專利名稱：產(chǎn)喜樹堿的新菌種篩選及制備喜樹堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物內(nèi)生菌的分離、篩選及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別涉及從喜樹中分離、 純化內(nèi)生真菌，發(fā)酵篩選產(chǎn)喜樹堿的菌株以及利用篩選的菌株制備喜樹堿的方法。
背景技術(shù)：
喜樹堿是1966年Wall等從中國珙桐科植物喜樹(Camptotheca acuminate)中提取的一種具有抗腫瘤活性的吲哚類生物堿。目前，喜樹堿主要的生產(chǎn)方法是從喜樹中提取， 而喜樹中喜樹堿的含量很低，一般為0. 01 % 0. 1 %，導(dǎo)致提取得率低、成本高，而且喜樹是國家II級重點(diǎn)保護(hù)野生植物，大量砍伐喜樹容易導(dǎo)致植被破壞、生態(tài)失衡等問題?；瘜W(xué)全合成喜樹堿已經(jīng)取得成功，但由于合成路線長、產(chǎn)率低、成本高而無法投入工業(yè)化生產(chǎn)。 因此，開發(fā)喜樹堿的新藥源成為國內(nèi)外面臨的重大問題。植物內(nèi)生菌是指生活史中的某一階段或全部階段生活在健康植物組織或器官內(nèi)部，但對植物沒有引起明顯病害癥狀的微生物。內(nèi)生菌侵入宿主植物體內(nèi)，長期生活在植物細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙的特殊環(huán)境中，與宿主植物協(xié)同進(jìn)化，形成一種互利共生的穩(wěn)定的生態(tài)關(guān)系。1993年Mrobel小組首次從短葉紅豆杉(Taxus brevifolian Nutt.)中分離到一株合成紫杉醇的內(nèi)生真菌，證明內(nèi)生菌具有合成與宿主植物相同或相似活性成分的功能。這一發(fā)現(xiàn)掀起了從藥用植物中分離內(nèi)生菌的研究熱潮，之后研究者們先后從數(shù)十種藥用植物中分離了多種內(nèi)生菌，人工培養(yǎng)后培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)與宿主植物相同或相似的活性成分。產(chǎn)喜樹堿及其類似物的喜樹內(nèi)生菌2005年開始報(bào)道，詳見附表。利用內(nèi)生菌發(fā)酵生產(chǎn)喜樹堿，反應(yīng)條件溫和、無毒、無污染，操作簡單，成本低，具有廣泛的應(yīng)用前景。附表產(chǎn)喜樹堿及其類似物的喜樹內(nèi)生真菌
權(quán)利要求
1.產(chǎn)喜樹堿的新菌種，其特征是所述的新菌種Wiomopsis印』四是從喜樹 (Camptotheca acuminate)樹皮和果實(shí)中分離篩選的內(nèi)生菌，已于2010年7月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 3988。
2.權(quán)利要求1所述的產(chǎn)喜樹堿的新菌種Wiomopsissp. B29的篩選方法包括以下步驟 1)將喜樹樹皮和果實(shí)先用無菌水沖洗表面塵土，再用體積比為75%的乙醇浸泡30s，無菌水洗掉表面乙醇，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1 %的升汞浸泡30s，無菌水沖洗3 5次，然后用無菌刀將其剪成5mmX5mm的小塊；2)將上述材料接種到PDA培養(yǎng)基平板上，28 30°C恒溫培養(yǎng)；待樣品周圍明顯長出菌落，挑取不同形態(tài)的菌落，轉(zhuǎn)到PDA培養(yǎng)基斜面，觀 30°C純化培養(yǎng)，儲藏備用；3)菌種活化將分離的內(nèi)生真菌接種于活化培養(yǎng)基斜面，28 30°C活化48h；4)發(fā)酵培養(yǎng)將活化后的菌種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，觀 30°C，170r/min搖床培養(yǎng)4 6d ；5)喜樹堿的提取及檢測發(fā)酵結(jié)束后分離菌絲，烘干后粉碎，加入體積比為50% 80%的乙醇超聲提取20min 40min，離心收集上清液，高效液相色譜進(jìn)樣檢測，發(fā)酵后提取液液相檢測到喜樹堿的菌株即為本發(fā)明所述的產(chǎn)喜樹堿的新菌種。
3.利用權(quán)利要求1所述的產(chǎn)喜樹堿的新菌種Wiomopsissp. B^制備喜樹堿的方法， 其特征是包括以下步驟1)菌種活化將產(chǎn)喜樹堿的新菌株接種于活化培養(yǎng)基斜面二8 30°C活化 48h ；2)發(fā)酵培養(yǎng)將活化后的菌種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基J8 30°C，170r/min搖床培養(yǎng)，發(fā)酵 4 6d ；3)喜樹堿的提取及制備發(fā)酵結(jié)束后分離菌絲，烘干后粉碎，加入體積比為50% 80%的乙醇超聲提取20min 40min，離心收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，收集析出物，加入體積比為1 1 4 1的氯仿、甲醇混合液萃取劑靜置萃取1 池，收集下層溶液減壓濃縮、烘干，得到喜樹堿粗品。
全文摘要
本發(fā)明公開了產(chǎn)喜樹堿的新菌種及其制備喜樹堿的方法，產(chǎn)喜樹堿的新菌種Phomopsis sp.B29，已于2010年7月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No.3988。喜樹堿是從中國珙桐科植物喜樹(Camptotheca acuminate)中提取的一種具有抗腫瘤活性的吲哚類生物堿，對治療結(jié)腸癌、卵巢癌等惡性腫瘤有很好療效。直接從喜樹中提取喜樹堿導(dǎo)致植被破壞、生態(tài)失衡等問題，而化學(xué)合成法路線長、得率低、成本高。針對這些問題，本發(fā)明從喜樹(Camptotheca acuminate)樹皮和果實(shí)分離、純化內(nèi)生真菌，從中篩選到一株產(chǎn)喜樹堿的菌株，用于發(fā)酵后制備喜樹堿。本發(fā)明提供的新菌種可作為生產(chǎn)喜樹堿的新藥源，而且利用其發(fā)酵制備喜樹堿的方法操作簡單、成本低。
文檔編號C12R1/645GK102417883SQ20101029267
公開日2012年4月18日 申請日期2010年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月27日
發(fā)明者王玉美, 陳洪章 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所