBOl轉(zhuǎn)錄因子與AtMYB60高度同源，因此PtrMYBOl轉(zhuǎn)錄因子可能在植物的抗旱、抗寒等抗逆性方面起著積極作用。因此若將該基因通過基因工程的手段轉(zhuǎn)入植物中，使植物獲得較強的抗逆性，將具有極大的實際意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種可能對植物抗逆性其積極作用的新的轉(zhuǎn)錄因子PtrMYBOl，它具有SEQID NO. 2所示的序列 SEQ IDN0. 2的信息
(a)序列特征 長度322氨基酸 類型氨基酸眷鏈型單鏈眷拓撲結(jié)構(gòu)線型
(b)分子類型蛋白質(zhì)
(c)序列描述 Met Gly Arg Pro 1
Pro Trp Thr Pro
Glu His Gly Pro
Leu Leu Arg Cys
Leu Arg Pro Gly
Lys Met lie lie
Ala lie Ala Ser
Asn Phe Trp Asn
Ala Gly Gln Glu
Pro Cys Cys Asp Lys lie Gly Val Lys Lys Gly 51015
Glu Glu Asp lie lie Leu Val Ser Tyr lie Gln 202530
Gly Asn Trp Arg Ala Val Pro Thr Ser Thr Gly 354045
Ser Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr 505560
lie Lys Arg Gly Asn Phe Thr Asp His Glu Glu 657075
His Leu Gln Ala Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ala 808590
Tyr Leu Pro Gln Arg Thr Asp Asn Asp lie Lys 95100105
Thr His Leu Lys Lys Lys Leu Arg Lys Leu Gln 110115120
Gly Gln Ser Arg Asp Gly Leu Ser Ser Thr Gly
Ser Asp Gly Tyr Asn Gln Ala Asp Gly
Gln Ile Lys Glu Ile
Gln Asn
Ile
Met
Pro Ser Lys Pro Arg
Ser
Ser Leu
Gly Lys Phe
Ala Asn Asp
Met Ser Pro
Ser Ser
Asp lie
Glu Asp
Ala Gly Glu
Lys Asp Gly Ser Asp Gln Ala Asp
125 Ser 140 Ala 155 Ser 170 Ala 185 Leu 200 Asn 215 Ser 230 Thr 245 Phe 260 Thr 275 Val 290 Met 305 Asn 320
Arg Arg
Gly Gln
Leu Leu
Thr
Leu
Ser
Glu Lys Thr
Gln Ala Thr Pro Gly Thr
Leu Ser Ser
Gly Asp Gly
Leu Ser
Ser Ser
Leu Phe
Trp Leu Gly lie Trp Gln Glu Gln Asn Gln
Pro Leu Ser Leu
Gln
Leu
Gly Phe
Lys Asp
130 Glu 145 Cys 160 Leu 175 Tyr 190 Met 205 Asn 220 Gly 235 Ala 250 Ser 265 Asp 280 lie 295 Tyr 310
Arg Glu Lys Ala lie
Arg Ala
Leu Gln
Leu Ser
Pro Ser
Ser Ser
Ser
Ser Phe Thr
Phe Asp Glu Glu lie
Pro Glu Phe Ser Arg Asn
Gly lie Asp
Cys Thr Pro Asp Lys
Ser Leu
Ser Gln
Lys Trp Glu
Pro
Leu
Val
135 Thr 150 Pro 165 Gly 180 Glu 195 Lys 210 Thr 225 Ala 240 Phe 255 Ser 270 Asn 285 Phe 300 Thr 315
氺
322
本發(fā)明還提供一種能編碼可能對植物抗逆性其積極作用的新的轉(zhuǎn)錄因子 PtrMYBOl的新基因，以及包含所述基因的表達載體，該基因cDNA具有SEQ ID NO. 1所示序列SEQ ID NO 1 的信息(a)序列特征 長度969bp 類型核酸 鏈型雙鏈 拓撲結(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否
(e)最初來源毛白楊(Populus tomentosa Carr)(f)序列描述:SEQ ID NO. 1atgggcagac caccttgctg tgataagata ggagtgaaaa aaggaccatg gactcctgag 60gaagatatca tcttggtatc atatattcaa gaacatggtc ctgggaattg gagagctgtg 120ccaactagta caggactgct tagatgcagt aagagttgca gattgagatg gactaattac 180ctaaggccag ggatcaaacg tggtaatttt accgatcacg aggagaagat gataatccac 240ctccaagccc ttctaggcaa cagatgggct gccatagctt catacctccc tcagagaaca 300gcagggcaag aaggtcagtc tagagatggg ttatcatcaa caggttcaca gcaaatttct 360gcagggcaag aaggtcagtc tagagatggg ttatcatcaa caggttcaca gcaaatttct 420agaggccaat gggagagaag gcttcaaact gatatcaaca tggctaggca agccctatgc 480gaggccttgt ctcccggtaa accaagcagc ttgttaaccg ggttgaaacc ctcttgtggg 540tatgaaaaac cagctacaga accaatctat gcatcaagca ctgaaaatat atccagattg 600ctcaaaggat ggatgataag tgggcctaag cagtcgctaa aaaattcaac tactcagaat 660tccttcatcg atacggctgg agctgattca ctgtctagtg aagggactcc tgataaagca 720gacaaaaatg gcactggatt atcacaggca tttgaatcac tctttggttt tgactctttc 780gactcttcaa attcagattt ctctcaatcc atgtcgcctg atactggcct tttccaagac 840gaaagtaagc caaattccag tgctcaagtg ccactgtcat tgattgagag gtggctattt 900gatgaaggag ccatgcaagg gaaagattac ataaacgaag tcacaataga tgaagataat 960ctcttctag 969。本發(fā)明的毛白楊MYB類轉(zhuǎn)錄因子PtrMYBOlcDNA的克隆方法如下(1)從毛白楊中提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；(2)根據(jù)PtrMYBOl轉(zhuǎn)錄因子的保守序列設(shè)計特異性引物Fdtsd 5-ATGGGCAGACCACCTTGCTG-3Rdtsd 5-GAGCCCTCCCACTAGAAGAG-3(3)通過鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴增到一個DNA片段；(4)將擴增產(chǎn)物純化，取純化物克隆到pCXSN載體，轉(zhuǎn)化DH5 a細胞。上述方法具體操作如下從毛白楊材料中提取總RNA，再反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA第一鏈合成取4_10 U g總 RNA和1 ill 0. 5 ii g/ ill的Oligo (dT) 18primer,小心混勻，70°C保溫5分鐘，立即浸入冰水 中。按次序分別加入下列試劑5 ill 5 X M-MLV RT Buffer2u 1 dNTP mix(2. 5mM)1 u 1 RNase 抑制劑(30U/ U 1)Iyl M-MLV Reverse Transcriptase然后加DEPC水到25 u 1.小心混勻，室溫離心5秒，將所有溶液收集到管底，370C 保溫1小時，再90°C處理5分鐘，冰上冷卻。鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)試劑與條件如下首先將下列試劑混在一起ddH2018. 25 U 1
10XPCR buffer2. 5μ 1
MgCl21. 5μ 1
dNTP0. 5μ 1
ΙΟμπιοΙ. L-1FSD0. 5μ 1
ΙΟμπιοΙ. L^1RSD0. 5μ 1
cDNA1 μ 1
Pfu酶0. 25 μ 1
總體積25 μ 1
鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)條件為首先94°C變性:3min，然后進入下列循環(huán)94°C 30sec,
55°C 30sec,72°C lmin，共進行 34 個循環(huán)，最后 72°C延伸 lOmin。


圖1是重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意2是轉(zhuǎn)化大腸桿菌的PCR檢測圖3是重組質(zhì)粒的酶切驗證
具體實施例方式實施例1 毛白楊(Populus tomentosa Carr)，實驗室已有材料。1.總 RNA 提?、佟⑷≈参锝M織5g加入液氮充分研磨，轉(zhuǎn)到一支預(yù)冷50mL的離心管中，順序加入 15mL異硫氰酸胍溶液，1. 5mL 2M NaAc (pH4. 0)，15mL水飽和酚和3mL氯仿/異戊醇。混勻后置冰上15min。②、4°C，15000g離心30min轉(zhuǎn)上清于另一管中，加等體積異丙醇，混勻_20°C沉淀 Ihr. ο③、4°C，15000g離心25min，棄去上清，加5mL異硫氰酸胍溶液溶解沉淀后再加異丙醇_20°C沉淀Ihr。離心收集RNA沉淀，70%乙醇洗一次后晾干，加500 μ 1 DEPC處理的水溶RNA。取5 μ 1電泳檢測完整性，取5 μ 1測紫外吸收值檢測純度及濃度。2. cDNA第一鏈的合成取4 μ g 總 RNA 禾口 1 μ 1 0. 5 μ g/ μ 1 的 Oligo (dT) 18primer,小心混勻，70°C保溫 5 分鐘，立即浸入冰水中。按次序分別加入下列試劑5μ 1 5XM-MLV RT Buffer2 μ 1 dNTP mix (2. 5mM)1 μ 1 RNase 抑制劑(30U/ μ 1)1 μ 1 M-MLV Reverse Transcriptase然后加DEPC水到25 μ 1.小心混勻，室溫離心5秒，將所有溶液收集到管底，37°C 保溫1小時，再90°C處理5分鐘，冰上冷卻。3. PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)的試劑和條件首先將下列試劑混在一起ddH2018. 25 μ 1
10XPCR buffer2. 5 μ 1MgCl21. 5μ 1dNTP0. 5μ 110 μ mo 1. L^1FSD0. 5 μ 1IOymol-L-1RSD0. 5 μ 1cDNA1 μ 1Pfu 酶0. 25μ1總體積25 μ 1Fdtsd 5-ATGGGCAGACCACCTTGCTG-3Rdtsd 5-GAGCCCTCCCACTAGAAGAG-3鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)條件為首先94°C變性:3min，然后進入下列循環(huán)94°C 30sec, 55°C 30sec,72°C lmin，共進行 34 個循環(huán)，最后 72°C延伸 lOmin。4.高保真酶擴增產(chǎn)物加A體系
(MH2O10 μ 1
IOXPCR buffer2μ 1
MgCl21. 2μ 1
dNTP1 μ 1
擴增產(chǎn)物5. 5μ 1
Taq0. 3μ 1
總體積20 μ 1
反應(yīng)條件72度，1小時
5. PtrMYBOl轉(zhuǎn)錄因子cDNA克隆取4ul加A產(chǎn)物，連接到pCXSN載體上，連接
溫度為16°C，時間為16h。再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a菌株，轉(zhuǎn)化后的菌株在加有抗生素 (Amp+50ppm)的LB固體培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，從平板上挑取抗性菌落用煮沸裂解法鑒定陽性克隆。6.陽性克隆的酶切鑒定①.挑陽性克隆接種于LB(含相應(yīng)抗生素)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)(37°C， 200rpm)8h,再將此活化的菌液取200ul于20ml含相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中(1/100)， 250rpm，37°C 培養(yǎng) 2h。②.質(zhì)粒的提取(用Takara質(zhì)粒抽提試劑盒提取)③.酶切Xcm I酶切反應(yīng)體系
質(zhì)粒15ul )BamHI0. 5ulIOXK Buffer2. 5ulddH202 ul總體積20 ul) ④.電泳檢測
7.陽性克隆的測序選取陽性克隆送至金思特公司測序。所得基因具有SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 所示序列。8.轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105 ①取Iyg左右的質(zhì)粒DNA加入到200ml EHA105感受態(tài)細胞中，混勻后，冰浴 30mino②在37°C水浴 5min 或 42°C水浴 Imin。③冰浴2min，加入800mlLB液體培養(yǎng)基。④在，200rpm搖培1小時后涂在含50 μ g/ml Kanamycin的LB平板上。⑤培養(yǎng)到形成單菌落。將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌于-70°C保存，以用于后續(xù)研究。實施例2:將實施例1中獲得的農(nóng)桿菌DHA105用于侵染植物，獲得轉(zhuǎn)基因植株，可能會增加其抗逆性(如抗寒、抗旱性)，在大田或森林中應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種來源于毛白楊的MYB類轉(zhuǎn)錄因子PtrMYBOl，其特征在于其具有SEQ ID NO. 2 所示的氨基酸序列。
2.一種能編碼轉(zhuǎn)錄因子PtrMYBOl的基因，該基因具有SEQ ID NO. 1所示的序列。
3.—種表達載體，包含權(quán)利要求2所述的基因。
4.權(quán)利要求2所述的基因在大田或森林中增加植物抗逆性方面的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述毛白楊MYB類轉(zhuǎn)錄因子PtrMYBOl的克隆方法，包括如下步驟(1)從毛白楊中提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；(2)根據(jù)PtrMYBOl轉(zhuǎn)錄因子的保守序列設(shè)計特異性引物 Fdtsd 5-ATGGGCAGACCACCTTGCTG-3Rdtsd 5-GAGCCCTCCCACTAGAAGAG-3(3)通過鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴增到一個DNA片段；(4)將擴增產(chǎn)物純化，取純化物克隆到pCXSN載體，轉(zhuǎn)化DH5α細胞。
6.如權(quán)利要求5所述毛白楊MYB類轉(zhuǎn)錄因子PtrMYBOl的克隆方法，其特征在于所述步驟1中反轉(zhuǎn)錄合成cDNA是第一鏈合成cDNA，取4 μ g總RNA和1 μ 1 0. 5 μ g/ μ 1的 Oligo (dT) 18primer,小心混勻，70°C保溫5分鐘，立即浸入冰水中；按次序分別加入下列試劑5 μ 1 5XM-MLV RT Buffer 2 μ 1 dNTP mix 2. 5mM 1 μ 1 RNase 抑制齊[J 30U/ μ 1 1 μ 1 M-MLV Reverse Transcriptase然后加DEPC水到25 μ 1，混勻，室溫離心5秒，將所有溶液收集到管底，37°C保溫1小時，再90°C處理5分鐘，冰上冷卻。
7.如權(quán)利要求5所述毛白楊MTO類轉(zhuǎn)錄因子PtrMYBOl的克隆方法，其特征在于所述鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)試劑與反應(yīng)條件如下首先將下列試劑混在一起 ddH2018. 25 μ 1IOXPCR buffer2. 5 μ 1MgCl21. 5μ 1dNTP0· 5 μ 1.10 μ mo 1. L^1FSD 0. 5 μ 1 IOymol. L^1RSD0. 5 μ 1cDNA1 μ 1Pfu 酶0. 25 μ 1總體積25 μ 1鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)條件為首先94 °C變性:3min，然后進入下列循環(huán)94°C 30sec, 55°C 30sec,72°C lmin，共進行 34 個循環(huán)，最后 72°C延伸 .lOmin。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新的毛白楊MYB類轉(zhuǎn)錄因子PtrMYB01，一種編碼該轉(zhuǎn)錄因子的基因及其cDNA的克隆方法。所述的轉(zhuǎn)錄因子是一種從毛白楊中分離的多肽。通過對其高度同源的同家族轉(zhuǎn)錄因子ATMYB60分析，其可能具有調(diào)控植物抗逆性(抗旱)和調(diào)節(jié)植物黃酮合成代謝的功能。因此，若將PtrMYB01基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物中，由于在植物中過度表達所述基因，可產(chǎn)生一種具有強的抗旱、抗寒植物，從而增加植物產(chǎn)量。本發(fā)明的克隆方法是，從毛白楊中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；根據(jù)該轉(zhuǎn)錄因子的保守序列設(shè)計引物，通過鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴增到一個DNA片段；將擴增產(chǎn)物純化，取純化產(chǎn)物克隆到pCXSN載體，轉(zhuǎn)化DH5α細胞，平板過夜培養(yǎng)。提取轉(zhuǎn)化后大腸桿菌質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，用于后續(xù)研究。
文檔編號C12N15/29GK102399270SQ20101028253
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月15日
發(fā)明者劉松領(lǐng), 王晴嵐, 秦智超, 羅克明 申請人:西南大學(xué)