專利名稱：番茄slmbp21基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種番茄離區(qū)發(fā)育相關(guān)基因及其在器官脫落過程中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
器官脫落是植物發(fā)育過程中的重要過程，葉片的脫落，花和果實的脫落以及果莢的開裂等都屬于器官脫落的范疇。同時器官脫落也是一個重要的農(nóng)藝性狀，影響著許多農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，比如我們所熟知的果樹的落花落果，棉花的落蕾落鈴等。器官脫落發(fā)生的部位稱為離區(qū)或離層，離區(qū)是分布在葉柄，花柄或果柄基部的幾層較小的細胞。在器官臨近脫落前，這幾層細胞的細胞壁和胞間層會被果膠酶和纖維素酶所分解，使細胞間發(fā)生分離，當受到外力時，器官就會發(fā)生脫落，因而離區(qū)發(fā)育是研究器官脫落的一個重要的方面。番茄離區(qū)是位于番茄花柄或果柄中部的一個顯著的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，是研究離區(qū)發(fā)育的良好模式。同時番茄也是一種重要的經(jīng)濟作物，是全世界栽培最廣的果菜之一。番茄營養(yǎng)豐富，含有豐富的胡蘿卜素，維生素C，B族維生素和番茄紅素，可以生食，煮食，也可以加工成番茄醬，番茄汁等產(chǎn)品。在番茄產(chǎn)品的加工過程中，番茄果柄的去除是一項繁瑣的工作， 但是“無節(jié)”番茄的出現(xiàn)卻可以解決這個問題，在采摘“無節(jié)”番茄的過程中，果實會從果柄的基部脫落，因而省卻了后續(xù)去除果柄的麻煩。關(guān)于這種“無節(jié)”番茄的產(chǎn)生機理，即番茄離區(qū)發(fā)育的研究有較長的歷史，最早可以追溯到上世紀30年代。但直到2000年才定位和克隆到第一個番茄離區(qū)發(fā)育相關(guān)基因——J0INTLESS，與該基因相對應(yīng)的突變體是3023 (Mao et al.，2000)。此外，J0INTLESS2 和Alq這兩個突變體都是無節(jié)的，并且在Alq中，J0INTLESS表達下調(diào)(Budiman et al., 2004, Pineda et al.，2010)。但是這兩個突變體中的相關(guān)基因還沒有分離出來。目前，番茄離區(qū)發(fā)育的機理仍然未知，J0INTLESS是目前唯一報道的與番茄離區(qū)發(fā)育有關(guān)的基因。J0INTLESS屬于MADS_box基因家族，對擬南芥等模式生物的研究表明，MADS-box 基因是一類在植物發(fā)育過程中起重要作用的基因。該家族基因根據(jù)序列和功能特點又可以分為許多個亞家族，其中SEP亞家族在該類基因行使功能的過程中起重要作用。在擬南芥中，由該亞家族基因所編碼的蛋白能與許多其它MADS-box基因所編碼的蛋白形成復(fù)合體， 共同作用于下游目標基因，調(diào)節(jié)植株的生長發(fā)育，因而該亞家族基因的功能很廣泛，但至今還沒有其參與離區(qū)細胞發(fā)育的報道。在擬南芥中，該亞家族基因功能冗余，但在番茄中已經(jīng)報道的三個SEP類基因卻功能各異，說明番茄中該亞家族基因在功能的行使上同擬南芥中的情況可能有很大的不同，目前番茄中另外兩個SEP類基因，LeMADSl和SLMBP21的功能還未知。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種番茄SLMBP21蛋白。本發(fā)明的另一目的在于提供編碼所述蛋白的番茄SLMBP21基因。
本發(fā)明的目的還在于提供含有所述基因或其片段的載體及其宿主細胞。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種番茄SLMBP21蛋白，其為1)由SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白；或2)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白。本發(fā)明還提供編碼上述蛋白的番茄SLMBP21基因，該基因是從番茄中疏四號(以下簡稱M4)中克隆得到的、屬于MADS-box基因家族的番茄離區(qū)發(fā)育基因，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。序列分析結(jié)果顯示，番茄SLMBP21基因?qū)儆贛ADS-box基因家族，由該基因所編碼的蛋白同其它許多植物中的MADS-box蛋白一樣也具有保守的MADS區(qū)。系統(tǒng)進化分析顯示， 番茄SLMBP21基因?qū)儆赟EP亞家族，由該基因所編碼的蛋白同擬南芥中SEP4的相似性最高，為69%;在番茄中，同LeMADSl的相似性最高，為84%。番茄SLMBP21基因在根、葉等營養(yǎng)器官中表達微弱，在花器官中表達較強；對該基因在花器官中的表達做精細分析后發(fā)現(xiàn)， 該基因在花柄離區(qū)中的表達最強。應(yīng)當理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。例如在非活性區(qū)段，將第(175)位的(A)替換為(V)，或是將第(227)位的(A)缺失，或是在(87位后面) 增加(一個L)。因此，本發(fā)明的番茄SLMBP21蛋白還包括SEQ IDNo. 2所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸，具有番茄SLMBP21蛋白同等活性的由番茄SLMBP21 蛋白衍生得到的蛋白質(zhì)。本發(fā)明基因包括編碼所述蛋白的核酸序列。此外，應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達的密碼子。本發(fā)明還提供含有上述番茄SLMBP21基因或其片段的載體，以及含有該載體的宿主細胞；所述載體為所述番茄SLMBP21基因或其片段的克隆載體或各類表達載體；所述片段是指番茄SLMBP21基因cDNA的一段3’端序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示。具體地說，本發(fā)明將番茄SLMBP21基因cDNA的一段3，端序列(5%bp，其核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示)反向構(gòu)建到雙元載體PBI121中，并在大腸桿菌DH5a中擴繁。本發(fā)明還通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法，將pBI121攜帶的SLMBP21基因cDNA的3’端序列轉(zhuǎn)入番茄，獲得番茄轉(zhuǎn)化植株。本發(fā)明的番茄SLMBP21基因在調(diào)節(jié)番茄離區(qū)的發(fā)育中的應(yīng)用。所述應(yīng)用是指通過抑制番茄SLMBP21基因的表達，產(chǎn)生沒有離區(qū)或離區(qū)發(fā)育不完全的轉(zhuǎn)基因植株，從而解決各種作物、蔬菜、水果、花卉的落花落果問題。本發(fā)明的優(yōu)點在于，本發(fā)明的番茄SLMBP21基因，其屬于MADS-box基因家族的番茄離區(qū)發(fā)育基因，在番茄中抑制SLMBP21基因的表達能夠明顯影響到番茄離區(qū)的發(fā)育，產(chǎn)生沒有離區(qū)或離區(qū)發(fā)育不完全的轉(zhuǎn)基因植株；可用于解決各種作物、蔬菜、水果、花卉的落花落果問題以及番茄的工業(yè)化采摘問題；而且，同J0INTLESS無節(jié)突變體中花序發(fā)育受到影響的情況不同，在SLMBP21轉(zhuǎn)基因植株中，花序發(fā)育不受影響，說明SLMBP21具有更好的應(yīng)用價值。


圖1是本發(fā)明的番茄SLMBP21編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析；圖2是本發(fā)明實施例4的植物表達載體pBI121 ；圖3是本發(fā)明實施例1的克隆中間載體pEASY-TlSimple ；圖4是本發(fā)明實施例5的番茄SLMBP21基因影響番茄離區(qū)發(fā)育圖；圖5是本發(fā)明實施例5的番茄SLMBP21基因影響番茄離區(qū)發(fā)育圖；圖6是本發(fā)明實施例5的番茄SLMBP21基因影響番茄離區(qū)發(fā)育圖；圖7是本發(fā)明實施例6的番茄SLMBP21基因的表達譜；其中，SD，幼苗；R，根；L，葉； IF，花序；Se，萼片；Pe，花瓣；St，雄蕊；Ca，心皮；PP，花柄近軸端；PA，花柄離區(qū)；PF，花柄遠軸端。圖8是本發(fā)明實施例7的番茄SLMBP21基因與J0INTLESS基因在植物細胞體內(nèi)互作圖；圖9是本發(fā)明實施例8的番茄SLMBP21基因和LeMADSl基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達水平；其中，1，2，6，7，12，14代表不同的轉(zhuǎn)基因株系。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖和實施例，進一步詳細說明本發(fā)明。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1番茄SLMBP21基因全長的克隆1)利用核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No. 4 所示的反向引物，從番茄中蔬四號的花柄cDNA中克隆SLMBP21基因的編碼區(qū)序列；PCR 程序94°C，5 分鐘；94°C，30 秒；55°C，30 秒；72°C，45 秒；重復(fù)；35 次；72°C，10 分鐘。PCR 體系 JXfesyiTaq PCR SuperMix (全式金公司) 25 μ 1 ；正向引物(10μ Μ)2μ 1 ；反向引物(10μ Μ)2μ 1 ；DNA 模板5 μ 1 ；雙蒸水補足50 μ 1。將上述PCR產(chǎn)物直接按照TA克隆方法克隆連接到pEASY-TlSimple上(如圖3所示)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，并在其中擴繁，陽性克隆經(jīng)過測序篩選獲得該序列；2)然后利用核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示的正向5’RACE引物和核苷酸序列如 SEQ ID No. 6所示的基因特異反向引物，利用 5，RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) 方法克隆SLMBP21基因的5’非編碼區(qū)序列；5，RACE的步驟按照RACE試劑盒(Invitrogen)的說明操作。PCR 程序94°C，5 分鐘；94°C，30 秒；55°C，30 秒；72°C，30 秒；重復(fù)；35 次；72°C，10分鐘。PCR 體系 JXfesyiTaq PCR SuperMix (全式金公司) 25 μ 1 ；正向引物(10μ Μ)2μ 1 ；反向引物(10μ Μ)2μ 1 ；
DNA 模板5 μ 1 ；雙蒸水補足50 μ 1。將上述PCR產(chǎn)物直接按照TA克隆方法克隆連接到pEASY-TlSimple上(如圖3所示)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，并在其中擴繁，陽性克隆經(jīng)過測序篩選獲得該序列；3)利用核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示的正向基因特異引物和核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示的反向引物，從番茄中蔬四號的花柄cDNA中克隆SLMBP21基因的3’非編碼區(qū)序列；PCR 程序94°C，5 分鐘；94°C，30 秒；55°C，30 秒；72°C，30 秒；重復(fù)；35 次；72°C，10分鐘。PCR 體系 JXfesyiTaq PCR SuperMix (全式金公司) 25 μ 1 ；正向引物(10μ Μ)2μ 1 ；反向引物(10μ Μ)2μ 1 ；DNA 模板5 μ 1 ；雙蒸水補足50 μ 1。將上述PCR產(chǎn)物直接按照TA克隆方法克隆連接到pEASY-TlSimple上(如圖3所示)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，并在其中擴繁，陽性克隆經(jīng)過測序篩選獲得該序列；4)將以上三段序列拼接，獲得番茄SLMBP21基因的全長cDNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，由其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。實施例2番茄SLMBP21蛋白的序列結(jié)構(gòu)分析番茄SLMBP21具有MADS_box家族蛋白的特征序列區(qū)MADS區(qū)(約前60個氨基酸)，同擬南芥中SEP4蛋白序列的相似性為69%，同番茄中LeMADSl蛋白序列的相似性為 84%。結(jié)果如圖1所示。實施例3 番茄SLMBP21蛋白的序列結(jié)構(gòu)分析系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，SLMBP21屬于SEP亞家族，同擬南芥中的SEP1/2/3/4， 矮牽牛中的Wi FBP2/4/5/9/23同處于進化樹中的一個分支。番茄中屬于該亞家族的還有 TM5、TM29、RIN 禾口 LeMADSl0實施例4番茄SLMBP21基因表達載體及轉(zhuǎn)基因植株番茄離區(qū)發(fā)育相關(guān)基因SLMBP21的一段3’端序列(595bp，其核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示)，反向構(gòu)建在圖2所示的植物表達載體PBI121中，用于利用RNA干擾的原理在番茄中抑制SLMBP21的表達水平，進而研究其功能。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法，將pBI121攜帶的SLMBP21基因cDNA的3’端序列轉(zhuǎn)入番茄，以番茄種子無菌播種后的子葉為受體，獲得番茄轉(zhuǎn)化植株，植物中的篩選標記為卡那霉素。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法和步驟如下農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄的方法和步驟如下1.種子準備將1. 5g番茄種子依次經(jīng)95%乙醇洗和20%次氯酸鈉消毒和無菌水清洗后，將種子均勻放置于1/2MS0培養(yǎng)基表面，在培養(yǎng)間光照(1 光照，8h黑暗)培養(yǎng)6天。2.外植體準備當子葉從種皮中長出后，用鋒利的解剖刀將子葉切成25mm2大小，并將子葉近軸面向上放置在盛有濾紙的Dl培養(yǎng)基的表面(注意無菌操作)；于培養(yǎng)間長光照(1 光照，8h黑暗)培養(yǎng)2天。3.農(nóng)桿菌準備固體培養(yǎng)基上活化_70°C存放的農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens，C58C1)，挑單克隆至相應(yīng)抗性的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D_處于0. 6 0. 7之間，收集菌體，MSO清洗懸浮并加入乙酰丁香酮(AQ制備成侵染液。4.共培養(yǎng)用上一步制成的侵染液侵染子葉，侵染完成后將子葉遠軸端朝上培養(yǎng)于新的盛有濾紙(Whatman Filter Paper)和Dl培養(yǎng)基的新培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)間放置2天(16h光照，8h黑暗)。5.選擇轉(zhuǎn)化愈傷將子葉轉(zhuǎn)移至2Z培養(yǎng)基上(沒有濾紙)，約10天更換一次培養(yǎng)基，直至有芽出現(xiàn)后轉(zhuǎn)移至IZ選擇性培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，約兩周更換一次培養(yǎng)基。6.生根當再生苗至少有2cm長并包含至少一個生長點的時候，可從外植體上切下再生苗 (不包括愈傷組織)，將再生苗放入MMSV培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。生根后的植株生長到足夠大時，就可轉(zhuǎn)移至裝有跖石和營養(yǎng)土的培養(yǎng)缽中，于一般生長箱中生長。這些植株即為TO代植株。其中，使用到的培養(yǎng)基配方為Dl 培養(yǎng)基MS0. 44%蔗糖3%瓊脂0.8%pH5. 8120°C高壓滅菌20分鐘后加入以下成分，反式玉米素核苷1. Omg/L2Z 培養(yǎng)基MS0. 44%蔗糖3%瓊脂0.8%pH5. 8120°C高壓滅菌20分鐘后加入以下成分，反式玉米素核苷 1. 5mg/L特美汀200mg/L卡那霉素50mg/LIZ 培養(yǎng)基MS 0. 44%蔗糖3%瓊脂0.8%pH5. 8120°C高壓滅菌20分鐘后加入以下成分，反式玉米素核苷 1. Omg/L
特美汀200mg/L卡那霉素50mg/LMMSV 培養(yǎng)基MS0. 44%蔗糖3%瓊脂0.8%pH6.0120°C高壓滅菌20分鐘后加入以下成分，特美汀200mg/L卡那霉素50mg/L葉酸0. 5mg/L實施例5番茄SLMBP21基因?qū)﹄x區(qū)發(fā)育的影響將實施例4獲得的共22株番茄轉(zhuǎn)化植株與其野生型對照as4)植株在培養(yǎng)間中同時一起培育(16小時光照、22°C /8小時黑暗、20°C的光周期)，直至完成整個生命周期。 22株番茄轉(zhuǎn)化植株共表現(xiàn)出如圖4 6所示的3種表型，其中7株如圖4所示，即在番茄中抑制SLMBP21基因的表達，導(dǎo)致離區(qū)消失，花器官和果實不能正常脫落(左側(cè)兩圖為野生型對照(ZS4)，右側(cè)兩圖為實施例4獲得的轉(zhuǎn)基因植株)；9株如圖5所示，即在番茄中抑制SLMBP21基因的表達，導(dǎo)致離區(qū)部分消失，果實不能正常脫落(左側(cè)兩圖為野生型對照 (ZS4)，右側(cè)兩圖為實施例4獲得的轉(zhuǎn)基因植株)；6株如圖6所示，即在番茄中抑制SLMBP21 基因的表達，導(dǎo)致離區(qū)沿花柄方向向近軸方向轉(zhuǎn)移(左圖為野生型對照，右圖為轉(zhuǎn)基因植株)。上述結(jié)果說明番茄SLMBP21參與離區(qū)發(fā)育，控制離區(qū)的形成。由于不同轉(zhuǎn)基因植株中SLMBP21被抑制的程度不同，所以轉(zhuǎn)基因植株的表型會有程度上的差異，這可能與外源基因在番茄基因組上的插入位點有關(guān)系，運用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法來轉(zhuǎn)化植物，外源基因的插入位點是隨機的。同時這種轉(zhuǎn)基因植株的表型方式是應(yīng)用 RNA干擾的方法來沉默基因的一種普遍的表型表現(xiàn)方式，更說明了 SLMBP21參與離區(qū)的發(fā)育。實施例6通過實時定量熒光PCR(quantitative real time RT-PCR)測定番茄 SLMBP21 基因在各器官中的表達譜。結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明番茄SLMBP21基因主要在花器官中表達，在花柄離區(qū)高水平表達。實施例7將J0INTLESS基因同YFP的融合基因及SLMBP21基因同CFP的融合基因，通過原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化法共轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體。轉(zhuǎn)化細胞中GFP熒光信號表示J0INTLESS基因和SLMBP21基因能在植物細胞的細胞核中互作。結(jié)果如圖8所示。實施例8利用RT-PCR測定SLMBP21反義轉(zhuǎn)基因株系中SLMBP21和LeMADSl的表達量，結(jié)果如圖9所示。番茄中LeMADSl基因與SLMBP21基因的序列相似性最高，但在SLMBP21反義轉(zhuǎn)基因植株中SLMBP21表達量下降，但LeMADSl表達量基本不受影響，說明基因表達抑制作用的特異性。
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雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方式
，對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.番茄SLMBP21蛋白，其為1)由SEQID No. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白；或2)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的番茄SLMBP21基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因或其片段的載體。
5.如權(quán)利要求4所述的載體，其特征在于，所述片段為番茄SLMBP21基因cDNA的一段 3’端序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示。
6.含有權(quán)利要求4或5所述載體的宿主細胞。
7.權(quán)利要求2所述基因或其片段在調(diào)節(jié)番茄離區(qū)的發(fā)育中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是通過抑制番茄SLMBP21基因的表達，產(chǎn)生沒有離區(qū)或離區(qū)發(fā)育不完全的轉(zhuǎn)基因植株。
全文摘要
本發(fā)明提供一種番茄SLMBP21蛋白，以及編碼該蛋白的番茄SLMBP21基因，該基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明的優(yōu)點在于，本發(fā)明的番茄SLMBP21基因，其屬于MADS-box基因家族的番茄離區(qū)發(fā)育基因，在番茄中抑制SLMBP21基因的表達能夠明顯影響到番茄離區(qū)的發(fā)育，產(chǎn)生沒有離區(qū)或離區(qū)發(fā)育不完全的轉(zhuǎn)基因植株；可用于解決各種作物、蔬菜、水果、花卉的落花落果問題以及番茄的工業(yè)化采摘問題；而且，同JOINTLESS無節(jié)突變體中花序發(fā)育受到影響的情況不同，在SLMBP21轉(zhuǎn)基因植株中，花序發(fā)育不受影響，說明SLMBP21具有更好的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N1/19GK102399272SQ201010287618
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月19日
發(fā)明者劉旦梅, 李愛麗, 毛龍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所