專利名稱：一種遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子病理學(xué)領(lǐng)域，涉及一種遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因(突變型)(下文中也稱為“SCA相關(guān)基因”或“SCA相關(guān)基因突變型”)。本發(fā)明還涉及含有所述遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因的重組載體、含有該重組載體的重組細(xì)胞、所述遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因的編碼蛋白。本發(fā)明還涉及一種遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因的外顯子及其編碼蛋白。
背景技術(shù)：
遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(hereditaryspinocerebellar ataxias, SCA)是一種具有高度的臨床和遺傳異質(zhì)性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其遺傳方式多呈常染色體顯性遺傳(autosomal dominant，AD)，患者多于中青年發(fā)病，臨床上以小腦性共濟(jì)失調(diào)為主要特征，同時還可伴有眼球運(yùn)動障礙、慢眼活動、視神經(jīng)萎縮、視網(wǎng)膜色素變性、錐體束征、 錐體外系表現(xiàn)、肌萎縮、周圍神經(jīng)病和癡呆等表現(xiàn)。發(fā)病率約為5-7/100，000 (khols L， et al. Autosomal dominant cerebellarataxias :clinical features，genetics，and pathogenesis. Lancet Neurol2004 ；3 :291-304. ；Tsuji S，et al. Sporadic ataxias in Japan__apopulation-based epidemiological study. Cerebellum 2008 :189—97·)。該病發(fā)病機(jī)制未完全明確，目前尚無有效的治療方法。隨著分子遺傳學(xué)研究的發(fā)展，到目前已經(jīng)定位了 31種亞型，其中19個遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)致病基因已被克隆，包括ATAXim、ATAXIN2、MJD、Puratrophin-I、 SPTBN2、CACNA1A、ATXN7、ATXN80S/ATXN8、ATXN10、TTBK2、PPP2R2B、KCNC3、PRKCG、 ITPRl、TBP、FGF14、AFG3L2、PLEKHG4、以及 DRPLA(Di Bella D, et al. Mutations in the mitochondrialprotease gene AFG3L2cause dominant hereditary ataxia SCA28. N atGenet 2010 ；42 :313-21. ；Matilla-Duenas A, et al. Cellular andmolecular pathways triggering neurodegeneration in thespinocerebelIar ataxias. Cerebellum 2010 ；9 148-66. ；Sato N, et al.Spinocerebellar ataxia type 31is associated with" inserted" penta-nucleotide repeats containing (TGGAA)n. Am J Hum Genet2009 ；85 :544-57.)。但是，全球范圍內(nèi)約有33%的SCA患者并沒有上述的19個遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)致病基因突變的情況，其致病基因尚不清楚。已知轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶6 (transglutaminase 6，簡稱為TG6)，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，其中包括小腦的浦肯野細(xì)胞。據(jù)文獻(xiàn)報導(dǎo)，TG6可能參與多種疾病如帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默病等發(fā)病過程(Jeitner TM, Muma NA, Battaile KP, Cooper AJ. Transglutaminase activation in neurodegenerativediseases. Future Neurol 2009 ；4 :449-67.)。尸體解剖發(fā)現(xiàn)，在谷蛋白共濟(jì)失調(diào)患者的小腦中有TG6蛋白的沉積；動物實驗也發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)注射抗TG2/3/6單鏈抗體，可以導(dǎo)致小鼠共濟(jì)失調(diào)樣表型 (Hadjivassiliou M，Aeschlimann P，Strigun A，Sanders DS, Woodroofe N，Aeschlimann D.Autoantibodies in gluten ataxiarecognize a novel neuronal transglutaminase.Ann Neurol 2008 ；64 :332-43.以及 Boscolo S, Lorenzon A, Sblattero D, Florian F, Stebel Μ,Marzari R,et al. Anti transglutaminase antibodies cause ataxia inmice. PLoS One 2010 ；5 :e9698.)。已知上述的TG6由TGM6基因編碼。TGM6基因在GenBank中有兩種剪接形式，一種剪接形式的ID號為NC_000020. 10，另一種剪接形式的ID號為NT_011387. 8。NC_000020. 10 的編碼序列(codingsequence，簡稱為CDS)如SEQ ID NO :1所示，其由2121個堿基組成，編碼的蛋白由706個氨基酸組成，所述蛋白的氨基酸序列如SEQID NO :2所示。ΝΤ_011387. 8 的編碼序列如SEQ ID NO :3所示，其由1878個堿基組成，編碼的蛋白由625個氨基酸組成， 所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。TGM6基因的兩種剪接形式的編碼序列(SEQ ID NO 1)或(SEQ ID NO 3)中第10號外顯子如SEQID NO 5所示。新的遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因的克隆有利于SCA患者的分子診斷，也可為研究SCA的發(fā)病機(jī)理提供重要線索。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)過不懈的努力，發(fā)現(xiàn)了一種遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因，并由此提供了下述發(fā)明本發(fā)明的一個方面涉及一種分離的遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因(突變型)，所述遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因突變型有兩種剪接形式，一種剪接形式的核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示，另一種剪接形式的核苷酸序列如SEQ ID NO :8所示。遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因(突變型)的第一種剪接形式(SEQ ID NO 6) 由2121個堿基組成，具體序列如下(突變后的堿基G用邊框標(biāo)出)ATGGCAGGGATCAGAGTCACCAAGGTGGACTGGCAGCGGTCGAGGAATGGCGCTGCCCACCACACCCAG GAGTACCCCTGCCCTGAGCTGGTGGTTCGCAGGGGCCAGTCGTTCAGCCTCACGCTGGAGCTGAGCAGAGCCCTGGA CTGTGAGGAGATCCTCATCTTCACGATGGAGACAGGACCCCGGGCTTCTGAGGCCCTCCACACCAAAGCTGTGTTCC AGACATCGGAGCTGGAGCGGGGTGAGGGCTGGACAGCAGCAAGGGAGGCTCAGATGGAGAAAACTCTGACCGTCAGT CTCGCCAGCCCTCCCAGTGCTGTCATTGGCCGCTACCTGCTGAGCATCAGGCTTTCCTCTCACCGCAAACACAGCAA CCGGAGGCTGGGCGAGTTTGTTCTCCTTTTCAACCCATGGTGTGCAGAGGACGATGTGTTTCTGGCCTCAGAGGAGG AGAGACAGGAGTACGTGCTCAGCGACAGCGGCATCATCTTCCGAGGCGTGGAGAAGCACATACGAGCCCAGGGCTGG AACTACGGGCAGTTTGAGGAGGACATCCTGAACATCTGCCTCTCCATCCTGGATCGAAGCCCCGGTCACCAAAACAA CCCAGCCACCGACGTGTCCTGCCGCCACAACCCCATCTACGTCACCAGGGTCATCAGTGCCATGGTGAACAGCAACA ACGACCGAGGTGTGGTGCAAGGACAGTGGCAGGGCAAGTACGGCGGCGGCACCAGCCCGCTGCACTGGCGCGGCAGC GTGGCCATTCTGCAGAAGTGGCTCAAGGGCAGGTACAAGCCAGTCAAGTACGGCCAGTGCTGGGTCTTCGCCGGAGT CCTGTGCACAGTCCTCAGGTGCTTGGGGATAGCCACACGGGTCGTGTCCAACTTCAACTCAGCCCACGACACAGACC AGAACCTGAGTGTGGACAAATACGTGGACTCCTTCGGGCGGACCCTGGAGGACCTGACAGAAGACAGCATGTGGAAT TTCCATGTCTGGAATGAGAGCTGGTTTGCCCGGCAGGACCTAGGCCCCTCTTACAATGGCTGGCAGGTTCTGGATGC CACCCCCCAGGAGGAGAGTGAAGGTGTGTTCCGGTGCGGCCCAGCCTCAGTCACCGCCATCCGCGAGGGTGATGTGC ACCTGGCTCACGATGGCCCCTTCGTGTTTGCGGAGGTCAACGCCGACTACATCACCTGGCTGTGGCACGAGGATGAG AGCCGGGAGCGTGTATACTCAAACACGAAGAAGATTGGGAGATGCATCAGCACCAAGGCGGTGGGCAGTGACTCCCG CGTGGACATCACTGACCTCTACAAGTATCCGGAAGGGTCCCGGAAAGAGAGGCAGGTGTACAGCAAGGCGGTGAACAGGCTGTTCGGCGTGGAAGCCTCTGGAAGGAGAATCTGGATCCGCAGGGCTGGGGGTCGCTGTCTCTGGCGTGACGAC CTCCTGGAGCCTGCCACCAAGCCCAGCATCGCTGGCAAGTTCAAGGTGCTAGAGCCTCCCATGCTGGGCCACGACCT
GAGACTGGCCCTGTGCT ^GGCCAACCTCACCTCCCGGGCCCAGCGGGTGAGGGTCAACCTGAGCGGTGCCACCATC
CTCTATACCCGCAAGCCAGTGGCAGAGATCCTGCATGAATCCCACGCCGTGAGGCTGGGGCCGCAAGAAGAGAAGAG AATCCCAATTACAATATCTTACTCTAAGTATAAAGAAGACCTGACAGAGGACAAGAAGATCCTGTTGGCTGCCATGT GCCTTGTCACCAAAGGAGAGAAGCTTCTGGTGGAGAAGGACATTACTCTAGAGGACTTCATCACCATCAAGGTTCTG GGCCCAGCCATGGTGGGAGTGGCAGTTACAGTGGAAGTGACAGTAGTCAACCCCCTCATAGAGAGAGTGAAGGACTG TGCGCTGATGGTGGAGGGCAGCGGCCTTCTCCAGGAACAGCTCAGCATCGACGTGCCTACCCTGGAGCCTCAGGAGA GGGCCTCAGTCCAGTTTGACATCACCCCCTCCAAAAGTGGCCCAAGGCAGCTGCAGGTGGACCTTGTAAGCCCTCAC TTCCCGGACATCAAGGGCTTTGTGATCGTCCATGTGGCCACTGCCAAGTGA (SEQ ID NO 6)突變型遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因(SEQ ID NO 6)與野生型遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因(SEQ ID NO 1)在序列上的區(qū)別是野生型SCA相關(guān)基因(SEQ ID NO 1)第1550位的堿基為T，突變型SCA相關(guān)基因(SEQ ID NO 6)的第1550位堿基突變?yōu)镚。遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因(突變型)的第二種剪接形式(SEQ ID NO 8) 由1878個堿基組成，具體序列如下(突變后的堿基G用邊框標(biāo)出)ATGGCAGGGATCAGAGTCACCAAGGTGGACTGGCAGCGGTCGAGGAATGGCGCTGCCCACCACACCCAG GAGTACCCCTGCCCTGAGCTGGTGGTTCGCAGGGGCCAGTCGTTCAGCCTCACGCTGGAGCTGAGCAGAGCCCTGGA CTGTGAGGAGATCCTCATCTTCACGATGGAGACAGGACCCCGGGCTTCTGAGGCCCTCCACACCAAAGCTGTGTTCC AGACATCGGAGCTGGAGCGGGGTGAGGGCTGGACAGCAGCAAGGGAGGCTCAGATGGAGAAAACTCTGACCGTCAGT CTCGCCAGCCCTCCCAGTGCTGTCATTGGCCGCTACCTGCTGAGCATCAGGCTTTCCTCTCACCGCAAACACAGCAA CCGGAGGCTGGGCGAGTTTGTTCTCCTTTTCAACCCATGGTGTGCAGAGGACGATGTGTTTCTGGCCTCAGAGGAGG AGAGACAGGAGTACGTGCTCAGCGACAGCGGCATCATCTTCCGAGGCGTGGAGAAGCACATACGAGCCCAGGGCTGG AACTACGGGCAGTTTGAGGAGGACATCCTGAACATCTGCCTCTCCATCCTGGATCGAAGCCCCGGTCACCAAAACAA CCCAGCCACCGACGTGTCCTGCCGCCACAACCCCATCTACGTCACCAGGGTCATCAGTGCCATGGTGAACAGCAACA ACGACCGAGGTGTGGTGCAAGGACAGTGGCAGGGCAAGTACGGCGGCGGCACCAGCCCGCTGCACTGGCGCGGCAGC GTGGCCATTCTGCAGAAGTGGCTCAAGGGCAGGTACAAGCCAGTCAAGTACGGCCAGTGCTGGGTCTTCGCCGGAGT CCTGTGCACAGTCCTCAGGTGCTTGGGGATAGCCACACGGGTCGTGTCCAACTTCAACTCAGCCCACGACACAGACC AGAACCTGAGTGTGGACAAATACGTGGACTCCTTCGGGCGGACCCTGGAGGACCTGACAGAAGACAGCATGTGGAAT TTCCATGTCTGGAATGAGAGCTGGTTTGCCCGGCAGGACCTAGGCCCCTCTTACAATGGCTGGCAGGTTCTGGATGC CACCCCCCAGGAGGAGAGTGAAGGTGTGTTCCGGTGCGGCCCAGCCTCAGTCACCGCCATCCGCGAGGGTGATGTGC ACCTGGCTCACGATGGCCCCTTCGTGTTTGCGGAGGTCAACGCCGACTACATCACCTGGCTGTGGCACGAGGATGAG AGCCGGGAGCGTGTATACTCAAACACGAAGAAGATTGGGAGATGCATCAGCACCAAGGCGGTGGGCAGTGACTCCCG CGTGGACATCACTGACCTCTACAAGTATCCGGAAGGGTCCCGGAAAGAGAGGCAGGTGTACAGCAAGGCGGTGAACA GGCTGTTCGGCGTGGAAGCCTCTGGAAGGAGAATCTGGATCCGCAGGGCTGGGGGTCGCTGTCTCTGGCGTGACGAC CTCCTGGAGCCTGCCACCAAGCCCAGCATCGCTGGCAAGTTCAAGGTGCTAGAGCCTCCCATGCTGGGCCACGACCT
GAGACTGGCCCTGTGCT §GGCCAACCTCACCTCCCGGGCCCAGCGGGTGAGGGTCAACCTGAGCGGTGCCACCATC
CTCTATACCCGCAAGCCAGTGGCAGAGATCCTGCATGAATCCCACGCCGTGAGGCTGGGGCCGCAAGAAGAGAAGAG AATCCCAATTACAATATCTTACTCTAAGTATAAAGAAGACCTGACAGAGGACAAGAAGATCCTGTTGGCTGCCATGTGCCTTGTCACCAAAGGAGAGAAGCTTCTGGTGGAGAAGGACATTACTCTAGAGGACTTCATCACCATCAAGCGTGCC TACCCTGGAGCCTCAGGAGAGGGCCTCAGTCCAGTTTGA (SEQ ID NO 8)突變型遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因的第二種剪接形式(SEQ ID NO 8)與野生型遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因?qū)?yīng)的剪接形式(SEQ ID NOd)在序列上的區(qū)別是野生型SCA相關(guān)基因(SEQ ID NO⑶第1550位的堿基為T，突變型SCA相關(guān)基因(SEQ ID NO 8)的第1550位堿基突變?yōu)镚。本發(fā)明的又一方面涉及遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因突變型的兩種剪接形式(SEQ ID NO :6和SEQ ID NO 8)所編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列分別如SEQ ID N0:7和 SEQ ID NO 9 所示。其中，遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因突變型第一種剪接形式所編碼的蛋白質(zhì)由706個氨基酸組成，具體序列如下(突變后的色氨酸用邊框標(biāo)出)(SEQ ID NO 7)MAGIRVTKVDWQRSRNGAAHHTQEYPCPELVVRRGQSFSLTLELSRALDCEEILIFTMETGPRASEALH TKAVFQTSELERGEGWTAAREAQMEKTLTVSLASPPSAVIGRYLLSIRLSSHRKHSNRRLGEFVLLFNPWCAEDDVF LASEEERQEYVLSDSGIIFRGVEKHIRAQGffNYGQFEEDILNICLSILDRSPGHQNNPATDVSCRHNPIYVTRVISA MVNSNNDRGVVQGQWQGKYGGGTSPLHWRGSVAILQKWLKGRYKPVKYGQCWVFAGVLCTVLRCLGIATRVVSNFNS AHDTDQNLSVDKYVDSFGRTLEDLTEDSMWNFHVWNESWFARQDLGPSYNGWQVLDATPQEESEGVFRCGPASVTAI RE⑶VHLAHDGPFVFAEVNADYITWLWHEDESRERVYSNTKKIGRCISTKAVGSDSRVDITDLYKYPEGSRKERQVY
SKAVNRLFGVEASGRRIWIRRAGGRCLWRDDLLEPATKPSIAGKFKVLEPPMLGHDLRLALC @ ANLTSRAQRVRVN LSGATILYTRKPVAEILHESHAVRLGPQEEKRIPITISYSKYKEDLTEDKKILLAAMCLVTKGEKLLVEKDITLEDF ITIKVLGPAMVGVAVTVEVTVVNPLIERVKDCALMVEGSGLLQEQLSIDVPTLEPQERASVQFDITPSKSGPRQLQV DLVSPHFPDIKGFVIVHVATAK(SEQ ID NO 7)遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因突變型第一種剪接形式所編碼的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 7)與野生型SCA基因所對應(yīng)的剪接形式編碼的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 2)在序列上的區(qū)別是SEQ ID NO 3第517位的氨基酸為亮氨酸(Leu)，SEQ ID NO 7的第517位的氨基酸為色氨酸CTrp)。遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因突變型第二種剪接形式所編碼的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 9)所示的蛋白質(zhì)由625個氨基酸組成，具體序列如下(突變后的色氨酸用邊框標(biāo)出)MAGIRVTKVDWQRSRNGAAHHTQEYPCPELVVRRGQSFSLTLELSRALDCEEILIFTMETGPRASEALH TKAVFQTSELERGEGWTAAREAQMEKTLTVSLASPPSAVIGRYLLSIRLSSHRKHSNRRLGEFVLLFNPWCAEDDVF LASEEERQEYVLSDSGIIFRGVEKHIRAQGffNYGQFEEDILNICLSILDRSPGHQNNPATDVSCRHNPIYVTRVISA MVNSNNDRGVVQGQWQGKYGGGTSPLHWRGSVAILQKWLKGRYKPVKYGQCWVFAGVLCTVLRCLGIATRVVSNFNS AHDTDQNLSVDKYVDSFGRTLEDLTEDSMWNFHVWNESWFARQDLGPSYNGWQVLDATPQEESEGVFRCGPASVTAI RE⑶VHLAHDGPFVFAEVNADYITWLWHEDESRERVYSNTKKIGRCISTKAVGSDSRVDITDLYKYPEGSRKERQVY
SKAVNRLFGVEASGRRIWIRRAGGRCLWRDDLLEPATKPSIAGKFKVLEPPMLGHDLRLALC @ ANLTSRAQRVRVN
LSGATILYTRKPVAEILHESHAVRLGPQEEKRIPITISYSKYKEDLTEDKKILLAAMCLVTKGEKLLVEKDITLEDF ITIKRAYPGASGEGLSPV(SEQ ID NO :9)遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因突變型第二種剪接形式所編碼的蛋白質(zhì)(SEQID NO 9)與野生型與野生型SCA基因所對應(yīng)的剪接形式編碼的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 4)在序列上的區(qū)別是=SEQ IDNO :4第517位的氨基酸為亮氨酸(Leu)，SEQ ID NO 9的第517位的氨基酸為色氨酸(Trp)。本發(fā)明所述一種遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因(突變型)的兩種剪接形式， 并不局限于上述SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 8所示的具體核苷酸序列?？紤]到遺傳密碼的兼并性，本發(fā)明所述SCA相關(guān)基因(突變型)的兩種剪接形式，包括分別編碼SEQ ID NO 7 或SEQID NO 9所示氨基酸序列的任一核苷酸序列。在本發(fā)明的一個具體的實施方式中，本發(fā)明人檢測了一個SCA疾病患者家系，發(fā)現(xiàn)SCA患者中本發(fā)明所述遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因的第1550位堿基均由T變?yōu)?G，其所編碼的蛋白質(zhì)第517氨基酸相應(yīng)的由亮氨酸(Leu)突變?yōu)樯彼?Trp)。本發(fā)明的又一方面涉及一種重組載體，其含有本發(fā)明的遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因突變型；本發(fā)明的還一方面涉及一種重組細(xì)胞，其含有該重組載體。本發(fā)明還涉及一種分離的遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因突變型的外顯子(10 號外顯子)，其核苷酸序列如SEQ ID N0:10所示(突變后的堿基G用邊框標(biāo)出)GGTCCCGGAAAGAGAGGCAGGTGTACAGCAAGGCGGTGAACAGGCTGTTCGGCGTGGAAGCCTCTGGAA GGAGAATCTGGATCCGCAGGGCTGGGGGTCGCTGTCTCTGGCGTGACGACCTCCTGGAGCCTGCCACCAAGCCCAGC
ATCGCTGGCAAGTTCAAGGTGCTAGAGCCTCCCATGCTGGGCCACGACCTGAGACTGGCCCTGTGCT^GGCCAACC
TCACCTCCCGGGCCCAGCGGGTGAGGGTCAACCTGAGCGGTGCCACCATCCTCTATACCCGCAAGCCAGTGGCAGAG ATCCTGCATGAATCCCACGCCGTGAGGCTGGGGCCGCAAGAAG (SEQ ID NO 10)與野生型遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因的10號外顯子(SEQID NO 5)相比， 突變型的10號外顯子(SEQ ID NO 10)的第214堿基由T突變?yōu)镚。本發(fā)明的又一方面涉及突變型遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因外顯子(SEQ ID NO :10)編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO :12所示(突變后的色氨酸用邊框標(biāo)出)。GSRKERQVYSKAVNRLFGVEASGRRIWIRRAGGRCLWRDDLLEPATKPSIAGKFKVLEPPMLGHDLRLA LC @ ANLTSRAQRVRVNLSGATILYTRKPVAEILHESHAVRLGPQE(SEQ ID NO 12)與野生型遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因的10號外顯子編碼蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :11)相比，突變型所編碼的蛋白中第72位的氨基酸由亮氨酸突變?yōu)樯彼?。本發(fā)明所述一種遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因(突變型)的10號外顯子，并不局限于上述SEQ ID NO 10所示的具體核苷酸序列?？紤]到遺傳密碼的兼并性，本發(fā)明所述SCA相關(guān)基因(突變型)的外顯子包括編碼SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的任一核苷酸序列。本發(fā)明的又一方面涉及一種重組載體，其含有本發(fā)明的遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因突變型的10號外顯子。本發(fā)明的又一方面涉及一種重組細(xì)胞，其含有該重組載體。發(fā)明的有益效果本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因，對該基因的檢測可能用于SCA患者的輔助診斷，特別是產(chǎn)前診斷，指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育，并且可能有利于明確SCA患者的分子診斷及分子分型。本發(fā)明可以對SCA的發(fā)病機(jī)理提供重要線索，對SCA的診斷治療具有十分重要的意義。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著， 黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1 遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因與SCA疾病關(guān)系的驗證發(fā)明人采集到一個四代遺傳的常染色體顯性SCA家系，家系內(nèi)患者表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的行走困難和小腦性構(gòu)音障礙，絕大部分患者存在腱反射活躍/亢進(jìn)，部分患者伴有手部震顫和痙攣性斜頸，頭部核磁共振成像檢查(MRI)示小腦中度萎縮及腦干輕度萎縮。分別對該家系內(nèi)18名正常人(男7名，女11人)、9名SCA患者(男5名，女4 名)、以及3名臨床診斷不明確者(男2名，女1名)的基因組中遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因進(jìn)行檢測，通過PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化，測序的方法獲得遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因10號外顯子的序列，根據(jù)序列測定結(jié)果屬于突變型遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因(SEQ ID NO 10)還是野生型遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因(SEQ ID N0:5)，驗證遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因與SCA的相關(guān)性。具體步驟如下1) DNA 提取分別采取上述的18名正常人、9名SCA患者、以及3名臨床診斷不明確者的外周靜脈血，每人5mL，經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝，常規(guī)酚/氯仿法提取基因組DNA，分光光度計測DNA含量， 并稀釋至20ng/ μ L ；2) PCR 檢測根據(jù)遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因10號外顯子的核苷酸序列設(shè)計如下的引物正向引物5'gCCAgTTTgACTTCCATgAgCC 3' (SEQ IDNO 13)反向引物5'CCTCTgACCTCCACAACCCTCC 3‘ (SEQ IDNO 14)PCR 反應(yīng)體系10 μ LLA Taq 酶(5U/ μ L)0. 1 μ L2 X GC Buffer I (加入了 Mg2+) 5. 0 μ L2mM dNTP0. 4 μ L正向引物(lOOng/μL)0. 2 μ L反向引物(lOOng/μL)0. 2 μ LDNA 模板1 μ LddH20力口至 10 μ L反應(yīng)條件如下面的表1所示表1 :PCR反應(yīng)條件
權(quán)利要求
1.一種分離的遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因突變型，其編碼SEQ ID NO :7或SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因突變型，其核酸序列如SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO 8 所示。
3.—種重組載體，其含有權(quán)利要求1所述的遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因突變型。
4.一種重組細(xì)胞，其含有權(quán)利要求3所述重組載體。
5.一種分離的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO :7或SEQ IDNO :9所示。
6.一種分離的遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因突變型外顯子，其編碼SEQ ID NO 12 所示的氨基酸序列。
7.如權(quán)利要求6所述的遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因突變型外顯子，其核酸序列如 SEQ ID NO 10 所示。
8.—種重組載體，其含有權(quán)利要求6所述的遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因突變型外顯子。
9.一種重組細(xì)胞，其含有權(quán)利要求8所述重組載體。
10.一種分離的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID N0:12所示。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子病理學(xué)領(lǐng)域，涉及一種遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因(突變型)。具體地，所述遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因編碼SEQ ID NO7或SEQ ID NO9所示的氨基酸序列，更具體地，所述脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因的核酸序列如SEQ ID NO6或SEQ ID NO8所示。本發(fā)明還涉及含有所述脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因的重組載體、含有該重組載體的重組細(xì)胞、以及所述脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因的編碼蛋白。此外，本發(fā)明還涉及一種遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因的外顯子及其編碼蛋白。本發(fā)明為遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)的輔助分子診斷、分子分型、產(chǎn)前診斷、藥物靶點(diǎn)選擇和臨床治療提供了依據(jù)。
文檔編號C12N15/11GK102220337SQ20101028632
公開日2011年10月19日 申請日期2010年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月19日
發(fā)明者唐北沙, 張朋, 王俊嶺, 翁翎, 蘇政, 金鑫 申請人:中南大學(xué), 深圳華大基因科技有限公司