專利名稱：一種gstm1、gstt1和gstp1基因突變檢測液相芯片的制作方法
一種GSTM1、GSTT1和GSTP1基因突變檢測液相芯片技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種 GSTMU GSTTl和GSTPl基因檢測液相芯片。
背景技術(shù)：
谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S transferases, GSTs)是一個多功能的二相代謝酶家族，主要催化GSH(還原型谷胱甘肽)與親電子化合物間的結(jié)合反應(yīng)，使后者失去結(jié)合 機體DNA的活性，它是細胞抗損傷，抗癌變的主要解毒系統(tǒng)。另外，GSTs還可以和一 些配體如膽紅素、留族化合物等結(jié)合，參與人體的生理反應(yīng)。腫瘤細胞通過表達GSTs來 保護自身不受化療藥物的傷害，而基因突變可改變GSTs的活性，從而改變藥物的藥動力 學(xué)特征。近年來，GSTs與腫瘤和化療、GSTs與其他嚴重疾病之間的關(guān)系已引起了研究 者的注意。
按照染色體定位和序列同源性，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)了 8種GSTs，研究較多的主 要有GSTM，GSTP, GSTT亞家族。其中，谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶Ml (GSTMl)定位于染 色體1P13.3，主要對多環(huán)芳烴類，乙烯環(huán)氧化物，苯乙烯等的中間產(chǎn)物進行代謝，存在 GSTMla、GSTMlb和null三個等位基因，null等位基因即整個基因的缺失，其個體在肝 臟中不能表達GSTM。GSTM的null基因型在不同種族人群中的頻率范圍變動很大，非 洲人為23% 48%，亞洲人為33% 63%，歐洲人為39% 62%，美國人群為23% 62%。此外，谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶Tl (GSTTl)基因缺失也是研究的熱點。人谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶Pl (GSTPl)是細胞內(nèi)降解生物異源物質(zhì)的一組超家族同工酶GSTs中的一個重 要的亞型，能催化谷胱甘肽與親電子物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，在肺臟中的含量尤其豐富，是肺臟 中重要的解毒酶，對芳香族化合物具有較高降解性，在預(yù)防腫瘤發(fā)生的過程中起重要作 用，但同時也是腫瘤細胞對化療藥物耐受的原因，研究表明，GSTPl基因的多態(tài)性位點 A313G和C341T與腫瘤的耐藥性相關(guān)。
目前對GSTM1、GSTTl和GSTPl多態(tài)性的檢測產(chǎn)品一般是基于PCR技術(shù)的多重PCR、PCR-RFLP,實時熒光定量PCR和DNA測序法等，存在靈敏度低，樣品易污 染、假陽性率高的缺點，同時由于檢測通量的局限性，不能滿足實際應(yīng)用的需要。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種GSTPl基因突變檢測液相芯片，該液相芯片可用于檢 測GSTPl基因兩種常見基因型A313G和C341T的野生型和突變型。
實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下
一種GSTPl突變檢測液相芯片，主要包括有
(A)針對GSTPl基因的突變位點，分別設(shè)計的野生型和突變型的ASPE引物對 每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對突變位點的特異性引物組成，所述特異性 引物是針對A313G突變位點的SEQIDN0.11和SEQ ID N0.12、和針對C341T突變位點的 SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID N0.14 ；所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.6 ；
(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag 序列選自SEQ ID N0.15 SEQ ID N0.20中的序列，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補配對，且所述anti-teg序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；
(C)用于擴增出具有A313G和/或C341T的突變位點的GSTPl基因目標(biāo)序列的 擴增引物。
優(yōu)選地，所述擴增引物為SEQIDN0.25及SEQIDN0J6、和SEQ ID N0.27及 SEQ ID N0.28o
進一步地，本發(fā)明還提供了一種除GSTPl基因外，還包括GSTMl和/或GSTTl基因突變檢測的液相芯片，其具體組成如下
(A)還包括有針對GSTMl和/或GSTTl基因的缺失區(qū)域，分別設(shè)計的野生型 和突變型的ASPE引物對每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對突變位點的 特異性引物組成，所述特異性引物是針對GSTMl基因缺失區(qū)域的SEQ ID N0.7或SEQ ID N0.8、禾Π /或針對GSTTl基因缺失區(qū)域的SEQ ID Ν0.9或SEQ ID Ν0.10 ；相應(yīng)的所 述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.6 ；
(B)還包括有分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所 述anti-tag序列選自SEQ ID NO.15 SEQ ID N0.20中的序列，所述anti-tag序列能相應(yīng) 地與(A)中所選的tag序列互補配對，且所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂 序列；
(C)還包括有用于擴增出具有GSTMl和/或GSTTl的突變區(qū)域的目標(biāo)序列的擴 增引物。
優(yōu)選地，所述擴增引物為針對GSTMl基因突變位點的SEQ ID N0.21和SEQ ID N0.22、禾Π /或針對GSTTl基因突變位點的SEQ ID Ν0.23和SEQ ID NOJ4。
優(yōu)選地，所述間隔臂序列為5-10個Τ。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于
1.本發(fā)明所提供的液相芯片，其與測序法得到的檢測結(jié)果吻合率高達100%。所 制備的GSTPl基因突變檢測液相芯片，以及GSTM1、GSTTl和GSTPl基因突變檢測液 相芯片都具有非常好的信號-噪聲比，并且所設(shè)計的探針以及anti-tag序列之間基本上不 存在交叉反應(yīng)，tag標(biāo)簽序列、anti-tag標(biāo)簽序列的選取以及tag標(biāo)簽序列與具體ASPE弓丨 物的結(jié)合，能夠避免交叉反應(yīng)，實現(xiàn)多個突變位點的并行檢測。
2.本發(fā)明設(shè)計的ASPE型特異性引物具有非常好的特異性，能準確區(qū)分各種型別 的基因型。
3.本發(fā)明的所述液相芯片的檢測方法步驟簡單，四種基因多態(tài)性(包括兩種缺 失型和兩種單核苷酸突變型)檢測可通過一步多重PCR即可完成的目標(biāo)序列的擴增(如 果GSTM1、GSTTl為基因缺失純合子，則沒有擴增條帶)，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜 操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準確率，體現(xiàn)了精確的同時定 性、定量分析特征。
4.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差的缺 陷，同時對現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進行改進，使得所制備微球能適用于不同的檢測項目，具有很強的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進一步得到提 高，信噪比增強，檢測結(jié)果更加準確可靠。
具體實施方式
實施例1
GSTMU GSTTl和GSTPl基因多態(tài)性檢測液相芯片，主要包括有
一、ASPE 引物
針對GSTMl和GSTTl基因缺失型、GSTPl基因的A313G突變(Ilel05Val， rsl695)和C341T突變(Alall4Val，rsll38272)，分別設(shè)計特異性引物序列。ASPE引物 由“Tiig序列+特異性引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示
表IASPE引物序列(Tag序列+特異性引物序列)
基因基因型類型ASPE引物Tag序列特異性引物序列GSTMl缺失型wl5’ AATCAATCTTCATTCAAATCATCA (SEQ ID NO. 1)GAAACAAGGTAAAGGAGGAG 3' (SEQIDNO.7)w2或 AATATGTGGGCTGGAACCTC 3' (SEQIDNO.8)GSTTl缺失型wl5' CTTTTCAATTACTTCAAATCTTCA (SEQIDNO.2)ACACGACTCTGCGGAGAAGC 3' (SEQIDNO.9)w2或 CCTTCCTTACTGGTCCTCAC ATCT 3' (SEQIDN0.10)GSTPlA313GA313G-W5，ATTATTCACTTC AAACTAATCTAC (SEQIDNO.3)GGACCTCCGCTGCAAATACA 3' (SEQIDNO.ll)A313G-m5，TC AATC ATTAC ACTTTTC AAC AAT (SEQIDNO.4)GGACCTCCGCTGCAAATACG 3' (SEQ ID NO. 12)C341TC341T-W5' CTACTAATTCATTAACATTACTAC (SEQIDNO.5)GTGGTGTCTGGCAGGAGGC 3' (SEQIDNO.13)C341T-m5，CTATAAACATATTACATTCACATC (SEQIDNO.6)GTGGTGTCTGGCAGGAGGT 3' (SEQIDNO.14)
每條ASPE引物包括兩個部分，5’端為針對相應(yīng)微球上anti-tag序列的特異性 tag序列，3’端為突變型或野生型特異的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引 物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。合成后的每條引物分別用lOmmol/LTris Buffer配制成100pmol/mL的貯存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根據(jù)所設(shè)計的ASPE特異性引物片段，選擇tag序列，最大限度地減少各微球的 anti-tag序列之間以及tag與ASPE特異性引物片段可能形成的二級結(jié)構(gòu)，選擇的6種微球 編號與微球上相應(yīng)的anti-tag序列如表2所示
表2微球編號與微球上相應(yīng)的anti-tag序列
權(quán)利要求
1.一種GSTPl基因突變檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(A)針對GSTPl基因的突變位點，分別設(shè)計的野生型和突變型的ASPE引物對每 種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對突變位點的特異性引物組成，所述特異性 引物是針對A313G突變位點的SEQIDNO.il和SEQ ID N0.12、和針對C341T突變位 點的 SEQ IDN0.13 和 SEQ ID N0.14 ；所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.6 ；(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序 列選自SEQID NO. 15 SEQ ID N0.20中的序列，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所 選的tag序列互補配對，且所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；(C)用于擴增具有A313G和C341T的突變位點的GSTPl基因目標(biāo)序列的擴增引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GSTPl基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引物 為 SEQ IDN0.25 及 SEQ ID N0.26、禾口 SEQ ID N0.27 及 SEQ ID N0.28。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GSTPl基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述ASPE引物 為針對GSTPl基因A313G突變位點的由SEQ ID N0.3和SEQ ID NO. 11組成的序列， 及由SEQ IDN0.4和SEQ ID NO. 12組成的序列；和針對GSTPl基因C341T突變位點的 由 SEQ ID N0.5 和 SEQ ID NO. 13 組成的序列，及由 SEQ ID N0.6 和 SEQ ID NO. 14 組成 的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GSTPl基因突變檢測液相芯片，其特征是，還包括有㈧ 針對GSTMl和/或GSTTl基因的缺失突變，分別設(shè)計的野生型和突變型的ASPE引物 對每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對缺失區(qū)域的特異性引物組成，所述 特異性引物是針對GSTMl基因缺失區(qū)域的SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8中的至少一 種、禾日/或針對GSTTl基因缺失區(qū)域的SEQ ID N0.9和SEQ ID NO. 10中的至少一種； 相應(yīng)的所述tag序列選自SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.6 ；(B)針對GSTMl和/或GSTTl基因的分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同 顏色編碼的微球，所述anti-tag序列選自SEQ ID NO. 15 SEQ ID N0.20中的序列，所述 anti-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補配對，且所述anti-tag序列與微球連接 中間還設(shè)有間隔臂序列；(C)用于擴增出具有GSTMl和/或GSTTl的突變區(qū)域的目標(biāo)序列的擴增引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的GSTPl基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引物 為針對GSTMl基因突變區(qū)域的SEQ ID N0.21和SEQ ID N0.22、禾Π /或針對GSTTl 基因突變區(qū)域的SEQ ID Ν0.23和SEQ ID Ν0.24。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的GSTPl基因突變檢測液相芯片，其特征是，其組成為A) ASPE引物針對GSTPl基因A313G突變位點的由SEQ ID Ν0.3和SEQIDNO.ll 組成的序列，及由SEQ ID Ν0.4和SEQ ID NO. 12組成的序列、和針對GSTPl基因C341T 突變位點的由SEQ ID N0.5和SEQ ID NO. 13組成的序列，及由SEQ ID N0.6和SEQ ID NO. 14組成的序列；針對GSTMl基因缺失突變的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7組成 的序列或由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.8組成的序列；和針對GSTTl基因缺失突變的 由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.9組成的序列或由SEQ ID N0.2和SEQ ID NO. 10組成的序 列；(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序列選自SEQID NO. 15 SEQ ID N0.20中的序列，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補配對，且所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；(C)分別用于擴增具有GSTPl基因突變位點、GSTMl和GSTTl突變區(qū)域的目標(biāo)序 列的擴增引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的GSTPl基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引 物為所述擴增引物為SEQ ID N0.21 及 SEQ ID N0.22、SEQ ID N0.23 及 SEQ ID N0.24、SEQIDN0.25 及 SEQIDN0.26、禾Π SEQ ID N0.27 及 SEQ ID N0.28。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的GSTPl基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述 間隔臂序列為5-10個Τ。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種GSTP1基因突變檢測液相芯片，主要包括有由5’端的tag序列和3’端針對突變位點的特異性引物組成的ASPE引物，所述特異性引物是針對A313G突變位點的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、和針對C341T突變位點的SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；所述tag序列選自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6；分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球；擴增引物。本發(fā)明所制備的GSTM1、GSTT1和GSTP1基因突變檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設(shè)計的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)，tag標(biāo)簽序列、anti-tag標(biāo)簽序列的選取以及tag標(biāo)簽序列與具體ASPE引物的結(jié)合，能夠避免交叉反應(yīng)，實現(xiàn)多個突變位點的并行檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102021240SQ20101029263
公開日2011年4月20日 申請日期2010年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月21日
發(fā)明者劉志明, 許嘉森 申請人:廣州益善生物技術(shù)有限公司