專利名稱：一種谷氨酸棒桿菌及利用該菌制備l-鳥氨酸及其鹽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域，涉及一種高產(chǎn)L-鳥氨酸的谷氨酸棒桿菌及利用該菌 制備L-鳥氨酸及其鹽的方法。
背景技術(shù)：
L-鳥氨酸是生物體內(nèi)普遍存在的氨基酸之一，它是杰費于1877年在喂養(yǎng)安息香 酸的鳥尿的水解液中發(fā)現(xiàn)的。L-鳥氨酸是活細(xì)胞中重要的代謝化合物，是細(xì)菌細(xì)胞膜和多 肽類抗生素的組成成分，它主要參與生物體內(nèi)的尿素循環(huán)，用于生物體內(nèi)瓜氨酸、精氨酸、 脯氨酸、多胺的生物合成，對于體內(nèi)氨態(tài)氮的排出有重要作用。近年來，國內(nèi)外對L-鳥氨酸 產(chǎn)品的開發(fā)逐漸升溫，市場前景日益廣闊。L-鳥氨酸鹽酸鹽是活細(xì)胞中重要的代謝化合物，對于生物體內(nèi)氨態(tài)氮的排出有重 要調(diào)節(jié)作用，鳥氨酸和精氨酸一起亦可增加合成代謝的荷爾蒙。此外，L-鳥氨酸與α-酮 戊二酸結(jié)合構(gòu)成營養(yǎng)補劑復(fù)合鳥氨酸膠囊(OKG)，可修復(fù)肌肉損傷；L-鳥氨酸和L-門冬氨 酸的復(fù)方制劑可用于治療因急慢性肝病所致的高血氨癥。以L-鳥氨酸為原料制備的依氟 鳥氨酸，能抑制多胺合成，延緩腫瘤細(xì)胞生長，是頗具前景的新型抗癌藥物。L-鳥氨酸除在 醫(yī)藥上作為試劑與注射液外，通常還用于配制保肝、強身、解毒的營養(yǎng)劑以及生產(chǎn)消除疲勞 的發(fā)泡飲料。目前，L-鳥氨酸的制備方法主要有化學(xué)合成法、水解精氨酸法、微生物發(fā)酵法等。George等用丙烯醛、氰化氫、氨氣、二氧化碳為原料，經(jīng)過多步化合和分解反應(yīng)得 到L-鳥氨酸。該方法以簡單的有機物質(zhì)為起始原料，經(jīng)過多步化學(xué)反應(yīng)合成產(chǎn)品。此法的 不足之處在于原料氰化氫是劇毒致癌物質(zhì)，會給生產(chǎn)帶來很大的安全隱患；反應(yīng)步驟多， 每步反應(yīng)不徹底，收率不高；反應(yīng)會得到D-鳥氨酸和L-鳥氨酸共存的外消旋化合物，產(chǎn)物 的手性拆分給分離純化工藝增加了難度和成本。精氨酸廣泛存在于蛋白質(zhì)中，可以從天然蛋白的水解液中獲得精氨酸，另外發(fā) 酵法生產(chǎn)精氨酸工藝已比較成熟。因此以精氨酸為初始原料生產(chǎn)L-鳥氨酸在國內(nèi)外都 有廣泛的研究。如近幾年發(fā)表的專利KR95-09319是固定化酶，由L-精氨酸轉(zhuǎn)化為理論 值的97%，溫度25-40°C，pH7-8，酶活可保持6天。又如美國專利US5405761是1995年 M. Kyriukos等用從牛肝中提取的酶制備多種L-鳥氨酸鹽。但是，水解精氨酸法制備L-鳥 氨酸的弱點在于其經(jīng)濟效益要受制于精氨酸和鳥氨酸之間的市場差價，并且L-精氨酸轉(zhuǎn) 化率為理論值的90% -97%，提取率85%，據(jù)此計算生產(chǎn)1噸L-鳥氨酸鹽酸鹽至少需要 1. 6-1. 7噸的L-精氨酸，因此，此法難以大規(guī)模生產(chǎn)，也限制了 L-鳥氨酸的應(yīng)用。采用微生物發(fā)酵法制備L-鳥氨酸為近年來主要采用的制備工藝之一，該法拓 寬了 L-鳥氨酸的來源，推動了 L-鳥氨酸的研究和應(yīng)用。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-鳥氨 酸不僅可以降低L-鳥氨酸生產(chǎn)成本，而且L-鳥氨酸質(zhì)量提高，性質(zhì)穩(wěn)定。目前，用于 生產(chǎn)L-鳥氨酸的微生物有很多，如①谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)的瓜氨酸缺陷(Cit_)或精氨酸缺陷(Arg_)突變株；②乳酸發(fā)酵短桿菌、川崎短桿菌 (Brevibacteriumkawasaki) ^ τβ ι ^β' (Arthrobacter citreus) 白勺 Arg_，$_ [21]； ③大腸桿菌、枯草桿菌、產(chǎn)氣氣桿菌、帕特介里變形桿菌(Proteus retigeri)的Arg_突變 株；④解烴棒桿菌(C. hydrocarbodastue)和一種石蠟節(jié)桿菌(A. pataffineus)的Arg-突 變株；⑤潔白鏈霉菌(Steptomyces virginiae)的Lys_和硫胺素_雙重缺陷突變株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種高產(chǎn)L-鳥氨酸的谷氨酸棒桿菌。本發(fā)明另一個目的是提供利用該菌制備L-鳥氨酸及其鹽的方法。本發(fā)明目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)本發(fā)明中的選育并保臧的微生物菌株谷氨酸棒桿菌 (Corynebacteriumglutamicum) 1006，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心保藏，保藏號=CGMCC No. 3663，以此菌作為生產(chǎn)菌株。本發(fā)明中谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) 1006 (保藏號 CGMCCNo. 3663)的理化性質(zhì)、培養(yǎng)特點、分類鑒定依據(jù)及遺傳穩(wěn)定性L-鳥氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌 1006 (Corynebacterium glutamicum 1006)為 L-Arg-和D-Arf缺陷型菌株，該菌無運動能力，不形成芽孢，革蘭氏染色呈陽性。在顯微鏡 下觀察，該菌呈短棒狀，兩端稍鈍圓，微彎，細(xì)胞呈單個、成對、八字形排列或柵狀排列。在 完全培養(yǎng)基平板上形成圓形菌落，淡黃色，直徑l_2mm，菌落中央隆起，表面光滑、濕潤，邊 緣整齊，不產(chǎn)生水溶性色素，易被牙簽挑起，在基本培養(yǎng)基上無法生長。其最適生長溫度為 30-32°C, pH6. 5-7. 5 時生長良好。生理生化性質(zhì)見表1 表1菌株1006的生理生化性能
試驗名稱試驗結(jié)果試驗名稱試驗結(jié)果淀粉水解試驗—甲基紅(MR)試驗—油脂水解試驗伏-普(VP)試驗—明膠液化試驗檸檬酸鹽試驗+糖發(fā)酵試驗■苯丙氨酸脫氨酶試驗—吲哚試驗—尿素水解試驗+硫化氫產(chǎn)生試驗—硝酸鹽還原試驗+遺傳標(biāo)記采用生長譜法(1)取新鮮活化斜面菌種一滿環(huán)于5mL無菌離心管中，制成菌懸 液。(2)將菌懸液3500r/min離心lOmin，棄去上清液，打勻管底菌團，用無菌生理鹽水洗滌 菌體3次，最后加5mL生理鹽水制備菌懸液。(3)取0. ImL菌懸液于固體基本培養(yǎng)基平板 上，涂布均勻。將平板劃為兩個區(qū)域，每個區(qū)平板表面分別貼上浸有L-精氨酸的濾紙片，倒 置于恒溫培養(yǎng)箱30°C培養(yǎng)24小時，若菌體只能在精氨酸濾紙片區(qū)域生長，則證明該菌株具 有精氨酸缺限標(biāo)記。菌株培養(yǎng)
4
本發(fā)明使用的培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無機鹽等營養(yǎng)因子。碳源以葡萄糖較為合 適；氮源包括有機氮源如蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、玉米漿、酵母水解液等，無機氮源 包括如(NH4)2SCVNH4N03、NH4Cl等，以上氮源可以混合使用；無機鹽指MgSO4 · 7H20，KH2PO4, K2HPO4 · 3H20, NaH2PO4 · 2H20, CaCO3, FeSO4 · 7H20, MnSO4 · H2O, ZnSO4 · 7H20。利用谷氨酸棒桿菌CGMCC No. 3663制備L-鳥氨酸及其鹽的方法，該方法是將所述 谷氨酸棒桿菌在含有碳源、氮源、無機鹽的培養(yǎng)基上28 30°C下培養(yǎng)，生成L-鳥氨酸發(fā)酵 液，發(fā)酵液經(jīng)1萬-15萬道爾頓陶瓷膜除去菌體后，經(jīng)陽離子交換樹脂分離得到L-鳥氨酸 溶液，經(jīng)脫色后鹽酸乙醇法結(jié)晶得到L-鳥氨酸鹽酸鹽。(由于L-鳥氨酸在水中的溶解度非 常大，一般情況很難提取出來，通過成鹽的方式，降低其溶解度，才能形成結(jié)晶，進(jìn)行分離。)本發(fā)明采用的L-鳥氨酸及其鹽分離純化是采用離子交換法。發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜除 去菌體后，清液進(jìn)行離子交換樹脂處理(離子交換樹脂優(yōu)選為JK006陽離子交換樹脂)，對 收集液進(jìn)行減壓濃縮、活性炭脫色，接下來使用濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值，用低級醇類如無水乙醇 進(jìn)行沉淀，得到L-鳥氨酸鹽酸鹽。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明中谷氨酸棒桿菌1006是L_Arg_和D-Arglr缺陷型突變菌株，利用微生物發(fā) 酵法生產(chǎn)L-鳥氨酸，可使得L-鳥氨酸的累積達(dá)到35-45g/L。同時，本發(fā)明L-鳥氨酸鹽酸 鹽的制備方法，發(fā)酵過程簡單，操作方便，培養(yǎng)條件十分粗放，產(chǎn)品符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，完全可以 替代化學(xué)合成及精氨酸水解所得的產(chǎn)品，并且生產(chǎn)成本低。


圖1是本發(fā)明菌株1006精氨酸缺陷標(biāo)記的驗證。圖2是實施例1的發(fā)酵液稀釋100倍后的高效液相圖譜。圖3是實施例2的發(fā)酵液稀釋100倍后的高效液相圖譜。根據(jù)峰面積大小，代入回歸方程Y = 8163927. 714*X_284939. 2，Y為峰面積，X為 鳥氨酸的濃度(mg/mL)。菌株保藏信息本發(fā)明采用的菌株命名為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) 1006，已 在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(簡稱工6110，地址北京市朝陽 區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號CGMCC No. 3663。保藏日期為 2010年3月12日。
具體實施例方式以下實施例將進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行說明。鳥氨酸的含量測定采用高效液相色譜結(jié)合蒸發(fā)光散射系統(tǒng)(HPLC-ELSD)測定。色譜條件為Prevail C18柱，0. 06 % HFBA溶液一乙腈(88 12)為流動相，柱 溫30°C，流速為0.8mL/min，ELSD漂移管溫度110°C，氣體流量2. 8L/min。L-鳥氨酸在 0. l-0.6mg/mL范圍內(nèi)，線性回歸比非常顯著(R2 = 0. 9998)，平均回收率達(dá)到98. 94%。該 法簡便、快速、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，適合于L-鳥氨酸的定量分析。實施例1
斜面培養(yǎng)基葡萄糖lg，蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，瓊脂20g，加水至 1000ml, pH 7. 0-7. 2，121 °C 0. IMpa 滅菌 20min。搖瓶培養(yǎng)基葡萄糖25g，酵母膏 10g, (NH4) 2S0415g, MgSO4 · 7H20 2. 5g，KH2PO4Ig, K2HPO4 ·3Η20 0. 5g，NaH2PO4 ·2Η20 0. 5g，CaCO3IOg,加水至 1000ml，ρΗ7· 6-7. 8，121 °C 0. IMpa 滅菌IOrnin0發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖60g，酵母膏 30g, (NH4) 2S0450g，MgSO4 · 7H20 2. 50g, KH2PO4Ig, K2HPO4 · 3H20 0. 5g, Na2HPO4 · 2H20 0. 50g, CaCO3IOg, FeSO4 · 7H20 36. 6mg/L, MnSO4 · H2O 22. 38mg, ZnSO4 · 7H20 17. 8mg, Biotin(生物素)0. 05mg, VB10. 05mg,力卩 /K 至 1000ml, pH7. 6-7. 8，121 °C 0. IMpa 滅菌 lOmin。將保藏號為CGMCC No. 3663的谷氨酸棒桿菌1006在斜面培養(yǎng)基上30°C靜置培養(yǎng) 18-20h，然后接一環(huán)生長良好的活化菌種至裝有50mL種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，30°C培 養(yǎng)llh，搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min，得到660nm的菌體OD值約為0. 7-0. 8，然后取ImL接種到含有 發(fā)酵培養(yǎng)基30mL的500mL三角瓶中，28°C，200r/min振蕩培養(yǎng)72h，最后測定發(fā)酵液中含 L-鳥氨酸 38. 5g/L。實施例2將葡萄糖180g,酵母膏 90g，(NH4) 2S04150g，MgSO4 · 7H20 7. 5g，KH2P043g， K2HPO4 · 3H20 1. 5g, Na2HPO4 · 2H20 1. 5g, CaC0330g, FeSO4 · 7H20 0. lg, MnSO4 · H2OO. 067g, ZnSO4 · 7H20 0. 053g, Biotin 0. 15mg, Vbi 0. 15mg,調(diào)節(jié) pH 為 7. 6-7. 8，用水定容至 3L,裝入 5L自動玻璃攪拌發(fā)酵罐，121°C蒸汽滅菌lOmin。將活化后的保藏號為CGMCC No. 3663的谷氨酸棒桿菌1006用種子培養(yǎng)基30°C 培養(yǎng)Ilh得到種子液，將120mL的種子液，接入冷卻后的5L發(fā)酵罐，28°C培養(yǎng)，(通風(fēng)比 1 0.7vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為220r/min)，隨著培養(yǎng)時間的增加，L-鳥氨酸不斷增加，到72h，發(fā) 酵液中含L-鳥氨酸為45g/L。實施例3同實施例2，過程控制pH值(陶瓷膜操作pH)在6. 8士0. 05，終了發(fā)酵液采用 截留分子量為5萬道爾頓的二氧化鈦陶瓷膜，操作壓力差0. 22MPa，溫度58°C，通量為 192L ·πΓ2化―1，有效的除去菌體；清液經(jīng)JK006陽離子交換樹脂吸附，0. 5mol/L的氨水洗脫， 純水洗雜，收集液濃縮除氨，活性炭脫色；脫色液用濃鹽酸調(diào)節(jié)PH為4. 8，溫度20°C，攪拌轉(zhuǎn) 速200r/min，用乙醇溶液結(jié)晶，結(jié)晶時間為6h，制得L-鳥氨酸鹽酸鹽結(jié)晶，收率為88. 1%， 純度為98. 7%。(收率的計算提取分離前后，分別使用HPLC-ELSD檢測含量，得到數(shù)據(jù)。 純度的測定稱取一定量的產(chǎn)品，溶解后，HPLC-ELSD測定含量，獲得純度數(shù)據(jù)。)離子交換樹脂選擇依據(jù)選用5種不同型式的陽離子交換樹脂(JK006，LH-8，F(xiàn)PC, DK110, WA-2)進(jìn)行靜態(tài) 吸附實驗。分別稱取等量的樹脂于各三角瓶中，加入25g/L的L-鳥氨酸發(fā)酵液各50mL，置 于轉(zhuǎn)速為IOOrpm、溫度為20°C的搖床中吸附6小時，取樣分析溶液中L-鳥氨酸的濃度，比 較各種樹脂對L-鳥氨酸吸附量的影響。各種離子交換樹脂對L-鳥氨酸的靜態(tài)吸附量見表2。表2各種樹脂對L-鳥氨酸吸附量的比較(其他同實施例3)
權(quán)利要求
一種谷氨酸棒桿菌，命名為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)1006，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCC No.3663。
2.利用權(quán)利要求1所述谷氨酸棒桿菌制備L-鳥氨酸及其鹽的方法，其特征在于將所述 谷氨酸棒桿菌在含有碳源、氮源、無機鹽的培養(yǎng)基上28 30°C下培養(yǎng)，生成L-鳥氨酸發(fā)酵 液，發(fā)酵液經(jīng)1萬-15萬道爾頓陶瓷膜除去菌體后，經(jīng)陽離子交換樹脂分離得到L-鳥氨酸 溶液，經(jīng)脫色后鹽酸乙醇法結(jié)晶得到L-鳥氨酸鹽酸鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于培養(yǎng)基的氮源包括有機氮源和無機氮 源，其中有機氮源包括蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、玉米漿、酵母水解液，無機氮源包括 (NH4) 2S04、NH4NO3、NH4Cl，以上氮源可以混合使用。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于培養(yǎng)基的無機鹽為MgSO4· 7H20, KH2PO4, K2HPO4 · 3H20, NaH2PO4 · 2H20, CaCO3, FeSO4 · 7H20, MnSO4 · H2O, ZnSO4 · 7H20 中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于采用的離子交換樹脂為JK006型陽離子交 換樹脂。
全文摘要
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域，公開了一種谷氨酸棒桿菌及利用該菌制備L-鳥氨酸及其鹽的方法。該菌為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)1006，保藏號CGMCCNo.3663。將該菌在含有碳源、氮源、無機鹽的培養(yǎng)基上28～30℃下培養(yǎng)，生成L-鳥氨酸發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)1萬-15萬道爾頓陶瓷膜除去菌體后，經(jīng)陽離子交換樹脂分離得到L-鳥氨酸溶液，經(jīng)脫色后鹽酸乙醇法結(jié)晶得到L-鳥氨酸鹽酸鹽。本發(fā)明菌體培養(yǎng)簡單，有利于工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。利用該菌生產(chǎn)L-鳥氨酸可使得L-鳥氨酸的累積達(dá)到35-45g/L。
文檔編號C12N1/20GK101955901SQ20101028623
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月19日
發(fā)明者萬紅貴, 蔡恒, 袁建鋒, 陸彬 申請人:南京工業(yè)大學(xué)