專利名稱：：胃癌靶向DEC1基因的siRNAs表達載體的構建、篩選及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及表達DECl(Differentiatedembryo-chondrocyteexpressedgene1)基因的胃癌的基因治療藥物，具體涉及靶向胃癌DECl基因的siRNAs表達載體的構建、篩選及其用途，屬于生物醫(yī)藥
技術領域：
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背景技術：
：分化型胚月臺軟骨發(fā)育基因1(Differentiatedembryo-chondrocyteexpressedgene1，通稱DEC1)是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)蛋白家族的一個新成員，含有bHLH結構域。近來發(fā)現它是一個與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關的轉錄因子，其功能涉及腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡及早老，是參與缺氧調節(jié)的基因，與腫瘤組織的低氧狀態(tài)密切相關，可作為一個對放療和化療后腫瘤反應的預測標志。研究發(fā)現在結腸癌細胞中DECl可對抗血清饑餓誘導的調亡，并選擇性抑制proCaspases3、7、9的活性，但對pr0CaSpaSe8不起作用。而突變體DECl轉染子(缺少DNA結合的結構域)則無對抗凋亡作用，說明轉錄因子DECl可通過線粒體途徑抑制凋亡。腫瘤細胞對低氧環(huán)境及血清饑餓的耐受，是其高度惡性的特質，DECl的這種對抗血清饑餓誘導凋亡的作用，也證實其可能作為一個癌基因參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有研究報道DECl在多種腫瘤細胞系，如白血病、結腸癌、肺腺癌、神經膠質瘤、腎癌中存在高表達，可調控腫瘤生長、凋亡相關因子的表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的聯(lián)系。我們的一項研究也發(fā)現在胃癌組織中DECl表達明顯高于癌旁組織，且與腫瘤的分化程度密切相關(ZhengY,JiaYF,WangYS,etal.Thehypoxia-regulatedtranscriptionfactorDECl(Stral3,SHARP-2)anditsexpressioningastriccancer.0MICS.2009，13(4)=301-306)。通過阻斷在胃癌細胞中DECl的表達，進而影響其生物活性，同時結合其它的治療手段可能是治療高表達DECl腫瘤的新策略。RNA干擾作用分子-小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)可與RNA誘導沉默復合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)結合，脫去一條鏈，然后和RISC—起與靶mRNA上的相應的堿基序列配對結合。在RISC作用下，靶mRNA在相被切斷，然后3’端序列在細胞質中被酶降解，siRNA與RISC的復合體脫離被破壞的靶mRNA，繼續(xù)切割其他的革巴mRNA。剩下的5，端在RNA依賴性RNA多聚酶(RNA-d印endentRNApolymerase,RdRP)作用下生成互補鏈，新生的dsRNA會在Dicer酶的作用下生成更多的siRNA，繼續(xù)誘導靶mRNA沉默。如此循環(huán)使得在一段時間內，目標mRNA的蛋白質表達受到抑制，一般可維持96-120小時或3-4個細胞周期。近來Brummelkamp等發(fā)現通過向細胞質導入可以表達siRNA的質粒，可以使RNA干擾穩(wěn)定地維持2個月(BrummelkampTR,BernardsR,AgamiR.AsystemforstableexpressionofshortinterferingRNAsinmammaliancelIs.Science,2002,296(5567)550-553)。腫瘤是多基因疾病，在基因治療領域RNA干擾特別適合用于某個基因過度表達或由于體內突變基因表達所致的疾病。利用RNA干擾相關技術可以針對在細胞癌變過程中發(fā)揮重要作用的原癌基因、抑癌基因、凋亡相關基因、生長因子及其受體以及部分關鍵酶等，在不影響正?；蚬δ艿那疤嵯乱种仆蛔兓虮磉_或基因的過量表達，從而達到治療腫瘤的目的。
發(fā)明內容本發(fā)明針對現有技術的不足，提供一種胃癌靶向DECl基因的siRNAs表達載體構建、篩選及其用途。本發(fā)明以利用RNA干涉技術為主，針對DECl基因的不同靶序列，構建了兩個能在哺乳動物細胞中表達siRNA的表達質粒pGreenPuroshRNACloningandExpressionvectorl/2,以下簡稱DECl_siRNAl/2。其示意圖譜見圖1，能高效的特異性的抑制DECl基因表達，可用于制備治療高表達DECl基因的胃癌的基因藥物。本發(fā)明的技術方案如下靶向DECl基因的siRNAs表達載體，其特征是，以pGreenPuroshRNACloningandExpressionvector為載體，針對人分化型胚胎軟骨發(fā)育基因I(DECl)編碼區(qū)上游、下游的兩段序列，在可較高表達DECl胃腺癌細胞系BGC823中發(fā)揮RNA干擾作用。這兩段DECl特異性RNA干涉靶序列分別為①5’-CATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAA-3’，起始于661位；②5‘-CCAAGCTTAGCTTCTCAAAGGCCTAA-3‘,起始于2476位，是用于由DECl基因相關性胃癌的治療性物質，由以下方法制得(I)RNA干涉靶序列的選擇及插入序列的設計與合成選擇DECl基因編碼區(qū)的兩段序列①5，-AACTGCAGCAGGAATCCAGGT-3，、②5’-AACCCATACAGTGAATCCATT-3’，設計并分別體外合成兩對互補的寡核苷酸序列，序列如下①DECl寡核苷酸序列1正義鏈5’-GATCCCATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAACTTCCTGTCAGATTGTAAACCACTCTGCAGGGCAATGTTTTTG-3，反義鏈5’-AATTCAAAAACATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAATCTGACAGGAAGTTGTAAACCACTCTGCAGGGCAATGG-3，②DECl寡核苷酸序列2正義鏈5’-GATCCCCAAGCTTAGCTTCTCAAAGGCCTAACTTCCTGTCAGATTAGGCCTTTGAGAAGCTAAGCTTGGTTTTTG-3，反義鏈5’-AATTCAAAAAAATCCGGAAACTCTTCGATTCGAACCTCTGACAGGAAGTTAGGCCTTTGAGAAGCTAAGCTTGGG-3’(2)合成的寡核苷酸分別與線性載體pGreenPuroshRNACloningandExpressionvector連接、轉化、擴增及質粒的提取。首先將步驟(1)合成的兩對寡核苷酸等量混勻，95°C作用4分鐘后緩慢冷卻至室溫，然后將結合的雙鏈寡核苷酸與線性化的PGreenPuroshRNACloningandExpressionvector質粒載體連接，最后轉化到JM109大腸桿菌，經氨芐青霉素篩選，挑選單個菌落大量培養(yǎng)。用質粒提取試劑盒提取純化質粒DNA；質粒的提取純化按照試劑盒說明書進行操作。(3)質粒的鑒定將步驟(2)提取的質粒DNA經瓊脂糖凝膠電泳，應用引物ForwardHPCRPrimer和ReverseHPCRPrimer進行PCR鑒定，紫外分光光度計分析測定質粒DNA的濃度和純度，送南京金斯瑞生物科技有限公司進行插入片斷測序。本發(fā)明的胃癌靶向DECl基因的siRNAs表達載體在制備治療表達DECl的胃癌的基因藥物中的應用。為了對DECl基因siRNAs表達質粒對DECl基因的抑制效果及對胃癌細胞的抑制作用進行鑒定，脂質體轉染細胞，提取總RNA，RT-PCR法測定對DEClmRNA表達水平的抑制作用，westernblotting測定抑制DECl后對DECl蛋白表達水平的影響。本發(fā)明的針對DECl基因構建的2種siRNAs表達質粒是可用于高表達DECl胃癌的治療物質，其中DECl-siRNAl抑制胃癌細胞DECl表達的效率較高，可用于進一步研究DECl基因的功能及在實驗動物體內進行基因治療研究。本發(fā)明的胃癌靶向DECl基因的siRNAs表達載體的制備方法和生物學活性的鑒定主要包括如下內容一、質粒的制備，包括RNA干涉靶序列的選擇及插入模板的設計與合成，將上述合成的寡核苷酸分別與線性載體PGreenPuroshRNACloningandExpressionvector連接、轉化、擴增及質粒DNA的提取，質粒的鑒定。二、質粒生物學活性的鑒定，包括質粒的轉染、脂質體轉染效率的計算、RT-PCR檢測DECl基因的表達、westernblotting測定抑制DECl后對DECl蛋白表達水平的影響。下面詳細說明本發(fā)明制備方法中各步驟的具體操作方法1.RNA干涉靶序列的選擇及插入模板的設計與合成沿mRNA序列尋找連續(xù)兩個AA及后面的25-27個核苷酸，通過同源性比較，選擇與其他任何基因無同源性的序列即作為潛在的siRNA靶位點(靶位點不含有3個以上的相同序列，GC含量在30%-50%左右)。按照載體試劑盒說明，針對DECl基因的編碼序列，為找到具有最佳沉默效果的靶位點，選取兩段靶序列，分別從中上游選擇2個符合條件的靶位點，分別為①DECl-I661CATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAA②DEC1-22476CCAAGCTTAGCTTCTCAAAGGCCTAA設計并合成兩對互補的寡核苷酸序列，每一正向單鏈寡核苷酸內，(25_27nt)的寡核苷酸以正反向組合，以TTCAAGAGA為發(fā)夾環(huán)序列間隔，使寡核苷酸形成發(fā)夾結構，每對寡核苷酸的核心序列反向互補；每對寡核苷酸兩端分別帶有與線性化載體(pGreenPuroshRNACloningandExpressionvector)上相互補BamHI和EcoRI限制性酶切位點，這是連接線性化載體所必需的。按以上所述，兩個靶序列設計后的寡核苷酸序列如前所述。2.合成的寡核苷酸分別與線性載體pGreenPuroshRNACloningandExpressionvector連接、轉化、擴增及質粒的提取。首先將合成的兩對寡核苷酸等量混勻，95°C作用4分鐘后慢慢冷卻至室溫，然后將結合的雙鏈寡核苷酸與線性化的PGreenPuroshRNACloningandExpressionvector質粒載體連接，最后轉化到JM109大腸桿菌，經氨芐青霉素篩選，挑選單個菌落大量培養(yǎng)。質粒的提取純化按照試劑盒說明書進行操作。連接反應體系LinearizedpGreenPuroVector(50ng/μ1)1.0μ1雙寡核苷酸(1μΜ)0.5μ110ΧT4DNALigaseBuffer1·0μ1去離子水6·5μ1T4DNAligase(40U/μ1)1·0μ1_總體積10·0μ13.質粒的鑒定質粒DNA經瓊脂糖凝膠電泳，應用引物ForwardHPCRPrimer和ReverseHPCRPrimer進行PCR鑒定，紫外分光光度計分析測定質粒DNA的濃度和純度，送南京金斯瑞生物科技有限公司進行插入片斷測序。上述方法所構建的質粒生物學活性鑒定方法如下1.胃癌細胞培養(yǎng)及質粒的轉染BGC823細胞培養(yǎng)在含10%新生牛血清的RPMI-1640中，置于37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中。轉染前24小時，將腫瘤細胞接種在6孔培養(yǎng)板上，每孔約5XIO5個細胞，使每孔細胞飽和度在轉染前達到90%以上，鋪板時不使用含抗生素的培養(yǎng)液。種板后24小時，取質粒5μg加入250μ1opti-MEM,輕輕混勻，按Lipofectamine2000轉染試劑(Invitrogen)說明書方法進行瞬時轉染。劑量配比在其建議范圍內選擇設計，按照脂質體與質粒配比分五組，分別為空白對照組，8μ14yg組，IOul4yg組，分別制備脂質體/質粒轉染復合物6孔板中加入500μ1轉染復合物，來回移動培養(yǎng)板，使轉染復合物與細胞充分接觸。于37°C培養(yǎng)6h后，補加新鮮的含10%新生牛血清的DMEM，繼續(xù)孵育。在轉染后48h于熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白的表達。2.總RNA的提取、cDNA的合成及RNA干涉效應的半定量RT-PCR檢測(1)提取總RNA取轉染后的胃癌細胞BGC823，用PBS漂洗2次，按IO6-IO7個細胞加ImlTrizol(Invitrogen)裂解細胞，裂解液轉至1.5ml大小RNase-free的Ep管，加入200μ1氯仿，劇烈振蕩30秒，12000轉/分4°C離心5分鐘，小心取上清移至1.5ml大小RNase-free的Ep管，加入與上清等體積的異丙醇，室溫放置5分鐘后12000轉/分4°C離心5分鐘，小心棄上清，70%乙醇(DEPC水配制)洗滌沉淀2次，室溫下自然晾干，用ddH20(含1%DEPC)溶解，下續(xù)反應。(2)cDNA的合成和PCR反應使用Takara公司的RT-PCR試劑盒，先按50°C30min,99"C5min,5°C5min的步驟分別合成cDNA，反應總體系為10μ1，包括MgCI22μ1，10ΧRTBufferlyl，dNTPs混合物1μ1，RNaseInhibitor0.25μ1,AMVReverseTranscriptaseO.5μ1,OligodT-AdaptorPrimer0.5μ1,RNA4·8μ1；然后取cDNA1μ1在PCR儀(ΡΕ5700)中進行擴增，反應條件為94°C2min—個循環(huán)，94°C30sec，56°C30sec,72°CImin共30個循環(huán)，反應總體系為20μ1，包括5XPCRbuffer5μ1，滅菌蒸餾水9.875μ1，TaKaRaExTaqHS酶0.125μ1,DECl上、下游引物各1μ1，內參β-actin上、下游引物各1μ1，cDNAlμ1。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR引物序列下表。目的基因PCR引物序列及擴增片段長度權利要求1.靶向DECl基因的siRNAs表達載體，其特征是，以pGreenPuroshRNACloningandExpressionvector為載體，針對人分化型胚胎軟骨發(fā)育基因I(DECl)編碼區(qū)上、下游的兩段序列，在較高表達DECl的胃癌細胞系BGC823中發(fā)揮RNA干擾作用；這兩段DECl特異性RNA干涉靴序列分別為①5，-CATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAA-3，，起始于661位；②5，-CCAAGCTTAGCTTCTCAAAGGCCTAA-3，，起始于2476位，由以下方法制得(1)RNA干涉靶序列的選擇及插入序列的設計與合成選擇DECl基因編碼區(qū)的兩段序列①5，-CATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAA-3，、②5，-CCAAGCTTAGCTTCTCAAAGGCCTAA-3’，設計并分別體外合成兩對互補的寡核苷酸序列，序列如下①DECl寡核苷酸序列1:正義鏈5'-GATCCCATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAACTTCCTGTCAGATTGTAAACCACTCTGCAGGGCAATGTTTTTG-3'反義鏈5'-AATTCAAAAACATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAATCTGACAGGAAGTTGTAAACCACTCTGCAGGGCAATGG-3'②DECl寡核苷酸序列2正義鏈5'-GATCCCCAAGCTTAGCTTCTCAAAGGCCTAACTTCCTGTCAGATTAGGCCTTTGAGAAGCTAAGCTTGGTTTTTG-3，反義鏈5’-AATTCAAAAAAATCCGGAAACTCTTCGATTCGAACCTCTGACAGGAAGTTAGGCCTTTGAGAAGCTAAGCTTGGG-3'(2)將步驟(1)合成的兩對寡核苷酸等量混勻，95°C作用4分鐘后慢慢冷卻至室溫，然后將結合的雙鏈寡核苷酸與線性化的pGreenPuroshRNACloningandExpressionvector質粒載體連接，最后轉化到JM109大腸桿菌，經氨芐青霉素篩選，挑選單個菌落大量培養(yǎng)，用質粒提取試劑盒提取純化質粒DNA；(3)質粒的鑒定將步驟(2)提取的質粒DNA瓊脂糖凝膠電泳，應用引物ForwardsequencingprimerH和ReversesequencingprimerH進行PCR鑒定，紫外分光光度計分析測定質粒DNA的濃度和純度，并進行插入片斷測序，以確定合成的寡核苷酸是否已正確轉入PGreenPuroshRNACloningandExpressionvector質粒中。2.權利要求1的靶向DECl基因的siRNAs表達載體在制備治療表達DECl的胃癌的基因藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及胃癌靶向DEC1基因的siRNAs表達載體的構建、篩選及其用途。本發(fā)明以利用RNA干涉技術為主，針對DEC1基因的不同靶序列，構建了兩個能在哺乳動物細胞中表達siRNA的表達質粒DEC1-siRNA1/2。本發(fā)明胃癌靶向DEC1基因的siRNAs表達載體能高效的特異性的抑制DEC1基因表達，用于制備治療高表達DEC1基因的胃癌的基因藥物。文檔編號C12N15/85GK102041270SQ20101028848公開日2011年5月4日申請日期2010年9月21日優(yōu)先權日2010年9月21日發(fā)明者孫善會,汪運山,肖東杰,郟雁飛,鄭燕,馬曉麗,魏炎申請人:汪運山