專利名稱：一種非洲豬瘟病毒核酸擴(kuò)增引物、檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種非洲豬瘟病毒核酸擴(kuò)增引物、檢測(cè) 方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種急性、熱性傳染病，其特征是發(fā)病過程短， 死亡率高達(dá)100%，該病國(guó)際獸疫局(OIE)將其歸入A類疾病，我國(guó)將其劃入1類疾病，由于 我國(guó)目前無非洲豬瘟病發(fā)生，因此無法在發(fā)病豬體內(nèi)進(jìn)行直接檢測(cè)。1.國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的非洲豬瘟(ASF)檢測(cè)技術(shù)
①血吸附(HAD)試驗(yàn)是ASF最經(jīng)典的檢疫方法之一，該方法敏感性較高，缺點(diǎn)是費(fèi) 時(shí)、操作繁瑣且技術(shù)要求高，需制備、培養(yǎng)骨髓細(xì)胞，且不能用于非血吸附毒株的診斷。②血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)由于感染康復(fù)豬血清中的非洲豬瘟病毒(ASFV)特異抗體能 維持很長(zhǎng)時(shí)間甚至終生，可用ELISA等常規(guī)免疫學(xué)方法檢測(cè)。Wardley等(1979)建立的 ELISA方法能檢測(cè)到50-500HAD5(1/ml的ASFV ；Vidal等(1997)用p72特異單抗建立了檢測(cè) ASFV的夾心ELISA ；蔣正軍等(2000)用桿狀病毒表達(dá)的重組p72抗原建立了檢測(cè)ASFV特 異抗體的間接ELISA。盡管ELISA具有一定的特異性和敏感性，但主要用于感染康復(fù)和慢性 感染豬血清中ASFV抗體的檢測(cè)，不適合急性感染和臨床前檢測(cè)，而且操作較復(fù)雜，反應(yīng)時(shí) 間較長(zhǎng)，有時(shí)出現(xiàn)假陰性，目前已不是ASF診斷的首選。③PCR檢測(cè)技術(shù)根據(jù)ASFV高度保守基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，理論上可以擴(kuò)增 出包括非血吸附和低毒力分離株在內(nèi)的所有ASFV病毒核酸。Steiger等(1992)首先根 據(jù)ASFV DNA保守區(qū)序列設(shè)計(jì)2對(duì)PCR引物，用建立的PCR檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)和感染組織中的 ASFV，具有靈敏、快速優(yōu)點(diǎn)，但檢測(cè)血液樣品時(shí)易出現(xiàn)非特異條帶；孫書華等(1995)在國(guó)內(nèi) 率先建立了 ASFV p72基因的PCR擴(kuò)增方法，但未進(jìn)行病毒感染細(xì)胞和臨床樣品的檢測(cè)；蔣 正軍等(2000)根據(jù)ASFV p72基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，用建立的PCR對(duì)4個(gè)毒株感染細(xì)胞 培養(yǎng)、感染豬組織和200份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示與HAD試驗(yàn)的陽性符合率為100% ； Gonzague等(2002)和Aguero等(2003)建立了可用于臨床樣本中ASFV快速診斷的PCR方 法；King等(2003)建立了檢測(cè)ASFV的TaqManPCR技術(shù)；Zsak等(2005)建立了用于接觸 ASFV豬臨床前診斷的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)。PCR檢測(cè)技術(shù)的特出優(yōu)點(diǎn)是快速和敏感性高，還 適合因腐敗等原因不能進(jìn)行病毒分離或抗原檢測(cè)樣品的檢測(cè)，適合動(dòng)物及其產(chǎn)品的進(jìn)出口 檢疫，已成為ASF檢疫技術(shù)的主要發(fā)展方向之一，但有時(shí)存在假陽(陰)性問題，需用其它檢 測(cè)方法予以證實(shí)。然而，上述ASFV檢測(cè)方法通常僅限于在ASF疫區(qū)國(guó)家和少數(shù)非疫區(qū)國(guó)家的專門實(shí) 驗(yàn)室使用，而國(guó)內(nèi)建立的ASFV診斷方法的敏感性、特異性和實(shí)用性尚需臨床實(shí)踐驗(yàn)證，目 前我國(guó)動(dòng)物檢疫部門還缺少敏感、特異、使用方便、價(jià)格經(jīng)濟(jì)的ASFV檢測(cè)方法。隨著我國(guó)周 邊地區(qū)ASF的發(fā)生(如格魯吉亞)，以及各種國(guó)際交往，特別是與非洲、拉美國(guó)家交往的增多， ASF對(duì)我國(guó)的潛在威脅越來越大，因此研制快速、特異、敏感、廉價(jià)的ASFV檢疫技術(shù)已迫在眉睫。2.核酸擴(kuò)增納米金檢測(cè)技術(shù)
核酸擴(kuò)增納米金檢測(cè)技術(shù)是在DNA芯片基礎(chǔ)上發(fā)展起來的檢測(cè)特定核苷酸序列新技 術(shù)，納米金是直徑為I-IOOnm的金顆粒，分散在水中的水溶膠又稱納米金，具有巨大的比表 面、尺寸量子效應(yīng)和化學(xué)反應(yīng)活性，作為免疫學(xué)試驗(yàn)標(biāo)記物使用已又很長(zhǎng)的歷史。納米金核 酸擴(kuò)增技術(shù)的基本原理是以烷巰基寡核苷酸修飾的納米金顆粒為報(bào)告基團(tuán)，將探針與靶序 列雜交，通過捕捉探針也可與同一條靶序列雜交，將形成的復(fù)合物捕捉、固定于酶標(biāo)板中， 通過銀染色可將敏感性提高IO5倍，能檢測(cè)濃度為IOfM的靶片段，直接用肉眼觀察酶標(biāo)板 孔中顏色變化即可作出判斷，為非洲豬瘟病毒提供了一種簡(jiǎn)便、快速、廉價(jià)的檢測(cè)方法。目 前國(guó)內(nèi)外尚無核酸擴(kuò)增納米金檢測(cè)非洲豬瘟病毒感染方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要克服非洲豬瘟病毒現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的不足之處，提供一種非洲豬 瘟病毒核酸擴(kuò)增的引物、檢測(cè)用的探針，以及應(yīng)用上述引物和探針檢測(cè)非洲豬瘟病毒的方法。本發(fā)明所說的用于非洲豬瘟病毒核酸擴(kuò)增和檢測(cè)的PCR引物對(duì)和特異性核酸探 針，選自下列各組
(a)正向引物5，-CGTATCTGGACATAAGACGT-3，，(SEQID NO 1) 反向引物5，-ATGCGTCTGGAAGAGCTGT-3，； (SEQ ID NO 2)
生物素標(biāo)記的捕捉探針5，-生物素-TTTTTTTTTTGCGCAAGAGGGGGCTGATAG-，3 ； (SEQ ID NO :3的5，端經(jīng)生物素修飾)
巰烷基標(biāo)記的檢測(cè)探針5，-ATTGCGTCTACTGGGGCGTCTTTTTTTTTT-0- (CH2)「SH-3，； (SEQ ID NO :4的3，端經(jīng)巰烷基修飾)
(b)正向引物5，-ATAAGCTTTCAGGATAGAG-3，，(SEQ ID NO 5) 反向引物:5，-CATAATCCGTGTCCCAACT -3，，(SEQ ID NO 6)
生物素標(biāo)記的捕捉探針5，-生物素-TTTTTTTTTTAGGGTATGTAAGAGCTGCAG-3，； (SEQ ID NO :7的5，端經(jīng)生物素修飾)
巰烷基標(biāo)記的檢測(cè)探針5，- ATACCATGAGCAGTTACGGTTTTTTTTTT-O-(CH2)3-SH-3，； (SEQ ID NO :8的3，端經(jīng)巰烷基修飾)
(c)正向引物5，-CACGCAGAAATAAGCTTTC-3，，(SEQ ID NO 9) 反向引物:5，-CGTGTCCCAACTAATATAA- 3，，(SEQ ID NO 10)
生物素標(biāo)記的捕捉探針5’ _ 生物素 _ TTTTTTTTTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTC-3’ ； (SEQ ID NO 11的5’端經(jīng)生物素修飾)
巰烷基標(biāo)記的檢測(cè)探針5，-GCGTCTGGAAGAGCTGTATCTTTTTTTTTT-0- (CH2)「SH-3，(SEQ ID NO 12的3，端經(jīng)巰烷基修飾)。本發(fā)明還公開了上述PCR引物對(duì)和特異性核酸探針在檢測(cè)非洲豬瘟病毒中的應(yīng)用。所述的應(yīng)用是在金標(biāo)銀染法中的應(yīng)用，包括以下步驟 (a)利用PCR引物擴(kuò)增待測(cè)樣本中核酸；(b)將烷巰基標(biāo)記的檢測(cè)探針標(biāo)記至納米金顆粒上；
(c)將生物素標(biāo)記的捕捉探針和步驟(b)納米金標(biāo)記的檢測(cè)探針與變性的PCR產(chǎn)物雜
、-
父；
(d)將步驟(c)的雜交體系加入包被鏈親素的酶標(biāo)板，捕捉雜交復(fù)合物；
(e)棄去未能吸附的反應(yīng)液，加入銀染增強(qiáng)液，放大酶標(biāo)板上間接吸附的納米金顆粒信
號(hào)；
(f)終止銀染增強(qiáng)反應(yīng)，肉眼觀察灰度判定結(jié)果。所述的(b)步驟中對(duì)烷巰基修飾的核酸探針進(jìn)行納米金標(biāo)記，標(biāo)記的納米金顆粒 大小30-80nm。進(jìn)一步地，標(biāo)記時(shí)為了使結(jié)合到納米金顆粒上的核酸數(shù)量少，以便(c)步驟 中雜交形成的復(fù)合物上有更多的金顆粒，提高反應(yīng)靈敏度，建議使用低鹽、高緩沖能力的緩 沖體系(如0. 01mol/L PB, ρΗ7· 0)，要求緩沖體系的ρΗ值為7. 0-7. 8。所述(c)步驟中，將步驟(a)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物94°C變性5min后快速冷卻，加入生 物素修飾探針和納米金標(biāo)記的探針，混勻。所述(d)步驟中的鏈親素吸附的酶標(biāo)板在制備時(shí)，將鏈親素用pH 7.4、0.01mol/L PBS稀釋成20ug/mL，4°C過夜包被高吸附性酶標(biāo)板，再將(c)步驟中的雜交反應(yīng)體系加入其 中，42°C繼續(xù)雜交并使雜交復(fù)合物吸附至酶標(biāo)板上，反應(yīng)時(shí)間30min。本發(fā)明還公開了包含上述PCR引物對(duì)和特異性核酸探針的非洲豬瘟病毒檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的原理是
1.設(shè)計(jì)一對(duì)引物，要求該引物具有特異性，只針對(duì)非洲豬瘟病毒核酸，并以此為模板， PCR方法可進(jìn)行相應(yīng)核酸片段的擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增非洲豬瘟病毒核酸片段時(shí)，PCR循環(huán)次數(shù) 25-30 次。2.根據(jù)PCR擴(kuò)增出的非洲豬瘟核酸序列，設(shè)計(jì)兩條修飾了核酸探針，要求其中一 條進(jìn)行生物素修飾(捕捉探針)，另一條進(jìn)行烷巰基修飾(檢測(cè)探針)，且該兩條探針必須與 PCR產(chǎn)物中的同一條單鏈能夠雜交(嚴(yán)格互補(bǔ)配對(duì))，而不與其他能感染豬的病毒核酸及豬 基因組核酸雜交。根據(jù)設(shè)計(jì)的特異性引物和探針采用金標(biāo)銀染法檢測(cè)待測(cè)樣本。根據(jù)樣品檢測(cè)孔與 實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照孔灰度的不同，判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有非洲豬瘟病毒的檢測(cè)樣品最終反應(yīng)結(jié)果呈 現(xiàn)黑色，而無非洲豬瘟病毒的陰性孔反應(yīng)結(jié)果呈無色，或淡灰色。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是核酸擴(kuò)增納米金技術(shù)(金標(biāo)銀染法)檢測(cè)非洲豬瘟病毒具有檢測(cè) 快速、檢測(cè)方便、靈敏度高、價(jià)格低廉、結(jié)果易判定等特點(diǎn)，減少出入境隔離飼養(yǎng)成本；操作 過程不需要特殊的儀器設(shè)備，節(jié)省檢測(cè)儀器設(shè)備的投入、維持費(fèi)用；在核酸擴(kuò)增基礎(chǔ)上的納 米金進(jìn)一步的檢測(cè)，有效避免PCR檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)假陽(陰)性現(xiàn)象，可檢測(cè)IOfmol甚至更少量 的非洲豬瘟病毒核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)靈敏度可與熒光定量PCR相媲美；低廉的制作成本，不 但可為國(guó)家節(jié)省購買進(jìn)口檢測(cè)試劑盒費(fèi)用，還適用于大量樣本的成批檢測(cè)。


圖1是酶標(biāo)板孔內(nèi)反應(yīng)示意圖。
圖2是檢測(cè)靶核酸PCR擴(kuò)增結(jié)果1.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；
2-4. PCR擴(kuò)增出的檢測(cè)靶核酸。圖3是核酸探針檢測(cè)ASFV p72基因結(jié)果
1.檢測(cè)靶核酸濃度為InM；
2.檢測(cè)靶核酸濃度為IOOpM；
3.檢測(cè)靶核酸濃度為IOpM；
4.檢測(cè)靶核酸濃度為IpM；
5.檢測(cè)靶核酸濃度為IOOfM；
6.檢測(cè)靶核酸濃度為IOfM；
7.檢測(cè)靶核酸濃度為IfM；
8.陰性對(duì)照；
9.空白對(duì)照。圖4是不同基因型ASFV PCR結(jié)果
1.λ DNAEco 1310分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2.ASFVBenin97/1 Genotype I ；3.ASFV0URT88/3 Genotype I ；4.ASFV0URT88/1 Genotype I ；5.ASFVUganda 95/3 Genotype X ；6.ASFVUganda95/1 Genotype IX ；7.ASFVVir Uganda ；8.ASFVMalawi LIL20/1 Genotype VDI9.ASFVTengani 60 Genotype V ；10..ASFV RSA 99/1 Genotype IV11,.ASFV Malta 78 Genotype I ；12,.空白對(duì)照。圖5是10株ASFV核酸擴(kuò)增納米金檢測(cè)結(jié)果
1.Benin97/1 ；2. 0URT88/3 ； 3. 0URT88/1 ；4. Uganda95/3 ；5.Uganda95/1 ；6.Vir Uganda ；7. Malawi LIL20/1 ；8. Tengani60 ；9. RSA99/1 ；10 Malta78 ；11.質(zhì)粒 pcDNA_vp72 ； 12.陰性對(duì)照。圖6是ASFV Benin97/1核酸擴(kuò)增納米金檢測(cè)敏感性結(jié)果。圖7是其他病毒核酸及正常豬DNA為模板PCR擴(kuò)增結(jié)果。1. XDNA/Ecol310 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；
2.PRV ；
3.PPV ；
4.PCV-2 ；
5.CSFV ；
6.PRRSV；
7.健康豬組織DNA。圖8是納米金核酸擴(kuò)增檢測(cè)其他DNA結(jié)果
1.陽性對(duì)照；2. PRV ；3. PPV ；4. PCV-2 ；5. CSFV ；6. PRRSV ；7.健康豬組織 DNA ；8.空白對(duì)照。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人利用本科研小組構(gòu)建的攜帶非洲豬瘟p72基因的重組質(zhì)粒以及從國(guó)外 引進(jìn)的非洲豬瘟病毒基因組分別作為檢測(cè)目標(biāo)，以核酸擴(kuò)增納米金檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行檢 測(cè)。本發(fā)明的具體實(shí)施方式
結(jié)合下面兩實(shí)施例來闡述。實(shí)施例1 以攜帶非洲豬瘟病毒p72基因的重組質(zhì)粒pcDNA-p72作為檢測(cè)目標(biāo)進(jìn) 行檢測(cè)
1.引物及探針的設(shè)計(jì)對(duì)來自不同國(guó)家、地區(qū)的22株ASFV(ol、BA71、BEN、cam、crol. 2、 cro3. 5、DR2、E70> E75> F6> ht、KU ker、Ml、Malawi> mk、Pr4> Pr5> ten、vie、wb、Za) p72 基因(Accession NO. AY578701. 1、FJ174348. 1、EF121428. 1、AF511452. 1、AY578690. 1、 AY578691. 1、L76727. 1、AY578692. 1、AY578693. 1、AY578694. 1、AY578695. 1、AY578696. 1、 AY578697. UAY578699. UAY261361. UAY578700. UAY578702. UAY578703. UAY578704. 1、 AY578705. UAY578707. UAY578708. 1)進(jìn)行了比對(duì)分析，找出一高度保守、長(zhǎng)度為651bp區(qū) 域(905-1555bp)作為被檢序列，設(shè)計(jì)、合成PCR引物及標(biāo)記探針 正向引物 5，-CGTATCTGGACATAAGACGT-3，(SEQ ID NO 1)； 反向引物 5，-ATGCGTCTGGAAGAGCTGT-3’ (SEQ ID NO 2)；
生物素捕捉探針 5’ -生物素-TTTTTTTTTTGCGCAAGAGGGGGCTGATAG-’ 3(SEQ ID NO 3 的 5’端經(jīng)生物素修飾)；
巰烷基標(biāo)記檢測(cè)探針 5，-ATTGCGTCTACTGGGGCGTCTTTTTTTTTT-0-(CH2)「SH-3，(SEQ ID NO :4的3，端經(jīng)巰烷基修飾)。2.納米金檢測(cè)探針的標(biāo)記①納米金溶液500uL，常溫下13000rpm離心15min， 棄上清，保留膠油狀納米金顆粒；②在其中加入巰烷基標(biāo)記的檢測(cè)探針(100Umol/L)3UL 和 47uL TE 緩沖液(10mmol/L Tris · Cl，lmmol/L EDTA, ρΗ7. 4)，混勻，4°C靜置 12h 后，加 入50uL的20mmol/L pH7. 0 PB緩沖液，混勻后4°C繼續(xù)靜置24h ；③常溫下13000rpm離心 15min，棄上清，保留膠油狀納米金顆粒；④用IOOuL超純水重懸，13000rpm離心15min，棄上 清，并重復(fù)一次；⑤IOOuL 10mmol/L pH7. 0 PB緩沖液重懸納米金顆粒，4°C儲(chǔ)存。通過該標(biāo)記方法，單鏈核酸未發(fā)生降解，當(dāng)加入1. 2ug烷巰基檢測(cè)探針時(shí)，最終被 標(biāo)記到膠體金上的核酸可達(dá)1. 05ug。3.鏈親素包被酶標(biāo)板用0. 05M pH9. 6碳酸鹽緩沖液、0. 02M pH8. 0 Tris-Cl緩沖 液以及0. OlM pH7. 4 PBS分別稀釋10ug/ml鏈親素，4°C條件下分別包被國(guó)產(chǎn)酶標(biāo)條、國(guó)產(chǎn) 酶標(biāo)軟板以及Greiner Microlon高吸附能力酶標(biāo)板10小時(shí)，5%脫脂乳封閉后，加入辣根 過氧化物酶標(biāo)記的生物素，進(jìn)行直接ELISA試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，以0. OlM pH7.4 PBS作為 鏈親素稀釋液，包被Greiner Microlon高吸附能力酶標(biāo)板時(shí)效果最佳。將鏈親素用0. OlM PH7. 4 PBS做梯度稀釋，在Greiner Microlon高吸附能力酶標(biāo)板上進(jìn)行直接ELISA試驗(yàn)，確 定鏈親素最佳包被濃度為20ug/ml。4.目的核酸的擴(kuò)增及檢測(cè)用正反向引物擴(kuò)增出ASFV p72基因中大小為651bp的核酸片段(圖2)，回收該核酸，并進(jìn)行梯度稀釋，以此作為檢測(cè)靶核酸，94°C變性5min后快 速冷卻，加入IOuL捕捉探針(10nmol/L)、5UL上述納米金標(biāo)記的檢測(cè)探針以及IOuL的待檢 測(cè)核酸于20uL的雜交液(0. 01%SDS, 10mmol/L PB, pH7. 8)中，混勻后加入吸附有鏈親素的 酶標(biāo)板中42°C進(jìn)行雜交30min，雜交結(jié)束后0. 01mol/L PBS洗滌酶標(biāo)板中未能結(jié)合上的復(fù) 合物，每孔再加IOOuL銀染液(25% AgNO3溶液12uL ；5. 7%氫醌溶液300uL ；25. 5%檸檬酸、 23. 5%檸檬酸三鈉溶液IOOuL)避光放大納米金信號(hào)(示意圖1)，反應(yīng)3-5min即浸泡于蒸餾 水中，終止反應(yīng)，并拍干酶標(biāo)板，肉眼觀察并判定檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示，該方法可檢測(cè)到濃度 為IOfM的非洲豬瘟病毒核酸擴(kuò)增樣品，檢測(cè)孔呈現(xiàn)黑色，而無非洲豬瘟病毒核酸的陰性孔 呈無色，或淡灰色，如圖3。實(shí)施例2 10株非洲豬瘟病毒基因組作為檢測(cè)目標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)
1.引物及探針的設(shè)計(jì)DNAstar分析軟件對(duì)已發(fā)表的100株不同基因型的ASFV p72基 因進(jìn)行比較，確定其中1516-1836位核苷酸序列高度保守，設(shè)計(jì)、合成2對(duì)PCR引物、生物素 標(biāo)記的捕捉及烷巰基標(biāo)記的檢測(cè)探針各兩對(duì)
Fl :5’ -ATAAGCTTTCAGGATAGAG -3，(SEQ ID NO 5)； Rl :5’ -CATAATCCGTGTCCCAACT -3，(SEQ ID NO 6)； F2 :5，-CACGCAGAAATAAGCTTTC -3，(SEQ ID NO 9) R2 :5，-CGTGTCCCAACTAATATAA- 3，(SEQ ID NO 10)
捕捉探針 Cl :5，_ 生物素-TTTTTTTTTTAGGGTATGTAAGAGCTGCAG-3，(SEQ ID N0:7 的 5， 端經(jīng)生物素修飾)；
捕捉探針 C2 :5，_ 生物素 _ TTTTTTTTTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTC-3，(SEQ ID NO: 11 的 5’端經(jīng)生物素修飾)；
檢測(cè)探針 Dl :5，-GATACCATGAGCAGTTACGGTTTTTTTTTT-0-(CH2)3-SH-3，(SEQ ID NO 8 的3’端經(jīng)巰烷基修飾)；
檢測(cè)探針D2:5，_ GCGTCTGGAAGAGCTGTATCTTTTTTTTTT-O-(CH2)3-SH-3，(SEQ ID NO 12 的3’端經(jīng)巰烷基修飾)。2.納米金檢測(cè)探針的標(biāo)記方法與實(shí)施例1中標(biāo)記方法雷同。3.鏈親素包被酶標(biāo)板以實(shí)施例1中確定的最佳包被體系進(jìn)行包被。4.目的核酸的擴(kuò)增及檢測(cè)以10株非洲豬瘟病毒核酸為模板進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增， 模板量為 10ng，反應(yīng)條件-MV X5min-(94°C X30s_50°C X30s_72°C X 30s) X 20_72°C Xl 0min-16°C，取少量PCR產(chǎn)物，1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果均可擴(kuò)增出330bp大小的條帶(圖 4)。各取10 uL PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，按照實(shí)例1中的步驟用兩套捕捉探針和檢測(cè)探針混合進(jìn) 行靶核酸的檢測(cè)(雜交體系中，雜交緩沖液40 uLUOnmol/L捕捉探針各10 uL、檢測(cè)探針標(biāo) 記的納米金各5uL、10 uL PCR產(chǎn)物)，反應(yīng)條件同實(shí)施例1，結(jié)果顯示可檢測(cè)出10株ASFV 核酸(圖5)。將ASFV Benin97/1核酸為模板的PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋，納米金方法 對(duì)稀釋物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示可檢測(cè)出0. I-Ifmol擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物(圖6)。而以偽狂犬病 病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬2型圓環(huán)病毒(PCV-2)、豬瘟病毒(CSFV)、豬藍(lán)耳病病毒 (PRRSV)基因組以及健康豬組織DNA為模板，同樣PCR條件不能擴(kuò)增出330bp的DNA片段 (圖7)，納米金檢測(cè)PCR產(chǎn)物也均為陰性(圖8)，這表明該方法檢測(cè)ASFV核酸具有敏感性高、 特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。
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權(quán)利要求
一種用于非洲豬瘟病毒核酸擴(kuò)增和檢測(cè)的PCR引物對(duì)和特異性核酸探針，其特征在于，所述的PCR引物對(duì)和特異性核酸探針選自下列各組(a)正向引物5' CGTATCTGGACATAAGACGT 3'，反向引物5' ATGCGTCTGGAAGAGCTGT 3'；生物素標(biāo)記的捕捉探針5' 生物素 TTTTTTTTTTGCGCAAGAGGGGGCTGATAG 3'；巰烷基標(biāo)記的檢測(cè)探針5' ATTGCGTCTACTGGGGCGTCTTTTTTTTTT O (CH2)3 SH 3'；(b)正向引物5’ ATAAGCTTTCAGGATAGAG 3’，反向引物5’ CATAATCCGTGTCCCAACT 3’，生物素標(biāo)記的捕捉探針5’ 生物素 TTTTTTTTTTAGGGTATGTAAGAGCTGCAG 3’；巰烷基標(biāo)記的檢測(cè)探針5’ ATACCATGAGCAGTTACGGTTTTTTTTTT O (CH2)3 SH 3’；(c)正向引物5’ CACGCAGAAATAAGCTTTC 3’，反向引物5’ CGTGTCCCAACTAATATAA 3’，生物素標(biāo)記的捕捉探針5’ 生物素 TTTTTTTTTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTC 3’；巰烷基標(biāo)記的檢測(cè)探針5’ CGTCTGGAAGAGCTGTATCTTTTTTTTTT O (CH2)3 SH 3’。
2.權(quán)利要求1的PCR引物對(duì)和特異性核酸探針在檢測(cè)非洲豬瘟病毒中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟(a)利用PCR引物擴(kuò)增待測(cè)樣本中核酸；(b)將烷巰基標(biāo)記的檢測(cè)探針標(biāo)記至納米金顆粒上；(c)將生物素標(biāo)記的捕捉探針和步驟(b)納米金標(biāo)記的檢測(cè)探針與變性的PCR產(chǎn)物雜、-父；(d)將步驟(c)的雜交體系加入包被鏈親素的酶標(biāo)板，捕捉雜交復(fù)合物；(e)銀染增強(qiáng)捕捉的納米金；(f)終止銀染增強(qiáng)反應(yīng)，肉眼觀察灰度判定結(jié)果。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于(b)步驟中對(duì)烷巰基修飾的檢測(cè)探針進(jìn)行 納米金標(biāo)記，標(biāo)記的納米金顆粒大小30-80nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于(c)步驟中，將步驟(a)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物 94°C變性5min后快速冷卻，加入生物素標(biāo)記捕捉探針和納米金標(biāo)記的檢測(cè)探針，混勻。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于(d)步驟中的鏈親素吸附的酶標(biāo)板在制備 時(shí)，將鏈親素用PH 7. 4,0. 01mol/L PBS稀釋成20ug/mL，4°C過夜包被高吸附性酶標(biāo)板，再 將(c )步驟中的雜交反應(yīng)體系加入其中，42 °C進(jìn)行雜交30min。
7.包含權(quán)利要求1所述PCR引物對(duì)和特異性核酸探針的非洲豬瘟病毒檢測(cè)試劑盒。全文摘要
本發(fā)明涉及一種非洲豬瘟病毒核酸擴(kuò)增引物、檢測(cè)方法和試劑盒。所說的引物對(duì)和特異性核酸探針選自SEQIDNO1-12。其檢測(cè)方法包括步驟(a)利用PCR引物擴(kuò)增待測(cè)樣本中核酸；(b)將烷巰基標(biāo)記的檢測(cè)探針標(biāo)記至納米金顆粒上；(c)將生物素標(biāo)記的捕捉探針和步驟(b)納米金標(biāo)記的檢測(cè)探針與變性的PCR產(chǎn)物雜交；(d)將步驟(c)的雜交體系加入包被鏈親素的酶標(biāo)板，捕捉雜交復(fù)合物；(e)銀染增強(qiáng)捕捉的納米金；(f)終止銀染增強(qiáng)反應(yīng)，肉眼觀察灰度判定結(jié)果。本發(fā)明具有檢測(cè)敏感性高、檢測(cè)特異性強(qiáng)以及檢測(cè)成本低的特點(diǎn)，可有效排除PCR方法檢測(cè)非洲豬瘟病毒出現(xiàn)的假陽性或假陰性，快速檢測(cè)出非洲豬瘟病毒核酸。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101921878SQ20101028847
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月21日
發(fā)明者夏曉莉, 孫懷昌, 張?chǎng)斡? 田瑞鵬 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)