專利名稱：一種以宣木瓜細(xì)胞培養(yǎng)法制備化合物齊墩果酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法制備生物藥物的方法，具體地說是一種利用宣木 瓜的外植體誘導(dǎo)愈傷組織，并進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)三萜類化合物一齊墩果酸的方法。
背景技術(shù)：
人類對植物次生代謝物質(zhì)的利用有著悠久的歷史，次生代謝物是藥用植物重要有 效成分，但其受植物產(chǎn)量和次生物含量的限制，有些次生物質(zhì)在自然界的含量甚微，從而局 限了植物次生代謝物質(zhì)的廣泛應(yīng)用；同時野生資源日益減少和栽培品種品質(zhì)退化，給臨床 使用和質(zhì)量控制帶來許多困擾。隨著生物技術(shù)方面的長足進(jìn)步，人們把目光聚集在利用生 物技術(shù)獲取植物次生物質(zhì)的研究上。為此，相關(guān)研究的科學(xué)家們經(jīng)過近幾十年的探索發(fā)現(xiàn)， 通過植物細(xì)胞的規(guī)模培養(yǎng)，可以實(shí)現(xiàn)植物次生代謝物質(zhì)“工廠化”高效生產(chǎn)。利用細(xì)胞培養(yǎng) 生產(chǎn)有效成分，能緩解藥用植物資源壓力，對于那些生長條件要求嚴(yán)格、生長緩慢、產(chǎn)量小、 采集困難、價值貴重的植物藥，用這種方法更具有重要意義。通過藥用植物的細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)有以下優(yōu)點(diǎn)(1)四季均可生產(chǎn)，不 受地區(qū)、季節(jié)及有害生物的影響。(2)占地面積少，可對細(xì)胞生長自動控制和代謝過程合理 調(diào)節(jié)，能夠完全在人工條件下進(jìn)行，可以排除病蟲害與農(nóng)藥殘留量的困擾，且能夠嚴(yán)格控制 藥材的質(zhì)量，便于進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。(3)便于篩選高產(chǎn)細(xì)胞株。通過優(yōu)化培養(yǎng)液、培養(yǎng) 條件和選擇優(yōu)良細(xì)胞系的方法，可得到含量高于整株植物栽培的次生代謝產(chǎn)物。研究資料 顯示，有40余種化合物在培養(yǎng)的組織細(xì)胞中含量高于完整植物水平。如培養(yǎng)的人參細(xì)胞中 人參皂甙的含量是天然植物的5. 7倍；雷公藤培養(yǎng)細(xì)胞中雷公藤內(nèi)酯的含量是原植物含量 的49倍。(4)利于生物轉(zhuǎn)化，尋找新的有效藥物成分。植物細(xì)胞內(nèi)存在羥基化酶、氧化酶、 還原酶、甲基化酶、酯化酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、糖苷酶等多種酶，植物培養(yǎng)物作為一種生物反應(yīng)器 轉(zhuǎn)化外源化合物，能夠產(chǎn)生原植物所沒有的，甚至是至今自然界尚未發(fā)現(xiàn)的化合物。(5)個 體差異小，生產(chǎn)周期短，設(shè)備簡單，能節(jié)省人力、物力等。可以在人為提供的一定溫度、光照 時間、濕度、營養(yǎng)激素等條件下進(jìn)行科學(xué)培養(yǎng)生產(chǎn)。根據(jù)需要，按不同藥用植物外植體建立 不同的培養(yǎng)條件，按幾何級數(shù)大量繁殖生長，從而可提供大量的優(yōu)質(zhì)無病毒種苗和高產(chǎn)細(xì) 胞株有利于自動化、規(guī)模化生產(chǎn)，提高生產(chǎn)效率。(6)利用組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的芽變或人 工誘變，或進(jìn)行脫毒，培育新品種，提高藥用植物品質(zhì)。(7)保存種質(zhì)資源。宣木瓜，又名皺皮木瓜，學(xué)名為貼梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai， 屬薔薇科木瓜屬，落葉闊葉灌木，為常用中藥材木瓜的基原，具有很高的藥用價值和食用價 值。中醫(yī)認(rèn)為宣木瓜有舒筋、活絡(luò)、健脾開胃、舒肝止痛、祛風(fēng)除濕之功效，在臨床上可用于 預(yù)防和治療風(fēng)濕病、霍亂、痢疾、腸炎、腳氣病及維生素C缺乏癥等疾病。齊墩果酸是宣木瓜 的主要藥效成分之一。其是五環(huán)二萜類化合物，分子式為C3tlH48O3，是木瓜的主要藥效成分， 純品齊墩果酸為白色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)為308 310°C，不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙 酮和氯仿。有關(guān)資料表明，木瓜中齊墩果酸以單體形式存在。齊墩果酸的主要生理功能有
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1抗腫瘤作用近年來，人們對OA抗腫瘤的作用機(jī)制研究主要通過以下幾方面進(jìn) 行(1)齊墩果酸能抗DNA突變、抑制癌變的啟動。(2)齊墩果酸具有腫瘤逆轉(zhuǎn)作用及抗侵 襲性。(3)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。(4)抑制腫瘤血管形成。總之，OA的抗癌作用幾乎貫穿了 腫瘤發(fā)展的各個階段。2保肝作用齊墩果酸化學(xué)結(jié)構(gòu)有雙鍵、羥基、羧基等多個活潑官能團(tuán)，易發(fā)生一 些化學(xué)反應(yīng)，如與體內(nèi)毒性物質(zhì)結(jié)合，起到解肝毒作用。齊墩果酸預(yù)處理也可防止四氯化碳 誘導(dǎo)的肝谷胱甘肽的排空。動物實(shí)驗(yàn)還證實(shí)經(jīng)預(yù)處理可將肝中金屬硫蛋白(MT)增加了近 30倍。經(jīng)臨床驗(yàn)證，齊墩果酸可有效治療病毒性肝炎，是抗病毒性肝炎藥的主要活性成分。3降血脂、降血糖早期文獻(xiàn)報(bào)道，齊墩果酸可降低實(shí)驗(yàn)性糖尿病大、小鼠血糖水 平，對實(shí)驗(yàn)性高血脂癥大鼠和兔均有明顯的降脂作用。4對心血管作用齊墩果酸對心血管疾病作用是其藥理作用研究的新發(fā)現(xiàn)。有研 究指出，齊墩果酸對實(shí)驗(yàn)性高血壓大鼠無直接降壓作用，但有直接的強(qiáng)心作用。當(dāng)鑒于其同 時具有降壓、強(qiáng)心及抗心律失常作用，對于高血壓合并心絞痛及心力衰竭的患者將是一個 很好選擇。目前國內(nèi)外對宣木瓜齊墩果酸的作用機(jī)理和作用效果研究成果較多。在醫(yī)藥上已 經(jīng)廣泛應(yīng)用，在功能食品開發(fā)方面越來越受到重視。木瓜藥食兼用，已有較大規(guī)模的利用宣 木瓜果實(shí)來加工罐頭、果脯、果醬、果酒、果汁等，將其制成保健食品的種類也越來越多。宣 木瓜性味甘平微寒、無毒，適合食用，且有益健康。所以目前市場對宣木瓜及其藥用成分需 求量增長迅速，而目前的生產(chǎn)方式并不能滿足市場的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種以宣木瓜細(xì)胞培養(yǎng)法制備化合物齊墩果酸的方法，所要解決的 技術(shù)問題是利用宣木瓜的外植體對愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)、擴(kuò)大培養(yǎng)、細(xì)胞大規(guī)模的懸浮培養(yǎng) 最后生產(chǎn)齊墩果酸。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種以宣木瓜細(xì)胞培養(yǎng)法制備化合物齊墩果酸的方法，以宣木瓜莖段為起始原 料，包括宣木瓜愈傷組織的誘導(dǎo)、愈傷組織繼代優(yōu)化培養(yǎng)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)以及齊墩果酸的 分離和提取，包括以下步驟(1)培養(yǎng)基的配制配制MS固體培養(yǎng)基，每升蒸餾水加入6-8g瓊脂，30-32g蔗糖，lmg2，4_D，0. 5mg KT，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH在5. 5-6.0之間。分裝于IOOml的三角瓶中，每瓶25ml左右，然后進(jìn)行 高壓消毒，壓力為1. 0-1. 5Kg/cm2之間，時間為20分鐘。(2)以宣木瓜莖段為材料，用75%的酒精浸泡4_6s，隨后轉(zhuǎn)移至0. 升汞溶液中 進(jìn)行表面消毒6-lOmin，將莖段切成0. 8-1. 2cm小段，接種于已配制的MS固體培養(yǎng)基上，培 養(yǎng)溫度為25士 1°C，經(jīng)過15 20d左右的培養(yǎng)，在切口處獲得較多的愈傷組織；(3)將誘導(dǎo)出的愈傷組織從母體分離，對其進(jìn)行繼代培養(yǎng)，溫度25 士 1°C，通過調(diào) 節(jié)不同糖濃度、不同PH值、不同培養(yǎng)條件等對愈傷組織的培養(yǎng)進(jìn)行優(yōu)化，每次調(diào)控的周期 為三周左右，5次以上繼代后，獲得顏色為淺黃色的疏松的愈傷組織，此時的愈傷組織可建 立懸浮細(xì)胞體系；
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(4)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)以多次繼代后所得的宣木瓜疏松愈傷組織為試驗(yàn)材料，接種于MS液體培養(yǎng)基進(jìn) 行懸浮培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基未加瓊脂，其余和固體培養(yǎng)基組成相同。分裝于250ml三角瓶中， 每瓶裝液量為95-100ml，接種量為3-5g，接入培養(yǎng)瓶后放入恒溫的懸浮振蕩器，培養(yǎng)條件 為溫度25 士 1°C，搖床轉(zhuǎn)速110-120轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)20-22天；通過調(diào)節(jié)不同的碳源，不同 起始PH，不同激素等對懸浮培養(yǎng)條件篩選優(yōu)化。(5)分離提取齊墩果酸懸浮后獲得的細(xì)胞懸浮液，對其進(jìn)行抽濾，收集濾紙上面的新鮮愈傷組織，置于 60°C烘箱烘干至恒定質(zhì)量進(jìn)行研磨。稱取愈傷粉Ig置于三角瓶中，加入95%乙醇25ml，混 合，在超聲條件下提取30min，蒸餾回收溶劑，得到的浸膏狀的物質(zhì)用水和氯仿洗滌幾次，合 并洗滌液，棄水層，蒸餾氯仿，獲得齊墩果酸用無水乙醇溶解并定容至25ml。然后對其用紫 外分光光度計(jì)進(jìn)行分析測定。本發(fā)明以宣木瓜莖段為原始材料，對外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，建立并篩選出適合通 過細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)齊墩果酸的懸浮培養(yǎng)體系。設(shè)計(jì)了相應(yīng)的生長、生產(chǎn)培養(yǎng)基配方。該方 法有培養(yǎng)周期短、效率高、對環(huán)境無污染等特點(diǎn)。本發(fā)明較已有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)生產(chǎn)過程完全可控，不受自然環(huán)境的影響；(2)無農(nóng)藥及重金屬殘留；(3)提取工藝簡單；(4)低成本，節(jié)約大量耕地，提高資源利用率和石榴經(jīng)濟(jì)林的綜合經(jīng)濟(jì)價值；(5)生產(chǎn)效率高宣木瓜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的齊墩果酸最高含量達(dá)到6. 88%，遠(yuǎn)高于 宣木瓜成熟果實(shí)中齊墩果酸的含量。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)以實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)為例，非限定實(shí)施例敘述如下下面以實(shí)施例形式詳細(xì)敘述本發(fā)明的宣木瓜細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)齊墩果酸化合物的工 藝流程(不限于本實(shí)施例)1、培養(yǎng)基的配制配制MS固體培養(yǎng)基，每升加入6-8g瓊脂，30-32g蔗糖，Img2，4-D，0. 5mgKT，調(diào)節(jié)培 養(yǎng)基PH在5. 5-6.0之間。分裝于IOOml的三角瓶中，每瓶25ml左右，然后進(jìn)行高壓消毒， 壓力為1. 0-1. 5Kg/cm2之間，時間為20分鐘。2、愈傷組織的誘導(dǎo)以宣木瓜莖段為材料，用75%的酒精浸泡4_6s，隨后轉(zhuǎn)移至0. 升汞溶液中 進(jìn)行表面消毒6-lOmin，將莖段切成0. 8-1. 2cm小段，接種于MS固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為 25 士 1°C，經(jīng)過15 20d左右的培養(yǎng)，在切口處獲得較多的愈傷組織；3、愈傷組織繼代優(yōu)化配置不同成分的培養(yǎng)基，將已經(jīng)誘導(dǎo)的愈傷組織繼代于不同的培養(yǎng)基上，主要是 不同培養(yǎng)基組分，及其不同的培養(yǎng)條件對愈傷組織生長的影響，為得到疏松旺盛的懸浮細(xì) 胞材料對繼代的細(xì)胞不斷優(yōu)化。每次優(yōu)化條件溫度25士 1°C、弱光照培養(yǎng)20d左右。挑選
5出顏色嫩黃色，生長疏松旺盛的愈傷進(jìn)行繼代培養(yǎng)，優(yōu)化出最佳狀態(tài)的愈傷組織進(jìn)行下一 步的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。4、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)以多次繼代后的宣木瓜疏松愈傷組織為試驗(yàn)材料，接種于MS液體培養(yǎng)基進(jìn)行懸 浮培養(yǎng)，培養(yǎng)基的組成(1)相同，分裝于250ml三角瓶中，每瓶裝液量為95-100ml，接種量為 3_5g，接入培養(yǎng)瓶后放入恒溫的懸浮振蕩器，培養(yǎng)條件為溫度25 士 1°C，搖床轉(zhuǎn)速110-120 轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)20-22天；以多次繼代后的宣木瓜疏松愈傷組織為試驗(yàn)材料，接種于MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行 懸浮培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基未加瓊脂，其余和固體培養(yǎng)基組成相同，分裝于250ml三角瓶中，每 瓶裝液量為95-100ml，接種量為3-5g，接入培養(yǎng)瓶后放入恒溫的懸浮振蕩器.培養(yǎng)條件為 溫度25 士 1°C，搖床轉(zhuǎn)速110-120轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)20天后每瓶細(xì)胞鮮重增長較大，最多的可 達(dá)19. 49g，培養(yǎng)物齊墩果酸含量最高的達(dá)6. 88%，高于宣木瓜總的齊墩果酸含量。優(yōu)化培 養(yǎng)細(xì)胞，使細(xì)胞生長旺盛的同時能夠得到最大產(chǎn)量的齊墩果酸。4、分離提取齊墩果酸懸浮后獲得的細(xì)胞懸浮液，對其進(jìn)行抽濾，收集濾紙上面的新鮮愈傷組織，置于 60°C烘箱烘干至恒定質(zhì)量進(jìn)行研磨。稱取愈傷粉Ig置于三角瓶中，加入95%乙醇25ml，混 合，在超聲條件下提取30min，蒸餾回收溶劑，得到的浸膏狀的物質(zhì)用水和氯仿洗滌幾次，合 并洗滌液，棄水層，蒸餾氯仿，獲得齊墩果酸用無水乙醇溶解并定容至25ml，然后對其用紫 外分光光度計(jì)進(jìn)行分析測定。
權(quán)利要求
1. 一種以宣木瓜細(xì)胞培養(yǎng)法制備化合物齊墩果酸的方法，以宣木瓜莖段為起始原料， 包括宣木瓜愈傷組織的誘導(dǎo)、愈傷組織繼代優(yōu)化培養(yǎng)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)以及齊墩果酸的分離 和提取，包括以下步驟(1)培養(yǎng)基的配制配制MS固體培養(yǎng)基，每升蒸餾水加入6-8g瓊脂，30-32g蔗糖，lmg2，4-D，0. 5mg KT,調(diào) 節(jié)培養(yǎng)基PH在5. 5-6. 0之間，分裝于IOOml的三角瓶中，每瓶25ml左右，然后進(jìn)行高壓消 毒，壓力為1.0-1.5Kg/cm2之間，時間為18-22分鐘；(2)以宣木瓜莖段為材料，用75%的酒精浸泡4-6s，隨后轉(zhuǎn)移至0.1-0. 12%升汞溶液 中進(jìn)行表面消毒6-lOmin，將莖段切成0. 8-1. 2cm小段，接種于已配制的MS固體培養(yǎng)基上， 培養(yǎng)溫度為24-26°C，經(jīng)過15 20d左右的培養(yǎng)，在切口處獲得較多的愈傷組織；(3)將誘導(dǎo)出的愈傷組織從母體分離，對其進(jìn)行繼代培養(yǎng)，溫度24-26°C，通過調(diào)節(jié)不 同糖濃度、不同PH值、不同培養(yǎng)條件等對愈傷組織的培養(yǎng)進(jìn)行優(yōu)化，每次調(diào)控的周期為三 周左右，5-8次繼代后，獲得顏色為淺黃色的疏松的愈傷組織，此時的愈傷組織可建立懸浮 細(xì)胞體系；(4)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)以多次繼代后所得的宣木瓜疏松愈傷組織為試驗(yàn)材料，接種于MS液體培養(yǎng)基進(jìn)行懸 浮培養(yǎng)，分裝于250ml三角瓶中，每瓶裝液量為95-100ml，接種量為3_5g，接入培養(yǎng)瓶后放 入恒溫的懸浮振蕩器，培養(yǎng)條件為溫度24-26°C，搖床轉(zhuǎn)速110-120轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)20-22 天；通過調(diào)節(jié)不同的碳源，不同起始PH值，不同激素等對懸浮培養(yǎng)條件篩選優(yōu)化；其中，所述的MS液體培養(yǎng)基的配制和步驟(1)所述的配制MS固體固體培養(yǎng)基相同，只 是不加瓊脂；(5)分離提取齊墩果酸懸浮后獲得的細(xì)胞懸浮液，對其進(jìn)行抽濾，收集濾紙上面的新鮮愈傷組織，置于60°C烘 箱烘干至恒定質(zhì)量進(jìn)行研磨；稱取愈傷粉Ig置于三角瓶中，加入95 %乙醇25ml，混合，在超 聲條件下提取30min，蒸餾回收溶劑，得到的浸膏狀的物質(zhì)用水和氯仿洗滌幾次，合并洗滌 液，棄水層，蒸餾氯仿，獲得齊墩果酸用無水乙醇溶解并定容至25ml，然后對其用紫外分光 光度計(jì)進(jìn)行分析測定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以宣木瓜細(xì)胞培養(yǎng)法制備化合物齊墩果酸的方法，首先以宣木瓜莖段為外植體接種MS固體培養(yǎng)基，于25±1℃條件下誘導(dǎo)愈傷組織，然后通過誘導(dǎo)出的愈傷組織的繼代，優(yōu)化培養(yǎng)，使愈傷組織達(dá)到疏松旺盛的狀態(tài)，適合懸浮培養(yǎng)。再將優(yōu)化后的愈傷組織接種在MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，再次通過優(yōu)化，得到生長旺盛，次生代謝物質(zhì)較高的培養(yǎng)條件，經(jīng)分離提純得到齊墩果酸。培養(yǎng)物中齊墩果酸含量達(dá)6.88％，高于宣木瓜成熟果實(shí)中的含量。本發(fā)明方法具有培養(yǎng)周期短、效率高、對環(huán)境無污染等特點(diǎn)。
文檔編號C12N5/04GK102002086SQ20101028514
公開日2011年4月6日 申請日期2010年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月15日
發(fā)明者丁之恩, 丁昱, 付廣俊, 楊松, 王敏麗, 程江華 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)