專利名稱：薺菜冷誘導(dǎo)COR15a基因及其在改良植物的抗寒性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種薺菜冷誘導(dǎo)基因 CORl^a{CbCOR15a)及其制備方法，還涉及該基因的重組質(zhì)粒，并將其應(yīng)用于植物逆境基因 特別是用于植物抗寒基因的遺傳轉(zhuǎn)化，達(dá)到提高植物抗寒性的目的。
背景技術(shù)：
植物對(duì)環(huán)境變遷及不良環(huán)境有足夠的適應(yīng)性和抵抗能力，這種抗逆性既受系統(tǒng)進(jìn) 化的遺傳基因型控制，又受個(gè)體發(fā)育中的生理生態(tài)因素制約。溫度作為重要的環(huán)境因子 之一，限制植物的分布及生長(zhǎng)和產(chǎn)量，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育起著決定性作用。低溫寒害不僅是 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種嚴(yán)重的自然災(zāi)害，亦是影響植物由南向北移動(dòng)的一個(gè)非常重要的限制因 素。冷馴化是通過(guò)低溫誘導(dǎo)植物形成抗冷力的過(guò)程。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)植物中的冷調(diào)節(jié) 蛋白(cold regulated proteins，CORPs)禾口冷馬川化蛋白(cold acclimation proteins, CAIPs)是植物在冷馴化下產(chǎn)生的特異性蛋白質(zhì)，他的最大特點(diǎn)在于其能夠保護(hù)植物在低 溫和干旱時(shí)避免受傷害，該蛋白可以避免細(xì)胞的過(guò)度失水對(duì)植物造成傷害(Mohapatra SS, ffolfraim L, Poole RJ, Dhindsa RS. Molecular cloning and relationship to freezing tolerance of cold-acclimation-specific genes of Alfalfa. Plant Physiol, 1988, 89:375-380; Gilmour SJ, Artus NN, Thomashow MF. cDNA sequence analysis and expression of two cold-regulated genes of Arabidopsis thaiiana. Plant Mol Biol 1992，18: 13-21)。由于冷調(diào)節(jié)蛋白的功能和特性的研究，使得人們通 過(guò)生物技術(shù)的手段培育抗寒植物成為可能。目前在植物中已發(fā)現(xiàn)了多種冷調(diào)節(jié)蛋白，但 不同植物之間及同一植物內(nèi)部，不同的冷調(diào)節(jié)蛋白的氨基酸組成、序列、重復(fù)單元、重復(fù)次 數(shù)、空間結(jié)構(gòu)、組織特異性分布等方面均表現(xiàn)出一定程度的差異性，它們的組成與結(jié)構(gòu)也呈 現(xiàn)出多樣性和復(fù)雜性。C0R15a基因是從擬南芥中分離出來(lái)的冷調(diào)節(jié)蛋白基因，是目前研 究最多的基因之一。C0R15a在低溫誘導(dǎo)下表達(dá)后，可增加質(zhì)膜的晶體穩(wěn)定性，增加其原生
(Anus NN, Uemura M, Steponkus PL, Gilmour SJ, Lin C, Thomashow MF. Constitutive expression of cold-regulated Arabidopsis thaliana C0R15a gene affects both c chloroplast and protoplast freezing tolerance. Proc Natl Acad Sci USA, 1996， 93:13404-13409)。薺菜、Capsella torsa-pastori s)是一種1或2年野生的草本植物，平鋪地 面，喜陰，在南方是處處可見(jiàn)的一種可食用蔬菜，屬于十字花科(Cruciferae)、薺菜屬 (Capsella)，在低溫條件下能夠正常生長(zhǎng)發(fā)育并結(jié)實(shí)。本發(fā)明所涉及的薺菜冷調(diào)節(jié)基因 {CbC0R15a)是從薺菜葉片的總RNA中克隆得到的。目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)薺菜冷調(diào)節(jié)基因 CbC0R15a的研究和利用該基因培育耐寒植物的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的就是提供一種新的冷誘導(dǎo)基因、CbCorl5a)，該基因是從薺菜 中克隆到的，是植物在冷馴化下產(chǎn)生的高表達(dá)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的第二目的是提供一種新的冷誘導(dǎo)蛋白ij0bCorl5a)。本發(fā)明的第三目的是提供這種薺菜冷誘導(dǎo)蛋白多肽和編碼序列在利用轉(zhuǎn)基因技 術(shù)改良植物抗逆(耐低溫)上的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有薺 菜冷誘導(dǎo)蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 1中從核苷酸 第1-674位DNA分子的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度 嚴(yán)緊條件下與SEQ ID No. 1中從核苷酸第1-674位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序 列編碼具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID No. 1中從核苷酸第1-674位的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離出的薺菜冷誘導(dǎo)蛋白質(zhì)多肽，它包括具有 SEQ ID No. 2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多膚、或其活性片段，或其活性衍生物。較 佳地，該多肽是具有SEQ ID No. 2序列的多肽。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在實(shí)例中該宿 主細(xì)胞是酵母細(xì)胞、擬南芥、煙草和其它植物細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種產(chǎn)生具有薺菜冷誘導(dǎo)蛋白質(zhì)活性的多肽的方 法，其步驟如下
(1)將編碼具有薺菜冷誘導(dǎo)蛋白活性多肽的純化的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào) 控序列，形成薺菜冷誘導(dǎo)蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 1中從核苷酸第 1-674位的核苷酸序列有至少70%的同源性；
(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入原核宿主細(xì)胞，形成薺菜冷誘導(dǎo)蛋白的重組細(xì)胞；
(3)在適合表達(dá)薺菜冷誘導(dǎo)蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；
(4)分離出具有薺菜冷誘導(dǎo)蛋白活性的基本純的多肽。較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID No. 1中第1_674位的序列。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將編碼具有薺菜冷誘導(dǎo)蛋白 活性多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化入植物以提高植物對(duì)干旱的耐受性的方法，其步驟如下
(1)將編碼具有薺菜冷誘導(dǎo)蛋白活性多肽的純化的核苷酸序列可操作地連于植物表 達(dá)調(diào)控序列后，形成含薺菜冷誘導(dǎo)蛋白基因的植物表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 1中從核苷酸第1-674位的核苷酸序列有至少70%的同源性；
(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，將含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌同真核宿主細(xì)胞共 培養(yǎng)，在22-28°C條件下，暗培養(yǎng)1-2天后，通過(guò)篩選如抗生素篩選，獲得含有薺菜冷誘導(dǎo) 蛋白基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞并最終再生轉(zhuǎn)基因植株及其后代，包括植物種子及植物組織。含有薺 菜冷誘導(dǎo)蛋白基因的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)植物干旱耐受特性具有增強(qiáng)的作用。較佳地，在該方法中使用的核苷酸序列具有SEQ ID No. 1中第1_674位的序列。 本發(fā)明還提供了與薺菜冷誘導(dǎo)蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體，它包括多克隆抗體和單克隆抗 體。在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段己從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA.或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核苷酸的組份 分開(kāi)，而且己經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“薺菜冷誘導(dǎo)蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有薺菜冷誘 導(dǎo)蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID No. 1中第1-674位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序 列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID No. 1序列的編碼框第1-674位核苷酸中，有一個(gè)或多 個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性， 所以與SEQ ID No. 1中第1-674位核苷酸序列同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出 SEQ ID No. 2所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下 與SEQ ID No. 1中從核苷酸第1-674位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括 與SEQ ID No. 1中從核苷酸第1-674位的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80%， 更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然的薺菜冷誘導(dǎo)蛋白相同功能的蛋白的SEQ ID No. 1中開(kāi)放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常 為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取 代，以及在5 ’和/或3 ’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10 個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20%，較佳 地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90% (按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的 方法進(jìn)行測(cè)量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測(cè)量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含 天然狀態(tài)下伴隨其的組分。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“薺菜冷誘導(dǎo)蛋白或多肽”指具有薺菜冷誘導(dǎo)蛋白活性的SEQ ID No. 1序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與天然薺菜冷誘導(dǎo)蛋白相同功能的SEQ ID No. 2序 列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30 個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或 N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基 酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功 能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。 該術(shù)語(yǔ)還包括薺菜冷誘導(dǎo)蛋白的活性片段和活性衍生物。本發(fā)明的薺菜冷誘導(dǎo)蛋白多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位 變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與薺菜冷誘導(dǎo)蛋白DNA雜交的 DNA所編碼的蛋白、以及利用薺菜冷誘導(dǎo)蛋白多肽的血清獲得的多肽或蛋白。在本發(fā)明中，“薺菜冷誘導(dǎo)蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID No. 1的氨基酸序列 相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替 換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。發(fā)明還包括薺菜冷誘導(dǎo)蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然冷誘導(dǎo)蛋白多肽 的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而 有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通 過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技 術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有
5非天然存在的或合成的氨基酸(如0、氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并 不限于上述列舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙 ?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn) 行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng) 物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸 酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優(yōu) 化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在 生產(chǎn)本發(fā)明的薺菜冷誘導(dǎo)蛋白多肽時(shí)，可以將薺菜冷誘導(dǎo)蛋白編碼序列可操作地連于表達(dá) 調(diào)控序列，從而形成薺菜冷誘導(dǎo)蛋白表達(dá)載體。表 權(quán)利要求
一種分離的具有低溫誘導(dǎo)表達(dá)特性的薺菜冷誘導(dǎo)基因CbCOR15a，其特征在于，該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中堿基第1 674位的序列所示。
2.一種包含薺菜冷誘導(dǎo)基因伐OMVfe的重組質(zhì)粒，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所 述的核苷酸序列。
3.一種薺菜冷誘導(dǎo)蛋白CbC0R15a，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
4.按照權(quán)利要求3所述的薺菜冷誘導(dǎo)蛋白CbCOR，其特征在于，所述的薺菜冷誘導(dǎo)蛋白 CbC0R15a由137個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)。
5.如權(quán)利要求1所述的薺菜冷誘導(dǎo)基因CbC0R15a的制備方法，其特征在于，包括以下 步驟(1)材料的培養(yǎng)，將薺菜種子經(jīng)過(guò)消毒后，播種于含培養(yǎng)基的培養(yǎng)罐內(nèi)；(2)提取冷馴化后的薺菜中RNA，經(jīng)1%非變性瓊脂糖凝膠電泳，用260-280nm波長(zhǎng)的紫 外掃描來(lái)分析其質(zhì)量；(3)采用RACE方法克隆得到薺菜冷誘導(dǎo)基因伐OMVfe的全長(zhǎng)序列，RACE采用的引 物為 5’ CbC0R15al 5'-CTCTCCTGCTTTACCCTCCGCGAA-3'，5’ CbC0R15a2 5' -TTCTTTTCCT TTCTCCTCCACATA-3'。
6.如權(quán)利要求2所述的包括薺菜冷誘導(dǎo)基因伐OMVfe的重組質(zhì)粒的制備方法，其特征 在于，包括以下步驟(1)根據(jù)如權(quán)利要求1所述的薺菜冷誘導(dǎo)基因CbC0R15a的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)能擴(kuò) 增出完整開(kāi)放閱讀框(0RF)的引物，在正向引物和反向引物上分別引入限制性酶切位點(diǎn)；(2)將上述擴(kuò)增得到的薺菜冷誘導(dǎo)基因CbC0R15a的0RF克隆到中間載體pMD18_T，進(jìn) 一步克隆到植物表達(dá)載體P1304上；(3)將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，用于轉(zhuǎn)化模式植物煙草。
7.如權(quán)利要求3所述的薺菜冷誘導(dǎo)蛋白CbC0R15a的制備方法，其特征在于，包括以下 步驟(1)構(gòu)建原核表達(dá)載體pQE30-CbC0R，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15；(2)薺菜冷誘導(dǎo)蛋白CbC0R15a的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測(cè)；(3)薺菜冷誘導(dǎo)蛋白CbC0R15a的純化先超聲破碎，再煮沸，然后通過(guò)M親和層析柱， 最后PEG濃縮。
8.如權(quán)利要求2所述的包含薺菜冷誘導(dǎo)基因伐OMVfe的重組質(zhì)粒在改良植物抗寒性 與耐寒性中應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的薺菜冷誘導(dǎo)基因伐OMVfe在植物抗寒性與耐寒性中應(yīng)用，其特 征在于，所述植物為水稻、小麥、玉米、棉花、油菜或番茄。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種薺菜冷誘導(dǎo)CbCOR15a基因及其在改良植物的抗寒性中的應(yīng)用。該基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，CbCOR15a基因是具有序列表SEQIDNO:1中堿基第1-674位堿基的核酸序列，該核酸序列編碼一個(gè)受零上低溫誘導(dǎo)表達(dá)，在正常溫度下停止表達(dá)或降低表達(dá)，表達(dá)后能促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生抗冷力的基因。利用該基因片段構(gòu)建的誘導(dǎo)性表達(dá)載體可以在植物受到低溫脅迫時(shí)表達(dá)。本發(fā)明還提供基于上述基因培育抗寒植物的應(yīng)用方法，用于農(nóng)作物品種的改良。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101979578SQ201010289038
公開(kāi)日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月21日
發(fā)明者吳麗華, 周明琦, 林娟, 沈忱 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)