專利名稱：真菌抗性植物和它們的用途的制作方法
真菌抗性植物和它們的用途本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2004年8月3日、發(fā)明名稱為“真菌抗性植物和它們的用途”的 中國(guó)專利申請(qǐng) 200480022723. 6 (PCT/EP2004/008683)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及增加植物，尤其茄科(Solanaceae)植物，優(yōu)選馬鈴薯和番茄對(duì)卵菌 (Oomycetes)門的植物病原體的抗性的新方法，所述方法包括增加本發(fā)明多肽的活性。本發(fā) 明還涉及多核苷酸和包含這些多核苷酸的載體。本發(fā)明還涉及相應(yīng)的載體、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植 物和來(lái)自它們的轉(zhuǎn)基因繁殖材料，涉及產(chǎn)生它們的方法，還涉及它們用于生產(chǎn)糧食、飼料、 種子、藥物或者精細(xì)化學(xué)品的用途。植物生物技術(shù)工作的目的是產(chǎn)生具有有益的新性質(zhì)的植物，例如，用于增加農(nóng) 業(yè)生產(chǎn)力，增加糧食質(zhì)量，或者產(chǎn)生特定化學(xué)品或者藥物(Dimwell JM(2000)J Exp Bot 51Spec No:487-96)。植物對(duì)于病原體的天然防御機(jī)制通常是不足的。僅真菌病就導(dǎo)致每 年幾億美元的產(chǎn)量損失。導(dǎo)入來(lái)自植物、動(dòng)物或者微生物來(lái)源的外來(lái)基因可以增加防御。實(shí) 例是通過(guò)表達(dá)處于35SCaMV啟動(dòng)子控制下的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis) 內(nèi)毒素保護(hù)煙草免于昆蟲的攝食損害(Vaeck等人(1987)NatUre 328 :33_37)或者通過(guò) 表達(dá)處于CaMV啟動(dòng)子控制下的豆幾丁質(zhì)酶保護(hù)煙草免于真菌感染(Broglie等人(1991) Science 254:1194-1197)。然而，所描述的多數(shù)方法僅僅提供了對(duì)一種病原體或者窄范圍 病原體的抗性。盡管19世紀(jì)中葉眾所周知的愛爾蘭馬鈴薯饑荒，晚疫仍然是農(nóng)作物植物中所有 疾病最具破壞性的疾病之一。晚疫由卵菌真菌致病疫霉(Phytophthora infestans)導(dǎo)致， 致病疫霉是一種特化病原體，其主要在許多茄科物種，尤其馬鈴薯和番茄的葉子和果實(shí)上 導(dǎo)致疾病。首次在墨西哥觀察到該真菌，由于幾種原因，認(rèn)為墨西哥是該真菌的起源中心。 在例如Toluca地區(qū)提取永久存在兩種交配型Al和A2。而且，有報(bào)導(dǎo)在墨西哥的偏遠(yuǎn)地區(qū) 的當(dāng)?shù)厍褜傥锓N上存在致病疫霉。此外，在墨西哥發(fā)現(xiàn)具有塊莖茄屬的許多種具有對(duì)晚疫 的高水平抗性。預(yù)防農(nóng)作物死亡或者產(chǎn)量減小的主流措施意味著應(yīng)用殺真菌劑防止或者治 療致病疫霉導(dǎo)致的感染。代替化學(xué)殺蟲劑的大量使用用于控制晚疫的備選方法是有益的 使用栽培種，其具有對(duì)晚疫的部分或者完全抗性。為了得到晚疫抗性，培育者在過(guò)去專注于 來(lái)自墨西哥本地一種野生馬鈴薯種Solanum demissum的顯性R基因的漸滲現(xiàn)象。已經(jīng)鑒 定了 11種此類基因，它們的一些已經(jīng)定位到馬鈴薯的遺傳學(xué)圖的特定基因座(Gebhardt和 Valkonen, 2001中綜述)并且最近已經(jīng)克隆了 Rl基因。Rl和R2分別位于5號(hào)和4號(hào)染色體。 R3、R6和R7位于11號(hào)染色體上。賦予對(duì)晚疫的品種特異抗性的未知R基因也已經(jīng)在馬鈴薯 andigena 亞禾中(S. tuberosum ssp. andigena)禾口 S. berthaultii 與 S. pinnatisectum 中描 述。在任何情況下，這些R基因誘導(dǎo)的抗性(幾乎)是完全的但是似乎不能持久。因?yàn)楦咚?平抗性和容易轉(zhuǎn)移，所以許多栽培種含有S. demissum衍生的抗性。不幸的是，S. demissum 衍生的品種特異抗性盡管幾乎是完全的，但是不是持久的。一旦在商業(yè)田間中以大規(guī)模生 長(zhǎng)新近培育的馬鈴薯栽培種，就出現(xiàn)致病疫霉的新毒性，其使得該病原體能夠克服漸滲的 抗性。在一些墨西哥和中南美洲茄屬種中可以發(fā)現(xiàn)對(duì)晚疫的更持久的田間抗性，其通?？?以在本質(zhì)上定量并且認(rèn)為是品種非特異的。然而，通過(guò)雜交和表型選擇通常難以將該類型的抗性轉(zhuǎn)移到馬鈴薯栽培種中。來(lái)自墨西哥和危地馬拉的二倍體S. bulbocastanum是一種具有塊莖的物種，很久 以來(lái)就知道它對(duì)晚疫具有高水平抗性。不幸的是，由于倍性和胚乳平衡數(shù)(EBN)中的困難， 通常不能實(shí)施將抗性從茄屬物種轉(zhuǎn)移到培育的馬鈴薯的經(jīng)典轉(zhuǎn)移。盡管有這些困難，但是 S. bulbocastanum抗性性狀的漸滲已經(jīng)取得了成功。最近，發(fā)現(xiàn)S. bulbocastanum和馬鈴 薯的體細(xì)胞雜種和回交的種質(zhì)即使在極大的疾病壓力下也對(duì)晚疫是高度抗性的(Helgeson 等人，1998)。盡管有重組抑制的報(bào)導(dǎo)，但是回交材料中的抗性似乎在8號(hào)染色體內(nèi)RFLP標(biāo) 記CP53和CT64之間的約6cM間隔上。來(lái)自番茄RFLP探針CT88的CAPS標(biāo)記與抗性共分 罔。因此，近年來(lái)，對(duì)卵菌門病原體抗性植物的開發(fā)穩(wěn)步前進(jìn)。然而，對(duì)可用的種質(zhì)的 40年的深入和持續(xù)的研究和育種工作仍然沒有導(dǎo)致在市場(chǎng)上引入抗性栽培種。近年來(lái)鑒定 的多數(shù)基因僅僅是品種特異抗性。此外，所實(shí)現(xiàn)的抗性不是持久的。此外，普遍認(rèn)為植物保 護(hù)劑的應(yīng)用造成環(huán)境負(fù)擔(dān)。從而，在一些西方國(guó)家，法律變得更嚴(yán)格并且部分禁止應(yīng)用特定 殺真菌劑，使得疾病的化學(xué)控制更加困難。此外，化學(xué)控制是昂貴的。最后，另一個(gè)限制是 世界上許多國(guó)家已經(jīng)報(bào)導(dǎo)真菌產(chǎn)生了對(duì)特定殺真菌劑如甲霜靈的抗性。因此，本發(fā)明的根 本問(wèn)題是提供有效保護(hù)植物免于晚疫和相關(guān)疾病的新手段和方法。通過(guò)提供權(quán)利要求中表征的實(shí)施方案解決了技術(shù)問(wèn)題。因此，本發(fā)明涉及產(chǎn)生或者增加植物對(duì)卵菌門植物病原體的抗性的方法，其包括 增加植物或植物或其部分中組織、器官或細(xì)胞中Rpi_blb2蛋白質(zhì)的活性。Rpi-blb2是LZ-NBS-LRR型R基因并且顯示出與賦予對(duì)三種根結(jié)線蟲 (Meloidogyne spp.)的抗性的番茄基因Mi-I以及與馬鈴薯蚜蟲馬鈴薯長(zhǎng)管蚜 (Macrosiphum euphorbiae) (Vos 等人，1998 ；Rossi 等人，1998 ；MiIligan 等人，1998)和與 粉虱(煙粉虱(Bemisia tabaci)) (Nombela等人，2003)的B-和Q-生物型的序列同源性。 如對(duì)于Rpi-blb所發(fā)現(xiàn)的，Rpi_blb2也賦予對(duì)攜帶多種毒性因子的一系列致病疫霉分離物 的完全抗性，并且還沒有表現(xiàn)出品種特異性。術(shù)語(yǔ)“Rpi_blb2”指編碼具有本文提到的Rpi_blb2蛋白質(zhì)活性的多肽的多核苷酸 或者具有所述Rpi_blb2蛋白質(zhì)活性的多肽。下文中術(shù)語(yǔ)“Rpi_blb2”涉及多肽還是多核苷 酸可以從其使用的上下文中明確。術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)生”或“增加”或“刺激” “植物的抗性”指與參照相比，增加或產(chǎn)生或刺激 了植物或其部分的抗性?！百x予”、“現(xiàn)有”、“產(chǎn)生”、“刺激”或“增加”病原體抗性指在相同條件(例如，氣候 條件、生長(zhǎng)條件、病原體種類等等)下，與沒有應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明方法的野生型植物相比，由 于應(yīng)用了根據(jù)本發(fā)明的方法，特定植物種或者變種的防御機(jī)制對(duì)一種或多種病原體的抗性 增加。增加的抗性優(yōu)選表現(xiàn)在疾病癥狀表現(xiàn)的減小，疾病癥狀除了包括上面提到的不利效 果外還包括例如病原體進(jìn)入植物或者植物細(xì)胞的穿透效率或者病原體在植物或植物細(xì)胞 內(nèi)部或者上面的繁殖效率。在該上下文中，疾病癥狀優(yōu)選減小至少10%或至少20%，尤其 優(yōu)選至少40 %或60 %，非常特別優(yōu)選至少70 %或80 %，最優(yōu)選至少90 %或95 %。術(shù)語(yǔ)“增加的”在此指基因產(chǎn)物活性比參照中的活性高。從而，術(shù)語(yǔ)“增加的”包 括如果在參照中沒有發(fā)現(xiàn)活性(例如，本文描述的Rpi_blb2活性)，那么從頭產(chǎn)生的該活性(例如，Rpi_blb2基因產(chǎn)物或者另一種基因產(chǎn)物的活性)。術(shù)語(yǔ)“增加的”還涉及基因產(chǎn)物 活性的刺激?？梢砸远喾N方法刺激基因的增加的表達(dá)，即它的活性，所述方法為例如對(duì)生物 應(yīng)用化學(xué)品或者通過(guò)生物應(yīng)激。例如，通過(guò)用寄生蟲，例如，用致病疫霉感染可以激活針對(duì) 感染性寄生蟲介導(dǎo)基因的抗性并且該抗性賦予對(duì)相同和/或其他病原體的增加的抗性。從而，在下文中，術(shù)語(yǔ)“增加”還包括術(shù)語(yǔ)“刺激”和“產(chǎn)生”。“病原體抗性”表示病原體感染后植物的疾病癥狀的減輕或者減弱。癥狀可以是多 樣的，但是優(yōu)選包括對(duì)植物的質(zhì)量、產(chǎn)量、用作飼料或糧食的適宜性直接或間接具有不利影 響，或者使得播種、種植、收獲或加工農(nóng)作物困難的那些癥狀。在本發(fā)明范圍內(nèi)“病原體”作為實(shí)例但不作為限制指病毒或者類病毒、細(xì)菌、真菌、 動(dòng)物害蟲，如昆蟲或者線蟲。術(shù)語(yǔ)“Rpi_blb2”蛋白質(zhì)涉及蛋白質(zhì)或多肽，其在植物或植物部分中的表達(dá)與非抗 性株系相比賦予該植物或植物部分對(duì)本文描述的病原體的抗性。與具有相同遺傳背景但是沒有允許Rpi_blb2的表達(dá)必需的遺傳元件的植物或者 其部分(本文稱作“野生型”或者“參照”)相比，包含Rpi_blb2蛋白質(zhì)的增加的活性的植 物或植物組織、或者細(xì)胞或者植物部分對(duì)于病原體，尤其卵菌門病原體，優(yōu)選對(duì)于致病疫霉 的敏感性較低。測(cè)試植物或者其部分的抗性的測(cè)定法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。對(duì)致病疫 霉的抗性可以定義為根據(jù)Flier，2001的孢子形成指數(shù)。Flier將孢子形成指數(shù)描述為每 Icm2孢子形成水平。從而，與野生型相比每Icm2孢子形成的20%減少在本文定義為抗性。 在闡明本發(fā)明的實(shí)施例中，孢子形成指數(shù)定義為每個(gè)病灶孢子形成的水平。從而，術(shù)語(yǔ)“抗 性”可以備選地指與野生型相比每個(gè)病灶孢子形成減少20%。優(yōu)選后一定義。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在測(cè)定中孢子形成減少30 %，更優(yōu)選減少50 %，甚至更優(yōu)選 減少70%，更優(yōu)選減少80%以上，更優(yōu)選減少85%和90%。最優(yōu)選減少95%或以上。因此，在本發(fā)明中，Rpi_blb2蛋白質(zhì)的“活性”指蛋白質(zhì)表達(dá)賦予孢子形成指數(shù)的 所述減少。此外，觀察到含有Rpi_blb2的植物對(duì)致病疫霉感染的典型應(yīng)答是在生長(zhǎng)期結(jié)束 時(shí)存在小病灶，沒有明顯的孢子形成。從而，在一個(gè)實(shí)施方案中，Rpi_blb2的活性定義為在 所描述的實(shí)驗(yàn)中存在沒有任何明顯孢子形成的小病灶。Rpi_blb2抗性表現(xiàn)出壞死區(qū)域，其 含有低水平孢子形成。用離脫葉進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)例證了 Rpi_blb2的活性。該實(shí)驗(yàn)在實(shí)施例17 和

圖18中描述。Rpi_blb2和其他致病疫霉抗性基因之間的差異是Rpi-blb2允許低水平孢 子形成(圖18)。在其中Rpi-blb2基因型(ARD92-1197-16)上存在病灶的離脫葉測(cè)定顯示 了低水平孢子囊，而含有S. demissum基因R2的基因型上完全沒有孢子囊。孢子形成指數(shù) 為敏感表型(cv. Bintje)的僅1. 1%。田間實(shí)驗(yàn)也表明Rpi_blb2允許低水平感染。在生長(zhǎng)期期間(圖3，ARF87_801)或 者生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)(圖2，ARF87-601 ；圖3，ARF87-507和ARF87-601)產(chǎn)生晚疫癥狀。從而，在一個(gè)實(shí)施方案中，Rpi_blb2的活性還定義為在植物中表達(dá)后導(dǎo)致壞死區(qū) 中含有如所述實(shí)驗(yàn)中描述的低水平孢子形成。從而，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法產(chǎn)生顯示出含有低水平孢子形成或更低 水平孢子形成的壞死區(qū)的植物。術(shù)語(yǔ)“參照”涉及生物或者其部分，例如，細(xì)胞，所述生物或者其部分在基因組、蛋 白質(zhì)組和/或代謝組與相關(guān)生物或者其部分，例如細(xì)胞，例如，與本發(fā)明的植物基本相同。
從而，術(shù)語(yǔ)“參照”涉及例如生物或者其部分，例如，細(xì)胞，所述生物或者其部 分在遺傳、蛋白質(zhì)組和/或代謝上與本發(fā)明的生物或者其部分基本相同，但是由于在參 照的基因組、蛋白質(zhì)組或者代謝組中存在相關(guān)差異，不能觀察到它的特定基因產(chǎn)物(例 如，Rpi-blb2)的活性。從而，參照可以是不表達(dá)或者表達(dá)很少相關(guān)活性基因產(chǎn)物的植 物或者其部分，例如，它不編碼Rpi_blb2或者不轉(zhuǎn)錄Rpi-blb2編碼基因或者不翻譯活 性Rpi-blb2mRNA。從而，參照不提供產(chǎn)生足量活性基因產(chǎn)物而導(dǎo)致所述表型的修飾。兩 種植物是否基本上在遺傳上相同可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的測(cè)定法測(cè)試，例如，如用 Roldan-Ruiz, Theor. Appl. Genet.，2001，1138-1150 描述的指紋分析測(cè)試?？梢匀绫绢I(lǐng) 域描述的測(cè)試蛋白質(zhì)的表達(dá)模式，例如，用通過(guò)凝膠電泳(一維、二維、三維)、質(zhì)譜分析 禾口例如，在 www. waters, com，www. proteine. org. au，www. proteomesci. com，www. sdu. dk/ Nat/CPA中描述的其他方法進(jìn)行。技術(shù)人員按照本領(lǐng)域描述的可以分析代謝組，例如，通過(guò) HPLC, GC、OPLC, LC-MS, GC-MS, LC-MS-MS 和例如，在 www. metabolic-explorer, com, www. ki. se/icsb2002/pdf/ICSB_209. pdf, www. genomics, rug. nl/technologies, htm, Fiehn 等 人，Nature Biotech, 18(2000)，1157，Raamsdonk 等人，Nature Biotech, 19 (2991)，45-50， Buchholz，Anal. Biochem，295 (2001) 129-137，Soga等人，Anal Chem. 74 (2002) 2233-2239 中 描述的其他方法實(shí)施所述分析。為了增加對(duì)病原體的抗性，參照生物或者其部分對(duì)于病原體，例如植物病原體，例 如，致病疫霉的感染是敏感的。優(yōu)選地，參照是生物的克隆，該克隆中例如，已經(jīng)導(dǎo)入相關(guān)多核苷酸，例如，本發(fā)明 的多核苷酸，或者激活劑，例如，介導(dǎo)活性的相關(guān)基因產(chǎn)物的激活劑，例如，增加相關(guān)多核苷 酸或者所述多核苷酸衍生物的表達(dá)的激活劑，或者相關(guān)多肽，例如本發(fā)明多肽的激活劑，和 /或相應(yīng)的相關(guān)基因產(chǎn)物編碼載體。例如，本發(fā)明方法中的優(yōu)選參照是生物或者其部分，其 是生物的克隆或者其部分，例如，細(xì)胞，所述克隆或者其部分已經(jīng)用本發(fā)明的多核苷酸或者 載體轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)化。如果不能鑒定所述克隆，本領(lǐng)域技術(shù)水平是切除或者敲除或者關(guān)閉基本上介導(dǎo)相 關(guān)活性的那些元件，所述相關(guān)活性為例如介導(dǎo)增加的Rpi_blb2活性，例如，介導(dǎo)生物，例如 植物中增加的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知怎樣減小或者抑制相關(guān)基因產(chǎn)物的活性，例如通 過(guò)減小或者抑制例如Rpi_blb2的表達(dá)。然后此類克隆可以與根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的生 物，例如，與致病疫霉抗性、表達(dá)Rpi-blb2的基因型生物比較。本文所用的術(shù)語(yǔ)“植物”指植物界的高等和低等植物的所有屬和種。該術(shù)語(yǔ)包括 成熟植物、種子、芽和幼苗和它們的衍生部分、繁殖材料、植物器官、組織、原生質(zhì)體、愈傷組 織和其他培養(yǎng)物，例如，細(xì)胞培養(yǎng)物，和給予功能或結(jié)構(gòu)單位的任意其他類型的植物細(xì)胞分 組?！俺墒熘参铩敝赣酌缰獾娜我庀Ｍ陌l(fā)育階段的植物。幼苗指在早期發(fā)育階段的幼小 的不成熟植物?！爸参铩卑ㄋ幸荒晟投嗄晟鷨巫尤~植物和雙子葉植物。本發(fā)明范圍 內(nèi)優(yōu)選為用作糧食或者飼料的那些植物，例如，單子葉或者雙子葉屬，尤其種，像上述種，例 如，分別谷類種或者茄科的成員，最優(yōu)選馬鈴薯和番茄。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，本發(fā)明的方法還包括選擇那些植物，在所述植物中與 參照植物相反或相比，對(duì)至少一種所述病原體的抗性已經(jīng)存在或者增加。關(guān)于其中與參照植物相反或相比，對(duì)至少一種所述病原體的抗性已經(jīng)存在或者增加的植物的“選擇”指適于識(shí)別針對(duì)病原體的現(xiàn)有或者增加的抗性的所有那些方法。這些 可以是病原體感染的癥狀，但是也可以包括本文描述的癥狀，其涉及植物的質(zhì)量、產(chǎn)量、用 作飼料或者糧食的適宜性等等。因此，在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，Rpi_blb2蛋白質(zhì)由包含核酸分子的多核 苷酸編碼，所述核酸分子選自a)編碼SEQ ID NO 2或者4中描述的多肽的至少成熟形式的核酸分子；b)核酸分子，其包含編碼所述多肽的至少成熟形式的如SEQ IDNO :1或3，或5或 6中描繪的編碼序列；c)核酸分子，其核苷酸序列由(a)或者(b)的核苷酸序列的遺傳密碼簡(jiǎn)并產(chǎn)生；d)核酸分子，其編碼的多肽通過(guò)從(a)到(C)的多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序 列的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的替代、缺失和/或加入從(a)到(c)的多核苷酸編碼的多肽衍生；e)核酸分子，其編碼的多肽的序列與(a)或(b)的核酸分子編碼的多肽的氨基酸 序列具有70%或以上的同一性；f)核酸分子，其包含(a)到(e)任一項(xiàng)的核酸分子編碼的多肽的片段或者具有表 位的部分；g)核酸分子，其包含的多核苷酸具有用表3b中所列引物，尤其ARFlF和ARFlR從 核酸文庫(kù)擴(kuò)增的核酸分子的序列；h)核酸分子，其編碼(a)到(g)任一項(xiàng)編碼的多肽的以氨基酸1、30、50、100、 200、300、500 或 1000 開始并以氨基酸 1276、1000、500、300、200、50、30、或 1 結(jié)束的片段；i)包含(a)或(d)任一項(xiàng)的多核苷酸的至少20個(gè)核苷酸的核酸分子；j)核酸分子，其編碼的多肽被針對(duì)(a)到(h)任一項(xiàng)的核酸分子編碼的多肽產(chǎn)生 的單克隆抗體識(shí)別；k)核酸分子，其可以通過(guò)用具有(a)到(j)任一項(xiàng)的核酸分子或者其至少15個(gè)， 優(yōu)選30、60、100或更多核苷酸的片段的序列的探針在嚴(yán)格條件下篩選適宜文庫(kù)得到；和1)核酸分子，其互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下與(a)或(k)任一項(xiàng)的核酸分子雜交；或者(a)到(1)任一項(xiàng)的互補(bǔ)鏈；或者表達(dá)Solanum bulbocastanum的連鎖群6的區(qū)段編碼的多肽，所述區(qū)段與選 自表3A的標(biāo)記共分離，并且所述多肽介導(dǎo)對(duì)病原體，尤其選自卵菌門病原體的抗性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法的多核苷酸不由Seq. ID NO. :7和/或9中描述的 序列組成和/或不由編碼Seq. ID NO. :8和/或10中描述的蛋白質(zhì)的核酸分子的序列組 成。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法的多核苷酸不由Mil. 1或者M(jìn)il. 2的核酸分子的 序列組成和/或不由編碼Mil. 1或者M(jìn)il. 2蛋白質(zhì)的核酸分子的序列組成。從而，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法的多核苷酸不由Rossi等人1998，PNAS USA 95 :9750-9754，Milligan 等人，1998. Plant Cell 10 1307-1319 ；和 / 或 WO 9806750 中所 示的序列組成。在圖15和17中顯示了 Rpi-blb2,Mil. 1和Mil. 2的序列比較。本文所用術(shù)語(yǔ)“連鎖群”涉及兩種或多種性狀和/或基因座和/或基因和/或標(biāo) 記，它們由于所述性狀和/或基因座和/或基因和/或標(biāo)記之間的關(guān)聯(lián)而傾向于一起遺傳。 性狀和/或基因座和/或基因和/或標(biāo)記越密切，在DNA修復(fù)或者復(fù)制過(guò)程，如真核生物中有絲分裂或減數(shù)分裂期間它們分離的概率越低，從而它們將一起遺傳的概率越大。連鎖群 與染色體的同源對(duì)一樣多。術(shù)語(yǔ)“連鎖群6”涉及與6號(hào)染色體關(guān)聯(lián)的馬鈴薯或番茄的連鎖群，通過(guò)基于 Bernatzky和Tanksley (1986)和Tanksley等人(1992)發(fā)表的工作鑒定已知染色體位置的 標(biāo)記建立此類關(guān)聯(lián)。連鎖群具有與它們的各自染色體相同的編號(hào)。在番茄中，根據(jù)粗線期 測(cè)量的染色體的長(zhǎng)度對(duì)染色體編號(hào)。此類編號(hào)已經(jīng)由BartOn(1950)采用；1號(hào)染色體是最 長(zhǎng)的，12號(hào)染色體是最短的。除了長(zhǎng)度，諸如著絲粒的位置和異染色質(zhì)的量和分布的特征 用于鑒定每個(gè)染色體。短臂通過(guò)“S”表示，長(zhǎng)臂用“L”表示；從而如在Barton，D.W. (1950) American Journal of Botany. 37,639-643, Bernatzky, R.禾口 Tanksley, S. D. (1986) Genetics 112，887-898，Tanksley，S.D.，等人，(1992) Genetics 132，1141-1160 中，“IS” 表示1號(hào)染色體的短臂。本文所用術(shù)語(yǔ)“共分離”涉及兩種或多種緊密連鎖的性狀和/或基因座和/或基 因和/或標(biāo)記傾向于一起遺傳。例如，6號(hào)染色體的與Rpi_blb2共分離的更具體的區(qū)域是短臂，其在番茄中具有 形態(tài)學(xué)標(biāo)記Mi。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的方法，其中Rpi_blb2蛋白質(zhì)由本 發(fā)明的多核苷酸編碼，例如，由Seq. ID. 1或3或5或6中所示的多核苷酸或者其片段編碼?；贐LASTX檢索，與所鑒定的Rpi_blb2序列具有最高同源性的所鑒定基因是 Mil. 1和Mil. 2基因和蛋白質(zhì)；見圖15和17。兩種基因都與Seq. ID. 1或3或5或6中描述 的序列具有高同一性但是不賦予對(duì)卵菌門植物病原體的抗性。因此，Mil. 1和Mil. 2的活性 不同于本發(fā)明多肽活性。Mil. 1和Mil. 20RF的序列和編碼蛋白質(zhì)在本文中以Seq. ID NO. 7到10顯示。此外，申請(qǐng)EP 401764. 4涉及Mi-基因?，F(xiàn)有技術(shù)Mil. 1-和Mil. 2-基因的 序列排除在本發(fā)明多核苷酸之外，具體排除Seq. ID NO. :7和9。還包括編碼Seq. ID N0. 8或10的多肽的多核苷酸序列。從而，在一個(gè)實(shí)施方案中，還排除編碼Mil. 1和Mil. 2蛋白 質(zhì)的序列。與本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽具有較低同源性的蛋白質(zhì)是Hero抗性蛋白質(zhì) 1 和 2(Genbank 檢索號(hào)gi26190252 和 gi26190254)、番茄斑萎病毒(Tospovirus)抗性蛋 白質(zhì) A、B、C、D 禾口 E[Genbank 檢索號(hào)gil5418709、gil5418710、gil5418712、gil5418713、 gi 15418714] ；Rl [Genbank 檢索號(hào)gi 17432423]和 Prf [Genbank 檢索號(hào)gi8547237]，它們 的序列或者編碼的序列也排除在本發(fā)明的序列之外。本文中所用術(shù)語(yǔ)“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、或者“核酸分 子”指任意長(zhǎng)度的核苷酸的聚合形式，可以為核糖核苷酸或者脫氧核糖核苷酸。該術(shù)語(yǔ)僅指 分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。從而，該術(shù)語(yǔ)包括雙鏈和單鏈DNA和RNA。它還包括已知類型的修飾，例如，甲基 化、一個(gè)或多個(gè)天然發(fā)生的核苷酸用類似物的“帽”替代。優(yōu)選地，本發(fā)明的DNA序列包含 編碼本文定義的多肽的編碼序列?！熬幋a序列”是核苷酸序列，當(dāng)置于適宜的調(diào)節(jié)序列的控制下時(shí)，所述核苷酸序列 轉(zhuǎn)錄成mRNA和/或翻譯成多肽。由5’末端的翻譯起始密碼子和3’-末端的翻譯終止密碼 子決定編碼序列的界限。編碼序列可以包括，但不限于mRNA、cDNA、重組核苷酸序列或者基 因組DNA，而在某些條件下也可以存在內(nèi)含子。
“雜交”指此類核酸分子在常規(guī)雜交條件下，優(yōu)選在如Sambrook(Molecular Cloning ；A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor，NY(1989))描述的嚴(yán)格條件下雜交。此類嚴(yán)格雜交條件的一個(gè)實(shí)例是在 4XSSC 65°C下雜交，然后在0. IXSSC 65°C下洗滌1小時(shí)。備選地，代表性嚴(yán)格雜交條 件是在50%甲酰胺，4XSSC中，42°C下。此外，洗滌步驟期間的條件可以選自低嚴(yán)格條件 (約2XSSC 50°C下)和高嚴(yán)格條件(約0.2XSSC 50°C，優(yōu)選65°C下)界定的條件范圍 (20XSSC:0. 3M檸檬酸鈉，3M NaCl，pH 7.0)。此外，洗滌步驟期間的溫度可以從室溫，約 22°C的低嚴(yán)格條件升高到約65°C的高嚴(yán)格條件。兩種參數(shù)鹽濃度和溫度可以同時(shí)改變或 者兩個(gè)參數(shù)之一可以保持恒定而僅另一個(gè)改變。在雜交期間可以使用變性劑，如甲酰胺或 者SDS。在50%甲酰胺存在下，優(yōu)選在42°C實(shí)現(xiàn)雜交。下面顯示了雜交和洗滌步驟條件的 一些其他實(shí)例(1)例如，可以從下面的條件選擇雜交條件a) 4 X SSC 65 °C,b) 6 X SSC 45 °C,c) 6 X SSC, 100mg/ml 變性片段化魚精 DNA，68°Cd)6XSSC,0. 5% SDS, 100mg/ml 變性鮭精 DNA，68°C，e)6XSSC，0. 5% SDS, 100mg/ml 變性片段化鮭精 DNA，50% 甲酰胺，42°C，f) 50% 甲酰胺，4 X SSC 42 V,g)50% (體積/體積)甲酰胺，0. 牛血清白蛋白，0. l%Ficoll,0. 聚乙烯吡 咯烷酮，50mM磷酸鈉緩沖液pH 6. 5,750mM NaCl，75mM檸檬酸鈉，42°C，h)2X 或 4XSSC，50°C (低嚴(yán)格條件)，或i)30到40%甲酰胺，2X或4XSSC，42°C (低嚴(yán)格條件)。(2)例如，可以從下面的條件選擇步驟a)0. 015M NaCl/0. 0015M 檸檬酸鈉/0. 1% SDS, 50°C,b)0. IXSSC 65°C,c)0. 1XSSC,0. 5% SDS,68°C,d)0. 1XSSC，0. 5% SDS，50% 甲酰胺，42°C，e)0. 2XSSC,0. 1% SDS,42°C,f)0. 2X SSC 65 °C (低嚴(yán)格條件)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含多核苷酸，其與包含或者由 具有Seq ID No. 1或3或5或6所示序列或者其片段的核酸分子組成的核酸分子雜交。所 述片段包含或者優(yōu)選由 Seq ID No. 1 或 3 或 5 或 6 的 15、20、30、40、70、100、300、500、700、 1000或更多殘基組成。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含在“嚴(yán)格”雜交條件下與包含或者由具 有Seq ID No. 1或3或5或6所示序列或者其片段的核酸分子組成的核酸分子雜交的多核 苷酸。本文所用的術(shù)語(yǔ)“在嚴(yán)格雜交條件下”指任一種本文提到的嚴(yán)格雜交條件。在 另一實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“在嚴(yán)格雜交條件下”指在實(shí)施例中提及或在Sambrook(Molecular Cloning ；A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY(1989)中所用的雜交條件。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本文所用的術(shù)語(yǔ)“在嚴(yán)格雜交條件下”指所有本文提到的 嚴(yán)格雜交條件，表示多核苷酸在所有提到的嚴(yán)格條件下雜交。來(lái)自其他生物的Rpi_blb2可以由其他DNA序列編碼，所述序列在松弛雜交條件 下與Seq ID No. 1或3或5或6中所示序列雜交并且表達(dá)時(shí)編碼具有Rpi_blb2的活性的 肽。此外，一些應(yīng)用必須在低嚴(yán)格雜交條件下進(jìn)行，對(duì)雜交的特異性沒有任何影響。例如，可 以用本發(fā)明的多核苷酸探測(cè)總DNA的DNA印跡分析并在低嚴(yán)格條件(55°C，2XSSPE，0. 1% SDS中)下洗滌。雜交分析可以揭示僅編碼Rpi_blb2的基因的簡(jiǎn)單模式。此類低嚴(yán)格雜交 條件的另一實(shí)例是4X SSC 50°C下，或者用30到40%甲酰胺在42°C雜交。此類分子包含本 發(fā)明的Rpi_blb2的片段、類似物或者衍生物并且例如通過(guò)單獨(dú)或組合的氨基酸和/或核苷 酸缺失、插入、替代、加入和/或重組或本領(lǐng)域已知的任何其他修飾而與上述氨基酸序列或 者它們潛在的核苷酸序列不同。然而，優(yōu)選使用高嚴(yán)格雜交條件。術(shù)語(yǔ)“同源”指各自核酸分子或者編碼的蛋白質(zhì)在功能和/或結(jié)構(gòu)上等價(jià)。與上述 核酸分子同源并且是所述核酸分子衍生物的核酸分子為例如，所述核酸分子代表修飾的變 異，其具有相同的生物功能，尤其編碼具有相同或基本上相同生物功能的蛋白質(zhì)。它們可以 是天然發(fā)生的變異，如來(lái)自其他植物變種或品種的序列，或者突變。這些突變可以天然發(fā)生 或者可以通過(guò)誘變技術(shù)得到。等位基因變異可以是天然發(fā)生的等位基因變體以及合成產(chǎn)生 或者基因工程化的變體。通過(guò)例如，測(cè)試所述多肽與抗體的結(jié)合可以鑒定結(jié)構(gòu)等價(jià)物。結(jié) 構(gòu)等價(jià)物具有相似的免疫學(xué)特征，例如，包含相似的表位。術(shù)語(yǔ)“片段”、“序列的片段”或“序列的部分”指所指的最初序列的截短的序列。截 短的序列(核酸或者蛋白質(zhì)序列)可以在長(zhǎng)度上變化很大；最小尺寸是提供具有所指最初 序列的相當(dāng)功能和/或活性的序列的足夠大小的序列；而最大尺寸不是關(guān)鍵的。在一些應(yīng) 用中，最大尺寸通常不顯著大于提供最初序列的所希望的活性和/或功能所需的尺寸。通常，截短的氨基酸序列將長(zhǎng)為約5到約1260個(gè)氨基酸。然而，更典型地，該序列 將最大長(zhǎng)約1000個(gè)氨基酸，優(yōu)選最大約500或100個(gè)氨基酸。通常希望選擇具有至少約 10、12或15個(gè)氨基酸，多達(dá)最大約20到約25個(gè)氨基酸的序列。術(shù)語(yǔ)“表位”涉及抗原內(nèi)的特異免疫反應(yīng)位點(diǎn)，也稱作抗原決定簇。這些表位可以 是聚合成分中單體的線陣-如蛋白質(zhì)中的氨基酸-或者組成為或者包含更復(fù)雜的二級(jí)或者 三級(jí)結(jié)構(gòu)。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到所有免疫原(即，能夠引起免疫應(yīng)答的物質(zhì))都是抗原；然 而，一些抗原(如半抗原)不是免疫原，但是通過(guò)偶聯(lián)載體分子可以稱為免疫原性的。術(shù)語(yǔ) “抗原”包括對(duì)物質(zhì)的參考，可以產(chǎn)生針對(duì)該物質(zhì)的抗體和/或該抗體對(duì)該物質(zhì)是特異免疫 反應(yīng)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及Rpi_blb2的表位。術(shù)語(yǔ)“一個(gè)或幾個(gè)氨基酸”涉及至少一個(gè)氨基酸但是不多于將導(dǎo)致低于70%同一 性的同源性的氨基酸數(shù)。優(yōu)選地，同一性多于75%或80%，更優(yōu)選為85%、90%或95%，甚 至更優(yōu)選為96%、97%、98%或99%同一性。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”和“核酸分子”還涉及“分離的”多核苷酸或者核酸分子?！胺蛛x 的”核酸分子是與存在于該核酸的天然來(lái)源的其他核酸分子分離的核酸分子。優(yōu)選地，“分 離的”核酸沒有這樣的序列，其天然地在所述核酸所來(lái)源的生物的基因組DNA中所述核酸的 側(cè)翼(即，位于所述核酸的5’和3’末端的序列)。例如，在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸可以含有小于約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb或0. Ikb或更少的核苷酸序列，其天然 位于所述核酸所來(lái)源的生物的基因組DNA中所述核酸分子的側(cè)翼。此外，本發(fā)明的多核苷 酸，尤其“分離的”核酸分子，如cDNA分子，當(dāng)通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)可以基本上無(wú)其他細(xì)胞 材料，或者培養(yǎng)基，或者當(dāng)化學(xué)合成時(shí)可以基本上無(wú)化學(xué)前體或者其他化學(xué)品。此外，本發(fā)明的多核苷酸包含與上述多核苷酸的核苷酸序列之一或者其部分互補(bǔ) 的核酸分子。與Seq ID No. 1或3或5或6中所示核苷酸序列之一互補(bǔ)的核酸分子是與 Seq ID No. 1或3或5或6中所示核苷酸序列之一足夠互補(bǔ)的序列，從而它可以與Seq ID No. 1或3或5或6中所示核苷酸序列雜交，從而形成穩(wěn)定的雙鏈體。本發(fā)明的多核苷酸還包含與Seq ID No. 1或3或5或6中所示的核苷酸序列或者 其部分至少約70 %，優(yōu)選至少約75 %，更優(yōu)選至少約80 %、90 %或95 %，甚至更優(yōu)選至少約 96%、97%、98%、99%或以上同源的核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸包含與Seq ID No. 1 或3或5或6中所示的核苷酸序列或者其部分雜交，優(yōu)選在本文定義的嚴(yán)格條件下雜交的 核苷酸序列。此外，本發(fā)明的多核苷酸可以包含SEQ ID No :1或3或5或6的序列之一的編碼 區(qū)的僅一部分，例如，可以用作探針或者引物的片段或者編碼Rpi_blb2蛋白質(zhì)編碼基因的 生物活性部分的片段。從當(dāng)前Rpi_blb2蛋白質(zhì)編碼基因克隆確定的核苷酸序列允許產(chǎn)生 探針和引物，它們?cè)O(shè)計(jì)用于鑒定和/或克隆它在其他細(xì)胞類型和生物中的同源物。探針/引 物通常包含基本上純化的寡核苷酸。寡核苷酸通常包含核苷酸序列區(qū)，其在嚴(yán)格條件下與 例如，SEQ ID No :1或3或5或6中提出的序列之一的反義鏈的至少約12、15個(gè)，優(yōu)選約20 或25個(gè)，更優(yōu)選約40、50或75個(gè)連續(xù)核苷酸雜交，例如與SEQ ID No :1或3或5或6中給 出的序列之一的反義序列或者其天然發(fā)生的突變體雜交?；诒景l(fā)明核苷酸的引物可以用 于PCR反應(yīng)中克隆Rpi-blb2同源物，例如，使用本發(fā)明的實(shí)施例中描述的引物，如表3a或 3b中所示的引物，優(yōu)選引物ARFlF和ARF1R。用引物univ24R和univl4L進(jìn)行的PCR將導(dǎo)致 Rpi-blb2的片段，其可以如本文描述的使用。所述引物組可以互換。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 組合所述引物以得到所希望的產(chǎn)物，例如，得到全長(zhǎng)克隆或者部分序列?；赗pi_blb2核 苷酸序列的探針可以用于檢測(cè)編碼相同或者同源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄物或者基因組序列。探針可 以還包含連接該探針的標(biāo)記物組，例如，標(biāo)記物組可以是放射性同位素、熒光化合物、酶、或 者酶輔因子。此類探針可以用作基因組標(biāo)記測(cè)試試劑盒的部分用以鑒定表達(dá)Rpi_blb2的 細(xì)胞，如通過(guò)測(cè)量細(xì)胞樣品中Rpi_blb2編碼核酸的水平，例如，通過(guò)檢測(cè)Rpi_blb2mRNA水 平或者測(cè)定基因組Rpi_blb2基因是否已經(jīng)突變或者缺失進(jìn)行所述鑒定。本發(fā)明的多核苷酸編碼多肽或者其部分，所述多肽或者其部分包括與SEQ ID No 2或4的氨基酸足夠同源的氨基酸序列從而蛋白質(zhì)或者其部分保持參與對(duì)病原體抗性，尤 其植物中實(shí)施例中所描述的Rpi_blb2蛋白質(zhì)活性的能力。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“足夠同源 的”指蛋白質(zhì)或者其部分的氨基酸序列包括最小數(shù)目的與SEQ ID No :2或4的氨基酸序列 相同或等價(jià)(例如，氨基酸殘基與本發(fā)明的多肽序列之一中的氨基酸殘基具有相似側(cè)鏈) 氨基酸殘基，從而所述蛋白質(zhì)或者其部分能夠參與植物對(duì)所述病原體的抗性。在本文描述 了 Rpi-blb2蛋白質(zhì)活性的實(shí)例。從而，Rpi-blb2蛋白質(zhì)的功能直接或者間接有助于對(duì)植 物病原體，優(yōu)選對(duì)本文提到的病原體，更優(yōu)選對(duì)致病疫霉的抗性。所述蛋白質(zhì)至少約70 %，優(yōu)選至少約75 %，更優(yōu)選至少約80 %、90 %、95 %，最優(yōu)選至少約96%、97%、98%、99%或以上同源于SEQ ID No :2或4的完整氨基酸序列。本發(fā)明的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)的部分優(yōu)選具有生物活性。如本文提到的，術(shù)語(yǔ)“生物活性部分”意在包括部分，例如，結(jié)構(gòu)域/基序，所述部 分賦予對(duì)卵菌植物病原體和/或煙粉虱(Bemisia tabaci)和/或蚜蟲的抗性或者具有免 疫學(xué)活性從而它結(jié)合特異結(jié)合Rpi_blb2蛋白質(zhì)的抗體或者它具有實(shí)施例中給出或者本文 描述的活性。通過(guò)分離SEQ ID No 1或3或5或6中序列之一的一部分，表達(dá)Rpi_blb2蛋白質(zhì) 或者肽的編碼部分(例如，通過(guò)體外重組表達(dá))并評(píng)估蛋白質(zhì)的編碼部分的活性可以制備 編碼本發(fā)明多肽的生物活性部分的額外的核酸片段。本發(fā)明還包括由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而與SEQ ID No 1或3或5或6 (和其部分) 中所示核苷酸序列之一不同從而編碼SEQ ID No :2或4中所示序列編碼的Rpi_blb2多肽 的多核苷酸。此外，本發(fā)明的多核苷酸具有編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)具有SEQ ID No :2或4中所示氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸編碼全長(zhǎng)蛋白質(zhì)， 其與SEQ ID No :2或4中所示氨基酸序列基本上同源。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解在群體(例如，S.bulbocastanum群體)內(nèi)可以存在 DNA序列多態(tài)性，其導(dǎo)致氨基酸序列中的改變。由于自然變異，Rpi_blb2基因中此類遺傳多 態(tài)性可以存在于群體內(nèi)的個(gè)體間。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“基因”和“重組基因”指包含編碼Rpi_blb2，優(yōu)選 S.bulbocastanum Rpi_blb2的可讀框的核酸分子。此類天然變異通?？梢詫?dǎo)致Rpi_blb2 基因的核苷酸序列中1-5%變異。本發(fā)明范圍內(nèi)意在包括由于天然變異導(dǎo)致并且不改變 Rpi-blb2的功能活性的Rpi_blb2中的任意和所有此類核苷酸變異和所得氨基酸多態(tài)性。使用本發(fā)明的多核苷酸或者其部分作為雜交探針，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)，在嚴(yán)格雜 交條件下，可以基于與本文公開的S. bulbocastanum Rpi_blb2多核苷酸的同源性分離相應(yīng) 于Rpi-blb2cDNA的天然變體和非S. bulbocastanum同源物的多核苷酸。因此，在另一實(shí)施 方案中，本發(fā)明的多核苷酸長(zhǎng)為至少20個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，它在嚴(yán)格條件下與包含本發(fā)明 多核苷酸的核苷酸序列，例如，SEQ ID No :1或3或5或6的核酸分子雜交。在其他實(shí)施方 案中，所述核酸長(zhǎng)為至少20、30、50、100、250或更多個(gè)核苷酸。術(shù)語(yǔ)“在嚴(yán)格條件下雜交” 如上定義并且意在描述雜交和洗滌條件，在該條件下相互至少65%同一的核苷酸序列通常 保持相互雜交。優(yōu)選地，所述條件使得相互至少約70%，更優(yōu)選至少約75%或80%，甚至更 優(yōu)選至少約85%、90%或95%或以上同一的序列通常保持相互雜交。優(yōu)選地，在嚴(yán)格條件 下與SEQ ID No :1或3或5或6的序列雜交的本發(fā)明的多核苷酸相應(yīng)于天然發(fā)生的核酸分 子。如本文所用的，“天然發(fā)生的”核酸分子指具有天然發(fā)生的核苷酸序列的RNA或者 DNA分子(例如，編碼天然蛋白質(zhì))。優(yōu)選地，所述多核苷酸編碼天然的S.bulbocastanum Rpi-blb2。除了可能存在于群體中的Rpi_blb2序列的天然發(fā)生的變體外，技術(shù)人員將還理 解通過(guò)突變可以向編碼Rpi-blb2的多核苷酸的核苷酸序列中引入改變，從而導(dǎo)致所編碼 的Rpi-blb2的氨基酸序列的改變，而不改變Rpi_blb2的功能能力。例如，可以在編碼 Rpi-blb2的核苷酸的序列中，例如，在SEQID No :1或3或5或6中進(jìn)行導(dǎo)致在“非必需”氨基酸殘基處氨基酸替代的核苷酸替代?！胺潜匦琛卑被釟埢强梢詮腞pi_blb2蛋白 質(zhì)的野生型序列改變而不改變所述Rpi-blb2蛋白質(zhì)活性的殘基，而“必需”氨基酸殘基是 Rpi-blb2蛋白質(zhì)活性所需的。然而，其他氨基酸殘基(例如，在具有Rpi_blb2活性的結(jié)構(gòu) 域中不保守或者僅半保守的那些殘基)可能對(duì)活性不是必需的，從而可能順從改變而不改 變Rpi-blb2活性。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知生物之間的密碼子選擇可以不同。因此，他將使得本發(fā) 明的多核苷酸的密碼子選擇適于所述多核苷酸或者多肽在其中表達(dá)的生物的選擇。因此，本發(fā)明涉及編碼Rpi_blb2的多核苷酸，所述Rpi_blb2含有對(duì)Rpi_blb2活 性不是必需的氨基酸中的改變。此類Rpi_blb2的氨基酸序列與SEQ ID No :2或4中所含 序列不同，但是仍然保持本文所述的Rpi_blb2活性。所述多核苷酸可以包含編碼多肽的 核苷酸序列，其中所述多肽包含與SEQ ID No :2或4的氨基酸具有至少約70%同一性的氨 基酸序列并且能夠參與對(duì)植物病原體的抗性。優(yōu)選地，所述核酸分子編碼的蛋白質(zhì)與SEQ IDNo :2或4中的序列具有至少約70%同一性，更優(yōu)選與SEQ ID No :2或4中序列之一具有 至少約75%同一性，甚至更優(yōu)選與SEQ ID No :2或4中序列具有至少約80%、90%、95%同 源性，最優(yōu)選與SEQ ID No :2或4中序列具有至少約96%、97%、98%或99%同一性。為了確定兩條氨基酸序列(例如，SEQ ID No :2或4的序列之一和其突變形式)或 者兩條核酸之間的百分?jǐn)?shù)同一性，為了最優(yōu)比較目的將序列進(jìn)行比對(duì)(例如，在一個(gè)蛋白 質(zhì)或者核酸的序列中引入缺口以與另一蛋白質(zhì)或者核酸進(jìn)行最優(yōu)比對(duì))。然后比較相應(yīng)氨 基酸位置或者核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)一條序列(例如，SEQ ID No:2或4 的序列之一)中的位置被與另一條序列(例如，所選序列的突變形式)中相應(yīng)位置相同的 氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，這兩個(gè)分子在該位置同源(即，本文所用的氨基酸或者核酸 “同源性”等價(jià)于氨基酸或核酸“同一性”)。兩條序列之間百分?jǐn)?shù)同源性是所述序列共有的 相同位置數(shù)的函數(shù)(即，％同源性=相同位置數(shù)/位置總數(shù)X 100)。借助于程序算法GAP (Wisconsin Package 版本 10. 0，University offfisconsin, Genetics Computer Group(GCG), Madison, USA ；Altschul 等人(1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389，參照以下)通過(guò)比較可以計(jì)算同源性，設(shè)置下面的參數(shù)缺口權(quán)重50 長(zhǎng)度權(quán)重3平均匹配10 平均錯(cuò)配0例如，在核酸水平與SEQ ID NO 1的序列具有至少80%同源性的序列理解為指一 個(gè)序列，其當(dāng)通過(guò)上面的程序算法使用上面的參數(shù)設(shè)置與SEQ ID NO :1的序列比較時(shí)，具有 至少80%同源性。兩條多肽之間的同源性理解為指借助于程序算法GAP(WiSCOnSin Package版本 10. 0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA), ^cBT" 面的參數(shù)缺口權(quán)重8 長(zhǎng)度權(quán)重2平均匹配2912 平均錯(cuò)配_2003，通過(guò)比較計(jì)算的每條完整序列長(zhǎng)度上氨基酸序列的同一性。例如在蛋白質(zhì)水平與序列SEQ ID NO :2具有至少80%同源性的序列理解為指一 個(gè)序列，其當(dāng)通過(guò)上面的程序算法使用上面的參數(shù)設(shè)置與SEQID NO 2的序列比較時(shí)，具有至少80%同源性。在本申請(qǐng)中，用可以在驟w. ebi.ac.uk/tools找到的程序clustalW，選擇序列分 析并選擇選項(xiàng)clustalW(多序列比對(duì))確定同源性。所有選項(xiàng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行，如下比對(duì)完全；輸出格式aln w/numbers ；輸出順序?qū)?zhǔn)的；顏色調(diào)整無(wú); ktup (字號(hào)):def ；窗口長(zhǎng)def ；得分類型百分?jǐn)?shù)；topdiag :def ；pairgap :def ；矩陣 def ；缺口打開:def ；結(jié)束缺口 :def ；缺口延伸:def ；延伸距離:def ；cpu模式單個(gè)；樹圖/ 類型進(jìn)化樹；樹圖/距離隱藏；種系發(fā)生樹/樹類型無(wú)；種系發(fā)生樹/校正距離關(guān)；種 系發(fā)生樹/忽略缺口 關(guān)。因此，優(yōu)選根據(jù)clustalW的同源性計(jì)算。通過(guò)替代、插入或者缺失，從根據(jù)本發(fā)明的SEQ ID No :2或4所示的多肽之一衍生 的功能等價(jià)物與根據(jù)本發(fā)明的SEQ ID No :2或4所示的多肽之一具有至少70%，優(yōu)選至少 80 %，優(yōu)選至少90 %，特別優(yōu)選至少95 %，非常特別優(yōu)選至少98 %同一性并且通過(guò)具有與 SEQ ID No :2或4中所示多肽基本上相同的性質(zhì)區(qū)別開來(lái)。通過(guò)替代、插入或者缺失從根據(jù)本發(fā)明的SEQ ID No :1或3或5或6所示的核苷酸 序列衍生的功能等價(jià)物與根據(jù)本發(fā)明的SEQ ID No :2或4所示的多肽之一具有至少70%， 優(yōu)選至少80 %，優(yōu)選至少90 %，特別優(yōu)選至少95 %，非常特別優(yōu)選至少98 %同一性并且編 碼具有與SEQ ID No :2或4中所示多肽基本上相同的性質(zhì)的多肽。功能等價(jià)物的“基本上相同的性質(zhì)”尤其理解為指賦予病原體抗性表型或者賦予 或者增加對(duì)至少一種病原體的抗性而增加所述功能Rpi_blb2等價(jià)物在植物或者植物組 織、部分或細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的量、活性或者功能。感染后孢子形成和病灶表型聯(lián)合功能等價(jià) 物的蛋白質(zhì)量、活性或功能的所述增加理解為基本性質(zhì)。編碼與SEQ ID No :2或4的蛋白質(zhì)序列同源的Rpi_blb2的核酸分子可以通過(guò)在 本發(fā)明的多核苷酸的核苷酸序列，尤其SEQ ID No :1或3或5或6中引入一個(gè)或多個(gè)核苷 酸替代、加入或缺失來(lái)產(chǎn)生，從而向所編碼的蛋白質(zhì)中引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代、加入或 缺失。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變可以向例如SEQ ID No :1或3或5或 6的序列中弓I入突變。優(yōu)選地，在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基上進(jìn)行保守氨基酸替 代?！氨Ｊ匕被崽娲笔瞧渲袑被釟埢镁哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基替換的替代。本 領(lǐng)域中已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基 酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具 有不帶電極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、 半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、 苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分枝側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨 酸)和芳香族側(cè)鏈氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。從而，Rpi_blb2中 預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基優(yōu)選用來(lái)自相同家族的另一氨基酸殘基替換。備選地，在另一實(shí) 施方案中，例如，通過(guò)飽和誘變可以沿著Rpi_blb2編碼序列的所有或部分隨機(jī)導(dǎo)入突變， 并且可以對(duì)所得突變體篩選本文描述的Rpi_blb2活性以鑒定保持Rpi-blb2活性的突變 體。SEQ ID No :1或3或5或6的序列之一誘變后，可以重組表達(dá)所編碼的蛋白質(zhì)并且可 以使用例如，本文描述的測(cè)定法(見實(shí)施例)測(cè)定所述蛋白質(zhì)的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中，Rpi_blb2蛋白質(zhì)和另一抗性蛋白質(zhì)的活 性增加了。
預(yù)計(jì)在田間條件下一種以上的抗性基因，尤其賦予對(duì)相同病原體的抗性的基因的 存在是有益的。對(duì)于存在能夠克服一種R-基因的抗性的病原體分離物(例如，致病疫霉品 種)的情況下，其他一種或多種R基因仍然是有功能的，使得所述病原體不能感染植物。兩 種未打敗的R基因的存在大大減小了病原體，尤其致病疫霉品種能夠突變成克服兩種或多 種R基因的品種的機(jī)會(huì)。在下文中“抗性多肽”或者“抗性蛋白質(zhì)”涉及多肽，其(增加的)活性將賦予 對(duì)敏感基因型(“野生型”或“參照”)的抗性。因此，Rpi_blb2是抗性蛋白質(zhì)以及例如， Rpi-blb (或者RB或Sbul)。“另一種抗性蛋白質(zhì)”涉及不同于本發(fā)明蛋白質(zhì)的另一種抗性 蛋白質(zhì)，而術(shù)語(yǔ)“抗性蛋白質(zhì)”包含本發(fā)明的多肽以及一種或多種抗性蛋白質(zhì)。還理解術(shù)語(yǔ) “和另一種抗性蛋白質(zhì)”涉及一種或多種其他抗性蛋白質(zhì)。從而，可以增加一種或多種抗性 蛋白質(zhì)的活性。在下文中描述了其他抗性蛋白質(zhì)。然而，通常任意其他已知的抗性蛋白質(zhì) 可以與本發(fā)明的多肽共表達(dá)或者可以通過(guò)本文描述的關(guān)于Rpi_blb2的任意方法增加它的 活性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，另一種抗性蛋白質(zhì)包含LRR結(jié)構(gòu)域和P環(huán)。超過(guò)30種以上賦予對(duì)細(xì)菌、真菌、卵菌、病毒、線蟲或者昆蟲抗性的植物疾病抗 性(R)基因的克隆和分子表征允許不管病原體特異性而對(duì)它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)類別中進(jìn)行分類 (Dangl和Jones，2001中綜述)。預(yù)測(cè)所表征的R基因的最豐富的類別(包含擬南芥屬基 因組中預(yù)測(cè)的基因的約0. 5% )編碼細(xì)胞外蛋白質(zhì)，其攜帶在其他受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì) 中也發(fā)現(xiàn)的富含亮氨酸重復(fù)單位(LRR)和核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)結(jié)構(gòu)域、基序。NBS-LRR R 蛋白質(zhì)主要在N-末端不同，所述N-末端顯示出與果蠅Toll蛋白質(zhì)和哺乳動(dòng)物白介素-1 受體結(jié)構(gòu)域(TIR-NBS-LRR)的序列相似性，或者編碼卷曲螺旋結(jié)構(gòu)(CC-NBS-LRR)，有時(shí)為 亮氨酸拉鏈(LZ-NBS-LRR)的形式。盡管可能是膜結(jié)合的，但是預(yù)測(cè)NBS-LRR蛋白質(zhì)為細(xì)胞 質(zhì)的。相比，預(yù)測(cè)攜帶LRR的R蛋白質(zhì)的兩個(gè)其他類別跨越細(xì)胞膜，具有胞外LRR結(jié)構(gòu)域 LRR-跨膜(LRR-TM) Cf蛋白質(zhì)和LRR-TM-激酶Xa21蛋白質(zhì)。所表征的缺少LRR的R蛋白質(zhì) 是來(lái)自番茄的Pto基因、來(lái)自甜菜的HsIpm-1基因、來(lái)自大麥的mlo基因、來(lái)自擬南芥的RpwS 基因和來(lái)自大麥的Rpgl基因。根據(jù)基因?qū)?gene-for-gene)假說(shuō)，疾病抗性遵循具有無(wú)毒性(Avr)功能的 病原體效應(yīng)分子的植物R蛋白質(zhì)的觀點(diǎn)，其中通過(guò)某種引發(fā)子(elicitor)識(shí)別復(fù)合體引發(fā) 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致超敏反應(yīng)(HR)。與其他受體一起，通常認(rèn)為NBS-LRR R蛋白質(zhì)具有調(diào)節(jié) 結(jié)構(gòu)，其具有分開的識(shí)別和發(fā)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，其中LRR是候選識(shí)別結(jié)構(gòu)域并且N-末端區(qū)包括 NBS——主要的發(fā)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。重組R蛋白質(zhì)的功能分析表明識(shí)別特異性實(shí)際上存在于LRR 中。此外，LRR是與相關(guān)NBS-LRR蛋白質(zhì)緊密相關(guān)的最多變區(qū)并且處于分叉選擇下。然而， 不斷積累的證據(jù)表明LRR也通過(guò)涉及推定的分子內(nèi)相互作用的負(fù)向調(diào)節(jié)有助于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 當(dāng)前，已經(jīng)從馬鈴薯克隆了 5種R基因，包括賦予對(duì)晚疫抗性的兩種R基因，并且所有基因 都屬于植物R基因的CC/LZ-NBS-LRR類。盡管S. demissum來(lái)源的Rl基因賦予對(duì)晚疫的品 種特異抗性，但是最近克隆的S. bulbocastanum來(lái)源的基因Rpi-blb (或者RB或者Sbul) 賦予對(duì)攜帶多種毒性因子的一系列致病疫霉分離物的完全抗性，并且還沒有表現(xiàn)品種特異 性。此外，如前描述，在墨西哥的田間實(shí)驗(yàn)中，含有Rpi-blb的體細(xì)胞雜種的子代植物不受 晚疫的影響，在所述田間中發(fā)現(xiàn)幾乎每個(gè)品種的真菌。闡明了通過(guò)培養(yǎng)的馬鈴薯和番茄中敏感表型的互補(bǔ)，通過(guò)用單一克隆的R基因可能實(shí)現(xiàn)廣譜晚疫抗性從兩性不相容的宿主物 種向培養(yǎng)的茄科的種間轉(zhuǎn)移的可能性。US 6，127，607描述了具有LRR結(jié)構(gòu)域和P環(huán)的抗 性蛋白質(zhì)。本文引用US 6，127，607的內(nèi)容作為參考。具體地，6到8列和11列描述了 LRR 結(jié)構(gòu)域和 P 環(huán)。此外，Song，2003，PNAS 100 (16)，9128-9133 說(shuō)明了圖 4 中 Rpi-blb LRR 基 序的比較并且在第9132上給出關(guān)于LRR結(jié)構(gòu)域的概述。在圖14以及圖15中顯示了本發(fā) 明多肽的結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，選自Rpi-blb (同義詞 RB 或 Sbul)、Rpi-ABPTU Rpi_blb3、Rpi-mcd、Rl、 R-ber (同義詞 R12)、Rpil、R2、R3a、R3b、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、Rll、Ph_l、Ph_2 和 Ph_3 構(gòu)成的組的一種或多種抗性蛋白質(zhì)的活性增加了。優(yōu)選除了 Rpi_blb2之外，至少Rpi-blb 的活性也增加了。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，例如，轉(zhuǎn)基因的Rpi_blb2蛋白質(zhì)的表達(dá)增加了，并 且另一轉(zhuǎn)基因抗性基因的表達(dá)增加了。與Rpi_blb2(或者RB或者Sbul)共表達(dá)的抗性蛋 白質(zhì)優(yōu)選為本文提到的抗性蛋白質(zhì)之一，尤其Rpi-blb、Rpi-ABPTU Rpi_blb3、RU Rpil、 R-ber、Rpi-mcd、R2、R3a、R3b、R6、R7、Ph_l、Ph_2或Ph_3，但是也可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的賦予對(duì)植物病原體的其他抗性之一的蛋白質(zhì)。如所提到的，根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“增加的表達(dá)”也包括多核苷酸或者多肽的從頭表達(dá)。最優(yōu)選的是通過(guò)本發(fā)明多肽與Rpi-blb的共表達(dá)增加抗性。如在實(shí)施例和Song 2003，PNAS 100 (16)，9128中描述的，Rpi-blb和Rpi-blb2在離脫葉測(cè)定中提供了對(duì)致病疫 霉分離物的完全抗性。所述抗性賦予基因例如描述于RB 或者 Sbul (Rpi-blb 的同義詞):AY336128[gi =32693280], (Song 等人，2003)。 包含Rpi-blb基因的BAC克隆177013和CB3A14已經(jīng)保藏在GenBank，檢索號(hào)AY303171和 AY303170 ；Rl :AF447489[gi 9117432422], (Ballvora 等人，2002)；Rpil :Kuhl, J. C. , Hanneman, R. Ε,禾口 Havey, Μ. J, (2201) Ch aracterization and mapping of Rpil,a late blight resistance locus fromdiploid(IEBN)Mexican Solanum pinnatisectum. Molecular genet. Genomics 265 :977_985 ;R-ber :Ewing, Ε. Ε. , Simko, I. , Smart, C. D. , Bonierbale, M. W, Mizubuti, E. S. G, May, G. D,禾口 Fry, W. E, (2000)Genetic mapping fromfield tests of qualitative and quantitative resistance to Phytophthorainfestans in a population derived from Solanum tuberosum and Solanumberthaultii. Molecular breeding 6 25-36 ；R2 :Li, X. ，vanEck, H. J. ，vander Voort, J. N. A. M, Huigen, D. J, Stam, P,禾口 Jacobsen,E. (1998)Autotetraploids and genetic mapping usingcommon AFLP markers the R2 allele conferring resistance toPhytophthora infestans mapped on potato chromosome 4.Theoretical andApplied Genetics 96(8) :1121_112 ;R3、R6、R7 :Elkharbotly, A, Palominosanchez, C, Salamini, F, Jacobsen, EjP Gebhardt,C. (1996)R6 and R7 alleles of potato conferringrace-specific resistance to Phytophthora infestans(Mont)de Baryidentified genetic loci clustering withthe R3 locus on chromosome XI. Theoretical and Applied. Genetics 92(7) :880_884 ;Ph-I =Bonde 禾口 Murphy(1952)Main Agric. Exp. Stn. Bull. No 497 ；Ph-2 =Moreau, P, Thoquet, P. ，Olivier, J, Laterrot, H，禾口 Grimsley，N. H. (1998) Genetic mapping of Ph-2, a single locus controlling partiairesistance to Phytophthora infestans in tomato. Molecular Plant MicrobeInteractions 11(4) 259-269 ；Ph-3 Chunwongse, J, Chunwongse, C. , Black, L.,禾口 Hanson, P. (2002)Molecular mapping of the Ph-3 gene for late blight resistance in tomato. Journal of Horticultural Science & Biotechnology 77(3) :281_286 ;Rpi-blb3、Rpi-ABPTl 禾口 Rpi—mcd :Park，T. H, Van der Vossen, E, Vleeshouwers, V. G. A. A, Tan, A, Visser, R. G. F.禾口 Van Eck, H. J. 2004. Major resistance genes for tuber and leaf resistance to Phytophthorainfestans in potato :An outline of a PhD project. Crop FunctionalGenomics 2004, July 2004, Jeju, Korea, 93 頁(yè)；R3a 禾口 R3b Huang, S.，Vleeshouwers, V. G. A. A, Weri j，J. S, Hutten, R. C. B, Van Eck, H.J, Visser, R. G. F,禾口 Jacobsen, E. (2004). The R3resistance to Phytophthora infestans in potato is conferred by two closelylinked R genes with distinct specificities. MPMI 17(4)，428-435 ；在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明，Rpi_blb2的活性增加了，例如，本發(fā)明多核苷酸 的表達(dá)增加了并且編碼 Rpi-blb、Rpi-ABPTl、Rpi-blb3、Rpi-mcd Rl、R_ber、Rpil、R2、R3a、 R3b、R6、R7、Ph-l、Ph-2和/或Ph_3的至少一種核酸分子的表達(dá)增加了，其中所述核酸分子 選自a)核酸分子，其編碼至少如下的至少成熟形式Rpi-blb (或者 RB-或者 Sbul-)多肽，優(yōu)選由 GenBank 檢索號(hào) AY336128[gi 32693280]中所示的序列編碼；Rl多肽，優(yōu)選由GenBank檢索號(hào)AF447489 [gi9117432422]中所示的序列編碼；Rpi-blb3、Rpi-ABPTl 和 / 或Rpi-mcd 多月太，優(yōu)選由 Park，T. H，Vander Vossen,Ε.， Vleeshouwers, V. G. A. A, Tan, A, Visser, R. G. F.禾口 VanEck, H. J. 2004. Major resistance genes for tuber and leaf resistance toPhytophthora infestans in potato :An outline of a PhD project. CropFunctional Genomics 2004, July 2004, Jeju,Korea,93 頁(yè)中所示或者其中的信息可以推導(dǎo)的序列編碼；R3a 和 / 或 R3b 多肽，優(yōu)選由 Huang，S.，Vleeshouwers, V. G. A. A, Weri j, J. S.， Hutten, R. C. B, Van Eck, H. J, Visser, R. G. F,禾口 Jacobsen, E. (2004). The R3 resistance to Phytophthora infestans in potato isconferred by two closely linked R genes with distinct specificities. MPMI17 (4)，428-435中所示或者其中的信息可以推導(dǎo)的序 列編碼；和/或病原體，優(yōu)選致病疫霉抗性賦予蛋白質(zhì)，其如所描述的作圖和表征，例如，對(duì)于 Rpil 在 Kuhl, J. C, Hanneman, R. E，禾口 Havey，Μ. J, (2001) Characterization and mapping of Rpi1, a late blight resistance locus fromdiploid(IEBN)Mexican Solanum pinnatisectum. Molecular genet. Genomics 265 :977_985 中；
R-ber ^ Ewing, Ε. Ε, Simko, I. ， Smart, C. D. ，Bonierbale, Μ. W，Mizubuti, Ε·S.G，May，G. D，禾口 Fry，W. Ε，(2000)Genetic mapping fromfield tests of qualitative and quantitative resistance to Phytophthorainfestans in a population derived from Solanum tuberosum and Solanumberthaultii. Molecular breeding 6 :25_36 中；對(duì)于 R2 在 Li，Χ.，vanEck，H. J.，vanderVoort, J. N. A. M，Huigen, D. J.，Stam，P，禾口 Jacobsen,E. (1998)Autotetraploids and genetic mapping usingcommon AFLP markers the R2 allele conferring resistance toPhytophthora infestans mapped on potato chromosome 4.Theoretical andApplied Genetics 96(8) :1121_1128 中；對(duì)于 R3、R6、R7 在 Elkharbotly，A，Palominosanchez, C，Salamini, F，Jacobsen， Ε.，禾口 Gebhardt， C. (1996)R6 and R7 alleles of potatoconferring race-specific resistance to Phytophthora infestans(Mont)deBary identified genetic loci clustering with the R3 locus on chromosomeXi. Theoretical and Applied. Genetics 92(7) 880-884 中；對(duì)于Ph-I 在 Bonde 和 Murphy (1952)Main Agric. Exp. Stn. Bull. No497 ；或?qū)τ?Ph-2 在 Moreau, P，Thoquet, P. ，Olivier, J， Laterrot, H，禾口 Grimsley， N. H. (1998)Genetic mapping of Ph_2，a single locus control1ingpartial resistance to Phytophthora infestans in tomato. Molecular PlantMicrobe Interactions 11(4) 259-269中；和/或?qū)τ?Ph-3 在 Chunwongse, J，Chunwongse, C.，Black，L.，禾口 Hanson，P. (2002) Molecular mapping of the Ph_3 gene for late blight resistance intomato. Journal of Horticultural Science & Biotechnology 77(3) :281_286 中；或者賦予病原體抗性的多肽，優(yōu)選從所述出版物可以推導(dǎo)的賦予致病疫霉抗性的 多肽；b)核酸分子，其核苷酸序列是(a)的核苷酸序列由于遺傳密碼簡(jiǎn)并導(dǎo)致的序列；c)核酸分子，其編碼的多肽通過(guò)從(a)或(b)的多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序 列的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的替代、缺失和/或加入從(a)或(b)的多核苷酸編碼的多肽衍生；d)核酸分子，其編碼的多肽的序列與(a)的核酸分子編碼的多肽的氨基酸序列具 有70%或以上的同一性；e)核酸分子，其包含(a)到(d)任一項(xiàng)的核酸分子編碼的多肽的片段或者具有表 位的部分；f)核酸分子，其編碼(a)到(e)任一項(xiàng)編碼的多肽的以氨基酸1、30、50、100、 200、300、500 或 1000 開始并以氨基酸 1276、1000、500、300、200、50、30、或 1 結(jié)束的片段；g)包含(a)或(b)任一項(xiàng)的多核苷酸的至少20個(gè)核苷酸的核酸分子；h)核酸分子，其編碼的多肽被針對(duì)(a)到(f)任一項(xiàng)的核酸分子編碼的多肽產(chǎn)生 的單克隆抗體識(shí)別；i)核酸分子，其可以通過(guò)用具有(a)到(h)任一項(xiàng)的核酸分子或者其至少20個(gè)， 優(yōu)選30或更多核苷酸的片段的序列的探針在嚴(yán)格條件下篩選適宜文庫(kù)得到；和j)核酸分子，其互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下與(a)或(i)任一項(xiàng)的核酸分子雜交；或者(a)到(j)任一項(xiàng)的互補(bǔ)鏈。
因此，本發(fā)明的方法賦予本發(fā)明的所述植物之一、植物組織或者植物細(xì)胞對(duì)卵 菌門植物病原體的抗性，優(yōu)選對(duì)腐霉目(Pythiales)或者Peronosperales，更優(yōu)選對(duì)腐 霉科或者霜霉科(Peronosporaceae)，更優(yōu)選對(duì)疫霉屬(Phytophthora)或者盤梗霉屬 (Bremia)或者霜霉屬(Peronospera)或者單軸霉屬(Plasmopara)病原體的抗性，最優(yōu)選 iife^^^lJ^f^^J^^iSeje^iji^l^ft (Phytophthora parasitica var. nicotianae) (導(dǎo)致煙草黑柄等)、大豆疫霉(Phytophthora sojae)(導(dǎo)致大豆中疫霉根部腐爛)、辣椒 疫霉(Phytophthora capsici)(導(dǎo)致胡椒、葫蘆和番茄中腐爛)、紅腐疫霉(Phytophthora erythroseptica)(導(dǎo)致馬鈴薯中粉紅色腐爛)、葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)(導(dǎo) 致葡萄藤霜霉病)、萵苣盤梗霉(Bremia lactuca)(導(dǎo)致萵苣中霜霉病)或者Peronospora tabaci (導(dǎo)致煙草中藍(lán)色霉)的物種。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知和例如，在Sambrook等人，Cold SpringHarbor Laboratory Press,NY, 1989中描述的方法可以在根據(jù)本發(fā)明的植物、植物細(xì)胞、植物組織、 植物器官或植物部分中增加、產(chǎn)生或者刺激Rpi_blb2的活性。從而，在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的方法，其中表達(dá)是從頭表達(dá)。術(shù)語(yǔ)細(xì)胞、組織或者生物或者其部分中的“從頭表達(dá)”在本文理解為涉及基因產(chǎn)物 的表達(dá)，而以前所述基因產(chǎn)物或者所述基因產(chǎn)物的活性，尤其相應(yīng)多肽或者多核苷酸在細(xì) 胞、組織、或者生物或者其部分中是不可檢測(cè)的。優(yōu)選地，編碼細(xì)胞、組織、或者生物或者其 部分中的多肽或者多核苷酸并且應(yīng)該從頭表達(dá)的基因不存在于細(xì)胞、組織、或者生物或者 其部分中的基因組中。如果在細(xì)胞、組織、或者生物或者其部分中不能檢測(cè)到基因產(chǎn)物的表 達(dá)，那么通常認(rèn)為在細(xì)胞、組織、或者生物或者其部分中沒有發(fā)生表達(dá)。因此，如果不能檢測(cè) 到活性，那么通常認(rèn)為沒有相應(yīng)活性存在。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知檢測(cè)方法和手段發(fā)展 到更高靈敏性。從而，在優(yōu)選實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“從頭表達(dá)”涉及系統(tǒng)中新的和額外的表達(dá)， 其中例如由于低水平表達(dá)或者表達(dá)幾乎無(wú)活性的基因產(chǎn)物而活性水平太低以致不能賦予 對(duì)植物病原體，尤其對(duì)致病疫霉的抗性。敲除株系和低和/和高表達(dá)株系表型的比較可以 表明是否可以觀察到針對(duì)本文提到的病原體的抗性中的差異。因此，在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，Rpi_blb2和/或另一種抗性蛋白質(zhì)的內(nèi)源活 性增加了。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以增加細(xì)胞中表達(dá)水平。本文描述了幾種技 術(shù)，例如，本發(fā)明的多核苷酸或者多肽的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。多核苷酸或者多肽可以是外源來(lái)源。 優(yōu)選地，導(dǎo)入與宿主細(xì)胞、植物細(xì)胞、植物組織或者植物相同遺傳起源的多核苷酸。通過(guò)一些方法可以增加活性，尤其內(nèi)源活性，還增加轉(zhuǎn)基因表達(dá)的Rpi_blb2的活 性。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)下面的步驟增加本文描述的抗性蛋白質(zhì)的活 性a)穩(wěn)定抗性蛋白質(zhì)；b)穩(wěn)定編碼抗性蛋白質(zhì)的mRNA ；c)增加抗性蛋白質(zhì)的比活；d)表達(dá)用于抗性表達(dá)的同源或者人工轉(zhuǎn)錄因子或者增加用于抗性表達(dá)的同源或 者人工轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)；e)通過(guò)外源誘導(dǎo)因子刺激抗性蛋白質(zhì)活性；
f)表達(dá)轉(zhuǎn)基因抗性基因；和/或g)增加抗性編碼基因的拷貝數(shù)。通常，通過(guò)增加生物中特定蛋白質(zhì)，即抗性蛋白質(zhì)的量可以增加所述生物，尤其植 物細(xì)胞、植物、或者植物組織中的活性。“蛋白質(zhì)的量”理解為生物、組織、細(xì)胞或者細(xì)胞隔室 中多肽，優(yōu)選Rpi_blb2的量。蛋白質(zhì)的量的“增加”指在相同條件下(例如，培養(yǎng)條件、植 物年齡等等)，與沒有應(yīng)用該方法的相同屬和種的野生型相比，生物、組織、細(xì)胞或者細(xì)胞隔 室中蛋白質(zhì)的量的數(shù)量增加(例如，通過(guò)下文描述的方法之一)。所述增加達(dá)到至少10%， 優(yōu)選至少20 %或至少50 %，尤其優(yōu)選至少70 %或90 %，非常特別優(yōu)選至少100 %，最優(yōu)選至 少200%或以上?；钚缘摹霸黾印崩斫鉃橹冈谙嗤瑮l件下(例如，培養(yǎng)條件、植物年齡等等)，與沒有 應(yīng)用該方法的相同屬和種的野生型相比，生物、組織、細(xì)胞或者細(xì)胞隔室中蛋白質(zhì)的總活性 的增加。所述增加達(dá)到至少10%，優(yōu)選至少20%或至少50%，尤其優(yōu)選至少70%或90%， 非常特別優(yōu)選至少100%，最優(yōu)選至少200%或以上。在該上下文中，與當(dāng)增加SEQ ID NO :2或4中所示Rpi_blb2蛋白質(zhì)之一所得值 相比，病原體抗性的功效可以向下或者向上偏離。優(yōu)選的功能等價(jià)物為其中病原體抗性功 效(例如，通過(guò)病原體的穿透功效或者如本文描述的測(cè)量)與通過(guò)減去如SEQ ID N0:2或 4中所示Rpi_blb2蛋白質(zhì)所得的比較值相差不超過(guò)50%，優(yōu)選不超過(guò)25%，尤其優(yōu)選不超 過(guò)10%的功能等價(jià)物。特別優(yōu)選的是那些序列，其中基于減去如SEQ ID NO :2或4中所示 Rpi-blb2蛋白質(zhì)之一所得的比較值，所述增加將病原體抗性的功效定量增加50%以上，優(yōu) 選100 %，尤其優(yōu)選500 %，非常特別優(yōu)選1000 %。優(yōu)選在類似條件下進(jìn)行比較?！邦愃茥l件”指所有條件，如培養(yǎng)或生長(zhǎng)條件、測(cè)定條 件(如緩沖液、溫度、底物、病原體濃度等等)在待比較的實(shí)驗(yàn)間保持相同并且設(shè)置僅在待 比較的Rpi_blb2多肽的序列、它們的生物來(lái)源，如果適宜，和病原體方面不同。當(dāng)選擇病原 體時(shí)，每個(gè)比較需要所選的病原體最相似于其他等價(jià)物，考慮物種專一性。由于增加的Rpi_blb2活性，植物或者其部分的抗性增加了。在優(yōu)選實(shí)施方案中， 本發(fā)明的方法導(dǎo)致與野生型相比，用致病疫霉感染后孢子形成指數(shù)減小至少30 %，更優(yōu)選 減小50 %，甚至更優(yōu)選為70 %，甚至更優(yōu)選大于80 %，最優(yōu)選為85 %和90 %。最優(yōu)選為 95%或以上。因此，本發(fā)明還涉及如上定義的編碼Rpi_blb2蛋白質(zhì)的本發(fā)明的所述多核苷酸， 其包含核酸分子，所述核酸分子選自a)編碼SEQ ID NO 2或者4中描述的多肽的至少成熟形式的核酸分子；b)核酸分子，其包含如SEQ ID NO 1或3或5或6中描繪的編碼序列編碼所述多 肽的至少成熟形式；c)核酸分子，其核苷酸序列由(a)或者(b)的核苷酸序列的遺傳密碼簡(jiǎn)并產(chǎn)生；d)核酸分子，其編碼的多肽通過(guò)從(a)到(C)的多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序 列的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的替代、缺失和/或加入從(a)到(c)的多核苷酸編碼的多肽衍生；e)核酸分子，其編碼的多肽的序列與(a)或(b)的核酸分子編碼的多肽的氨基酸 序列具有70%或以上的同一性；f)核酸分子，其包含(a)到(e)任一項(xiàng)的核酸分子編碼的多肽的片段或者具有表位的部分；g)核酸分子，其包含的多核苷酸具有用表3b中所列引物，尤其ARFlF和ARFlR從 核酸文庫(kù)擴(kuò)增的核酸分子的序列；h)核酸分子，其編碼(a)到(g)任一項(xiàng)編碼的多肽的以氨基酸1、30、50、100、 200、300、500 或 1000 開始并以氨基酸 1267、1000、500、300、200、50、30、或 1 結(jié)束的片段；i)包含(a)或(d)任一項(xiàng)的多核苷酸的至少20個(gè)核苷酸的核酸分子；j)核酸分子，其編碼的多肽被針對(duì)(a)到(h)任一項(xiàng)的核酸分子編碼的多肽產(chǎn)生 的單克隆抗體識(shí)別；k)核酸分子，其可以通過(guò)用具有(a)到(j)任一項(xiàng)的核酸分子或者其至少15個(gè)， 優(yōu)選30、60、90或更多個(gè)核苷酸的片段的序列的探針在嚴(yán)格條件下篩選適宜文庫(kù)得到；和1)核酸分子，其互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下與(a)或(k)任一項(xiàng)的核酸分子雜交；或者(a)到(1)任一項(xiàng)的互補(bǔ)鏈；或者編碼Solanum bulbocastanum的6號(hào)染色體或連鎖群6的區(qū)段編碼的多肽， 所述區(qū)段與選自表3a或3b的標(biāo)記共分離，并且所述多肽介導(dǎo)對(duì)植物病原體，尤其選自卵菌 門病原體的抗性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明多核苷酸不由Seq. ID NO. :7和/或9中描述的序列組 成和/或不由編碼Seq. ID NO. :8和/或10中描述的蛋白質(zhì)的核酸分子的序列組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸不由Mil. 1或者M(jìn)il. 2的核酸分子的序列 組成和/或不由編碼Mil. 1或者M(jìn)il. 2蛋白質(zhì)的核酸分子組成。從而，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸不由Rossi等人1998，PNAS USA 95 9750-9754，Milligan 等人，1998. Plant Cell 10 1307-1319 ；和 / 或 WO 9806750 中所示的
序列組成。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸來(lái)自或者分離自生物的基因組，所述生物 izfe 自 tfliS Systema Naturae 2000, Brands, S. J, Amsterdam 白勺胃胃禾4" (Menyanthaceae)、 爺禾斗、厚殼樹禾斗(Sclerophylacaceae)、核果爺禾斗(Duckeodendraceae)Goetzeaceae> 旋 花禾斗(Convolvulaceae)、寬絲子禾斗(Cuscutaceae)、花惹禾斗(Polemoniaceae)禾口田基麻 科(Hydrophyllaceae)構(gòu)成的組或者具有其來(lái)源，更優(yōu)選選自由根據(jù)Systema Naturae 2000, Brands, S. J, Amsterdam ^IjS^nM (Atropa) > Browal 1 ia> #^fiJM (Brunfelsia) > 辣椒屬(Capsicum)、夜香樹屬(Cestrum)、Cyphomandra> 曼陀羅屬(Datura)、Fabiana> Frariciscea、天仙子屬(Hyoscyamus)、枸杞屬(Lycium)、爺參屬(Mandragora)、假 酸漿屬(Nicandra)、煙草屬(Nicotiana)、碧冬茄屬(Petunia)、酸漿屬(Physalis)、 Schizanthus和茄屬(Solanum)構(gòu)成的組或者具有其來(lái)源，甚至更優(yōu)選地選擇茄科，優(yōu) 選 S. bulbocastanum、馬鈴薯(S. tuberosum)、番爺(S. Iycopersicum)、矮牽牛、樹番爺 (S. betaceum) >pearmelon (S. muricatum)禾口爺子(S. melongena)。甚至更優(yōu)選地，將番爺或 者馬鈴薯或者S. bulbocastanum作為本發(fā)明多核苷酸來(lái)源。最優(yōu)選地，將S. bulbocastanum 作為來(lái)源。已經(jīng)從來(lái)自ABPT的馬鈴薯材料分離Rpi_blb2。從而，從分類學(xué)觀點(diǎn)，所描述的 Rpi-blb2也是馬鈴薯來(lái)源的。然而，所述基因存在于可能來(lái)自S. bulbocastanum的漸滲片 段上。許多馬鈴薯變種含有相關(guān)茄屬的漸滲片段，但是仍然是馬鈴薯。因此，根據(jù)分類學(xué)系統(tǒng)，馬鈴薯也可以是本發(fā)明的多核苷酸的來(lái)源，尤其ABPT來(lái)源的馬鈴薯，以及以類似方式 衍生的其他茄屬變種的其他變種。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸來(lái)自馬鈴薯。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)和本文提供的序列信息可以分離本發(fā)明的多核苷酸，例 如，具有Seq ID NO 1或3或5或6的核苷酸序列或者其部分的核酸分子。例如，使用本發(fā) 明多核苷酸的序列之一的所有或者部分作為雜交探針和標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)(例如，Sambrook等 人,Molecular Cloning :ALaboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY, 1989 中描述)可以從文 庫(kù)分離Rpi-blb2cDNA。此外，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)，使用基于該序列(例如，包含本發(fā)明的多 核苷酸序列之一的所有或部分的核酸分子)設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物可以分離包含本發(fā)明的 多核苷酸序列之一的所有或部分的多核苷酸。例如，可以從例如，S.bulbocastanum或者另 一種植物分離 mRNA(例如，通過(guò) Chirgwin 等人(1979)Biochemistry 18 :5294_5299 的硫 氰酸胍提取方法)，并且使用逆轉(zhuǎn)錄酶(例如，Moloney MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，可以從Gibco/BRL， Bethesda, MD 得到，或者 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶，可以從 SeikagakuAmerica，Inc.，St. Petersburg, FL得到)可以制備cDNA?；赟EQ ID No :1或3或5或6中所示核苷酸序列之一可以設(shè) 計(jì)用于聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的合成的寡核苷酸引物。使用cDNA，備選地，使用基因組DNA作為 模板和適宜的寡核苷酸引物，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)可以擴(kuò)增本發(fā)明的多核苷酸?？梢詫?如此擴(kuò)增的多核苷酸克隆到適宜的載體中并通過(guò)DNA序列分析鑒定。此外，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)合成 技術(shù)，例如，使用自動(dòng)化DNA合成儀可以制備相應(yīng)于Rpi_blb2核苷酸的寡核苷酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，由Solanum bulbocastanum或者馬鈴薯的6號(hào)染色 體或者連鎖群6的區(qū)段編碼Rpi-blb2蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明包含Solanum bulbocastanum或者馬鈴薯的6號(hào)染色體或者連鎖群 6的區(qū)段。在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所表達(dá)的Rpi_blb2蛋白質(zhì)由多核苷酸編 碼，其包含S. bulbocastanum的6號(hào)染色體或者連鎖群6的區(qū)段。優(yōu)選地，所述區(qū)段還包含 順式作用元件，例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、結(jié)合位點(diǎn)等等，或者反式作用元件，像輔因子、激活劑 或者其他抗性蛋白質(zhì)，其賦予增加的抗性。在Seq. ID NO. :5和6中描繪了包含Rpi_blb2 基因和其他調(diào)節(jié)元件的基因組片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知怎樣得到染色體區(qū)段，例如，通過(guò)將染色體片段克隆到BAC， 如Song，2003，. PNAS 100 (16)，9128或者本文和所引用的參考文獻(xiàn)中描述。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸或者編碼Rpi_blb2蛋白質(zhì)的多核苷 酸與選自表3a的標(biāo)記共分離或者包含所述標(biāo)記的復(fù)制位點(diǎn)或雜交位點(diǎn)。如實(shí)施例中詳細(xì) 描述的，用表3a或者3b中描繪的標(biāo)記可以對(duì)致病疫霉抗性作圖。由于標(biāo)記距離基因越近， 品系，即子代克隆中所述基因與所述標(biāo)記共分離的百分?jǐn)?shù)越高。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中， 本發(fā)明的多核苷酸與標(biāo)記E40M58、CTl 19和/或CT216共分離。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制備重組載體的方法，其包括將本發(fā)明的多核苷 酸插入到載體中或者將所述多核苷酸和另一抗性蛋白質(zhì)插入到載體中。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的多核苷酸或者所述多核苷酸 和通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的另一抗性基因的載體。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“載體”指能夠運(yùn)輸其所連接的多核苷酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)?！保渲腑h(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，其中可以連接額外的DNA區(qū)段。另一種類型的載 體是病毒載體，其中可用將額外的DNA或者RNA區(qū)段連接到病毒基因組中。某些載體(例 如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)能夠在它們所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞 中自主復(fù)制。其他載體(例如，非附加型哺乳動(dòng)物載體)當(dāng)引入宿主細(xì)胞中時(shí)整合到宿主 細(xì)胞的基因組，從而隨著宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)它們有效連接的基 因的表達(dá)。此類載體在本文中稱作“表達(dá)載體”。通常，重組DNA技術(shù)所用的表達(dá)載體通常 是質(zhì)粒形式的。在本說(shuō)明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是載體的最常用 的形式。然而，本發(fā)明意在包括其他形式的表達(dá)載體，如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄 病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，它們起等價(jià)功能。本發(fā)明還涉及通常用于基因工程的粘粒、病毒、噬菌粒和其他載體，它們含有 根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可以用于構(gòu)建多種質(zhì)粒和載體; 見，例如，Sambrook, Molecular Cloning A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N. Y.禾口 Ausube1, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates andffiley Interscience,N. Y. (1989)中描述的技術(shù)。備選地,可 以將本發(fā)明的核酸分子和載體重構(gòu)到脂質(zhì)體中用以遞送到靶細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體或者本發(fā)明的方法的特征在于編碼Rpi_blb2 蛋白質(zhì)的多核苷酸或者另一抗性蛋白質(zhì)有效連接表達(dá)控制序列和/或連接編碼轉(zhuǎn)基因表 達(dá)調(diào)節(jié)信號(hào)的核酸序列，所述調(diào)節(jié)信號(hào)允許在原核或者真核宿主細(xì)胞中表達(dá)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的載體或者本發(fā)明的方法，其中編碼 Rpi-blb2蛋白質(zhì)和/或另一抗性蛋白質(zhì)的多核苷酸有效連接與所述編碼Rpi_blb2蛋白質(zhì) 和/或另一抗性蛋白質(zhì)的多核苷酸具有相同物種來(lái)源的表達(dá)控制序列。對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的核酸分子在細(xì)胞中表達(dá)的情況，原則上可能如此修飾編碼序列 使得蛋白質(zhì)位于植物細(xì)胞的任意希望的隔室中。這些隔室包括細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡、線粒 體、質(zhì)體樣造粉體、葉綠體、色質(zhì)體、質(zhì)外體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外空間、油體、過(guò)氧化物酶體和植 物細(xì)胞的其他隔室(綜述見，Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15，4 (1996)，285-423 和其中 引用的參考文獻(xiàn))。然后多核苷酸可以有效融合適宜的多核苷酸(例如，載體)，其編碼用 于轉(zhuǎn)運(yùn)到所希望的隔室的信號(hào)。本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案涉及載體，其中本發(fā)明的多核苷酸有效連接表達(dá)控制 序列，其允許在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)。此類控制序列的性質(zhì)取決于宿主生物而不同。 在原核生物中，控制序列通常包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和終止子。在真核生物中，一般 的控制序列包括啟動(dòng)子、終止子和在一些情況中，包括增強(qiáng)子、反式作用子或者轉(zhuǎn)錄因子。術(shù)語(yǔ)“控制序列”意在至少包括表達(dá)必需的組分，并且可以還包括額外的有益組 分。術(shù)語(yǔ)“有效連接”指并列，其中所描述的組分處于允許它們以它們的所希望的方式 發(fā)揮功能的關(guān)系中?！坝行нB接”編碼序列的控制序列以如此方式連接使得在與控制序列相 容的條件下實(shí)現(xiàn)編碼序列的表達(dá)。對(duì)于控制序列是啟動(dòng)子的情況，對(duì)于技術(shù)人員顯然的是 使用雙鏈核酸。有效連接將理解為指例如，啟動(dòng)子與待表達(dá)的核酸序列和如果適宜，其他調(diào)節(jié)元 件，如終止子以如此方式順序排列使得當(dāng)核酸序列重組表達(dá)時(shí)，每個(gè)調(diào)節(jié)元件都可以實(shí)現(xiàn)其功能，這取決于核酸序列關(guān)于有義或者反義RNA的排列。為此，不一定需要化學(xué)意義上的 直接鍵合。遺傳控制序列，如增強(qiáng)子序列在距離他DNA分子遙遠(yuǎn)的位置上也可以對(duì)靶序列 發(fā)揮它們的功能。優(yōu)選排列為其中待重組表達(dá)的核酸序列位于作為啟動(dòng)子的序列之后，從 而兩個(gè)序列相互共價(jià)連接。啟動(dòng)子序列和待重組表達(dá)的核酸序列之間的距離優(yōu)選小于200 個(gè)堿基對(duì)，特別優(yōu)選小于100個(gè)堿基對(duì)，非常特別優(yōu)選小于50個(gè)堿基對(duì)。通過(guò)例如在 Maniatis T, Fritsch EF 禾口 Sambrook J(1989)MolecularCloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor(NY),Silhavy TJ, Berman ML 禾口 Enquist Lff(1984)Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor (NY), Ausubel FM等人(1987) Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience 禾口 Gelvin 等 人(1990)Plant Molecular Biology Manual中描述的常規(guī)重組和克隆技術(shù)可以產(chǎn)生有效 連接和表達(dá)盒。然而，作為具有限制酶的特異切割位點(diǎn)的接頭，或者作為信號(hào)肽的其他序列 也可以位于兩個(gè)序列之間。序列的插入也可以導(dǎo)致融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。優(yōu)選地，由啟動(dòng)子 和待表達(dá)的核酸序列連接組成的表達(dá)盒可以以載體整合的形式存在并且可以例如通過(guò)轉(zhuǎn) 化插入到植物基因組中。此類調(diào)節(jié)序列描述于例如，Goeddel :Gene Expression Technology :Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)或參見Gruber禾口Crosby, :Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology,CRC Press,Boca Raton,Florida,編者 Glick和Thomson，第7章，89-108，包括其中的參考文獻(xiàn)。調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)核苷酸序列在 許多類型宿主細(xì)胞中表達(dá)的那些序列和指導(dǎo)核苷酸序列僅在某些宿主細(xì)胞或者在某些條 件下表達(dá)的那些序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以取決于諸如待轉(zhuǎn)化的宿 主細(xì)胞的選擇、所希望的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等因素?？梢詫⒈景l(fā)明的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì) 胞，從而產(chǎn)生本文描述的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)或肽，包括融合蛋白質(zhì)或者肽。可以設(shè)計(jì)本發(fā)明的重組表達(dá)載體用于所述抗性蛋白質(zhì)，優(yōu)選Rpi_blb2在原核或 真核細(xì)胞中的表達(dá)。例如，編碼本發(fā)明的多核苷酸的基因可以在細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌 (E. coli)、百合棒桿菌(C. glutamicum)、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens))、昆 蟲細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母和其他真菌細(xì)胞(見Romanos，(1992)，Yeast 8 423-488 ；van den Hondel, (1991) J. W. Bennet&L. L. Lasure，編者，396-428 頁(yè)Academic Press :San Diego ；禾口 van den Hondel, (1991) :Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy,編者，1-28 頁(yè)，Cambridge University Press :Cambridge))、藻類(Falciatore 等人，1999，Marine Biotechnology. 1,3 :239_251)和多細(xì)胞植物細(xì)胞(見 Schmidt, R. (1988), Plant Cell Rep. :583_586) ；Plant Molecular Biology andBiotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, 6/7 $， S. 71-119(1993) ；F. F. White, B. Jenes 等 人，Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, 卷 1，Engineering and Utilization,編 # :Kung 禾口 R. Wu, Academic Press (1993)，128-43 ；Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991)，205-225 (和其中引用的參考文獻(xiàn))或者哺 乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。適宜的宿主細(xì)胞在Goeddel，Gene Expression Technology =Methods inEnzymology 185，Academic Press, San Diego, CA (1990)中進(jìn)一步討論。備選地，可以在 體外轉(zhuǎn)錄和翻譯重組表達(dá)載體，例如，使用T7啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶。
通常用載體實(shí)施蛋白質(zhì)在原核生物中的表達(dá)，所述載體含有指導(dǎo)融合或者非融合 蛋白質(zhì)表達(dá)的組成型或者可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。融合載體向其中編碼的蛋白質(zhì)加入許多氨基 酸，通常加在重組蛋白質(zhì)的氨基末端，但是也加在C-末端或者與所述蛋白質(zhì)的適宜區(qū)域融 合。此類融合載體通常起三種目的1)增加重組蛋白質(zhì)的表達(dá)；2)增加重組蛋白質(zhì)的溶解 性；和3)通過(guò)作為親和純化中的配體幫助純化重組蛋白質(zhì)。此外，融合載體可以還編碼額 外的蛋白質(zhì)，其表達(dá)支持Rpi_blb2活性的增加或者針對(duì)植物病原體的植物抗性的增加，例 如，所述額外的蛋白質(zhì)為其他抗性蛋白質(zhì)。通常，在融合表達(dá)載體中，在融合部分和重組蛋 白質(zhì)的接點(diǎn)引入蛋白酶剪切位點(diǎn)以便使得可以在純化融合蛋白質(zhì)后分離重組蛋白質(zhì)與所 述融合部分。此類酶和它們的同族識(shí)別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達(dá)載體包括pGEX (Pharmacia Biotech Inc ；Smith, D. B. and Johnson, K. S. (1988)Gene 67 :31_40)、pMAL(New England Biolabs, Beverly, MA)禾口 pRIT5(Pharmacia, Piscataway, NJ)。適宜的可誘導(dǎo)的非融合大腸桿菌表達(dá)載體的實(shí)例包括pTrc (Amann (1988) Gene 69 :301_315)禾口 pETlId (Studier 等人’ Gene ExpressionTechnology :Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, C alifornia(1990)60-89。最大化重組蛋白質(zhì)表達(dá)的一種策略是在蛋白酶剪切所述重組蛋白質(zhì)的能力受損 的宿主細(xì)菌中表達(dá)所述蛋白質(zhì)(Gottesman, S, Gene ExpressionTechnology :Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego，California(1990) 119—128)。另一種策略是 改變待插入到表達(dá)載體中的核酸的核酸序列從而每個(gè)氨基酸的各個(gè)密碼子是選擇用于表 達(dá)的細(xì)菌(如大腸桿菌或者百合棒桿菌)中優(yōu)先使用的密碼子(Wada等人(1992) Nucleic AcidsRes. 20 :2111_2118)?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)實(shí)施本發(fā)明的核酸序列的此類改 變。此外，載體可以是酵母表達(dá)載體。用于在酵母釀酒酵母(S. cerivisae)中表達(dá) 的載體的實(shí)例包括 pY印Secl (Baldari，等人，(1987) Embo J. 6 :229_234)、pMFa (Kurjan 和 Herskowitz, (1982)Cell 30 :933_943)、pJRY88 (Schultz 等人，(1987)Gene 54:113-123) 禾口 pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, CA)。優(yōu)選地，本發(fā)明或者本文描述的多核苷酸有效連接植物表達(dá)控制序列，例如表達(dá) 盒。植物表達(dá)盒優(yōu)選含有能夠驅(qū)動(dòng)植物細(xì)胞中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序列，并且所述調(diào)節(jié)序列有 效連接從而每個(gè)序列都可以完成其功能，如轉(zhuǎn)錄終止，如多腺苷酸化信號(hào)。優(yōu)選的多腺苷酸 化信號(hào)為來(lái)自根癌農(nóng)桿菌t-DNA的多腺苷酸化信號(hào)，如已知為Ti質(zhì)粒pTiACH5的章魚堿合 酶的基因3 (Gielen等人，EMBO J. 3 (1984)，835ff)或者其功能等價(jià)物，在植物中具有功能 活性的所有其他終止子也是適宜的。植物基因表達(dá)通常不限于轉(zhuǎn)錄水平，因?yàn)橹参锉磉_(dá)盒優(yōu)選含有其他有效連接的序 列，像翻譯增強(qiáng)子，如含有來(lái)自煙草花葉病毒的5’ -未翻譯的前導(dǎo)序列的超驅(qū)動(dòng)序列，其增 強(qiáng)蛋白質(zhì)/RNA 比率(Gallie 等人，1987，Nucl. Acids Research 15:8693-8711)。因此，本文描述的多核苷酸可以有效連接適宜的啟動(dòng)子，其賦予適時(shí)、細(xì) 胞或組織特異的方式的基因表達(dá)。優(yōu)選為驅(qū)動(dòng)組成型表達(dá)的啟動(dòng)子(Benfey等 人，EMBO J. 8(1989)2195-2202)，像來(lái)自植物病毒如 35S CAMV(Franck 等人，Cell 21 (1980) 285-294)、19S CaMV (s 也見 US5352605 和 W08402913)的啟動(dòng)子，或者植物啟動(dòng)子，像US 4962028中描述的來(lái)自Rubisco小亞基的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“植物特異啟動(dòng)子”理解為指原則上能夠控制基因，尤其外來(lái)基因在植物、或 植物部分、植物細(xì)胞、植物組織或者植物培養(yǎng)物中表達(dá)的啟動(dòng)子。在該上下文中，表達(dá)可以 為例如，組成型的、可誘導(dǎo)的或者依賴發(fā)育的。優(yōu)選下面的啟動(dòng)子a)組成型啟動(dòng)子優(yōu)選的載體為使得可以在植物中組成型表達(dá)的那些載體(Benfey等人(1989) EMBO J 8:2195-2202)?！敖M成型”啟動(dòng)子理解為指在植物發(fā)育的重要時(shí)期內(nèi)，優(yōu)選植物 發(fā)育的所有階段，確保在許多，優(yōu)選所有組織中表達(dá)的那些啟動(dòng)子。具體地，優(yōu)選使用植 物啟動(dòng)子或者來(lái)自植物病毒的啟動(dòng)子。尤其優(yōu)選CaMV花椰菜花葉病毒35S轉(zhuǎn)錄物的啟 動(dòng)子(Franck 等人(1980)Cell 21:285_294 ；Odell 等人(1985)Nature 313 :810_812 ； Shewmaker 等人(1985) Virology 140 :281_288 ;Gardner 等人(1986)Plant Mol Biol6 221-228)或者 19S CaMV 啟動(dòng)子(US 5，352，605 ；WO 84/02913 ；Benfey 等人(1989) EMBO J 8:2195-2202)。另一適宜的組成型啟動(dòng)子是“Rubisco小亞基(SSU) ”啟動(dòng)子(US 4，962，028)、豆球蛋白B啟動(dòng)子(GenBank檢索號(hào)X03677)、農(nóng)桿菌胭脂氨酸合成酶啟動(dòng)子、 TR二元啟動(dòng)子、農(nóng)桿菌OCS(章魚堿合成酶)啟動(dòng)子、泛蛋白啟動(dòng)子(Holtorf S等人(1995) Plant Mol Biol 29 :637_649)、泛蛋白 1 啟動(dòng)子(Christensen等人(1992)Plant Mol Biol 18:675-689 ；Bruce等人(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86 :9692_9696)、Smas啟動(dòng)子、肉 桂醇脫氫酶啟動(dòng)子(US 5，683，439)、液泡ATP酶亞基的啟動(dòng)子或者來(lái)自小麥的富含脯氨酸 蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子(W0 91/13991)，和基因的其他啟動(dòng)子，其中所述基因在植物中的組成型表 達(dá)是技術(shù)人員已知的。b)組織特異性啟動(dòng)子還優(yōu)選對(duì)花藥、子房、花、葉、莖干、根和種子具有特異性的啟動(dòng)子。種子特異啟動(dòng)子例如，菜豆蛋白啟動(dòng)子(US5，504, 200 ；Bustos MM 等人(1989)PlantCell 1(9) :839-53)、2S 白蛋白基因啟動(dòng)子(Joseffson LG 等人(1987) J BiolChem 262 12196-12201)、豆球蛋白啟動(dòng)子(ShirsatA 等人(1989)Mol GenGenet 215(2) :326_331)、 USP(未知的種子蛋白質(zhì))啟動(dòng)子(Baumlein H等人(1991)Mol Gen Genet 225(3) 459-67)、油菜籽蛋白基因啟動(dòng)子(US5, 608，152 ;Stalberg K 等人(1996)L Planta 199 515-519)、蔗糖結(jié)合蛋白質(zhì)啟動(dòng)子(W0 00/26388)或者豆球蛋白B4啟動(dòng)子(LeB4 ； Baumlein H 等人(1991)Mol Gen Genet 225 :121_128 ;Baeumlein 等人(1992)Plant Journal 2(2) 233-9 ；Fiedler U 等人(1995) Biotechnology (NY) 13 (10) :1090f)、擬南芥 油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子(W0 98/45461)、蕓苔(Brassica)Bce4啟動(dòng)子0^091/13980)。其他適宜的 種子特異啟動(dòng)子為編碼高分子量麥谷蛋白(HMWG)、麥醇溶蛋白、分枝酶、ADP葡萄糖焦磷酸 酶(AGPase)或者淀粉合酶的基因的啟動(dòng)子。還優(yōu)選允許在單子葉植物如玉米、大麥、小麥、 黑麥、稻等中種子特異表達(dá)的啟動(dòng)子?？梢杂欣厥褂孟旅娴腎pt2或者Iptl基因的啟動(dòng) 子(W095/15389、W0 95/23230)或者WO 99/16890中描述的啟動(dòng)子(大麥醇溶蛋白基因、谷 蛋白基因、水稻素基因、醇溶蛋白基因、麥醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、 kasirin基因或者裸麥醇溶蛋白基因的啟動(dòng)子)。
塊莖_、貯藏根_、或者根_特異啟動(dòng)子，如I類patatin啟動(dòng)子(B33)、馬鈴薯組織 蛋白酶D抑制劑啟動(dòng)子。葉特異啟動(dòng)子如馬鈴薯胞質(zhì)溶膠FBPase啟動(dòng)子(W097/05900)、馬鈴薯的Rubisco (核酮糖-1， 5_ 二磷酸羧化酶)SSU (小亞基)啟動(dòng)子或者ST-LSI啟動(dòng)子(Stockhaus等人(1989) EMBO J 8:2445-2451)。非常特別優(yōu)選的是表皮特異啟動(dòng)子，如OXLP基因(草酸氧化酶樣蛋白質(zhì)) 啟動(dòng)子(Wei 等人(1998)Plant Mol. Biol. 36 :101_112)?；ㄌ禺悊?dòng)子例如，八氫番茄紅素合酶啟動(dòng)子(W0 92/16635)或者P_rr基因的啟動(dòng)子(W0 98/22593)?；ㄋ幪禺悊?dòng)子如5126 啟動(dòng)子(US 5，689，049,US 5，689，051)、glob_I 啟動(dòng)子和 Y -玉米醇溶蛋
白啟動(dòng)子。c)化學(xué)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子表達(dá)盒還可以包含化學(xué)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(綜述文章Gatz等人(1997) Armu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48 :89_108)，通過(guò)所述啟動(dòng)子可以控制植物中的外源基因 在特定時(shí)間點(diǎn)表達(dá)。同樣可以使用諸如，PRPl啟動(dòng)子(Ward等人(1993)Plant Mol Biol 22 :361-366)、水楊酸可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(W0 95/19443)、苯磺酰胺可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(EP O 388 186)、四環(huán)素可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(Gatz等人(1992) Plant J 2 :397_404)、脫落酸可誘導(dǎo) 的啟動(dòng)子(EP O 335 528)或者乙醇或者環(huán)己酮可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(W0 93/21334)的啟動(dòng)于。d)脅迫_或者病原體可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子其他優(yōu)選的啟動(dòng)子為通過(guò)有生命或者無(wú)生命的脅迫可以誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如PRPl 基因的病原體可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(Ward等人(1993)Plant MolBiol 22 :361_366)、番茄高溫 可誘導(dǎo)的hsp70或者h(yuǎn)sp80啟動(dòng)子(US 5，187，267)、馬鈴薯低溫可誘導(dǎo)的α -淀粉酶啟動(dòng) 子(W0 96/12814)、光可誘導(dǎo)的PPDK啟動(dòng)子，或者創(chuàng)傷可誘導(dǎo)的pinll啟動(dòng)子(ΕΡ375091)。病原體可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子包括由于病原體感染誘導(dǎo)的基因的啟動(dòng)子，所述基因?yàn)?例如，I3R蛋白質(zhì)、SAR蛋白質(zhì)、β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等的基因(例如，Redolfi等 人(1983)Neth J Plant Pathol 89 245-254 ；Uknes,等人(1992)The Plant Cell 4 645-656 ；Van Loon(1985)Plant Mol Virol 4 :111_116 ;Marineau 等人(1987)Plant Mol Biol 9 335-342 ；Matton ^A (1987)Molecular Plant-Microbe Interactions 2 325-342 ；Somssich ^ 人(1986)ProcNatl Acad Sci USA 83 :2427_2430 ;Somssich 等 人(1988)MolGen Genetics 2 :93_98 ；Chen 等人(1996) Plant J 10 :955_966 ；Zhang 和 Sing(1994)Proc Natl Acad Sci USA91 2507-2511 ；Warner 等人(1993)Plant J 3 191-201 ；Siebertz 等人(1989) Plant Cell 1 :961_968 (1989)。還包括創(chuàng)傷可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如pinll基因的啟動(dòng)子(Ryan (1990) AnnRev Phytopath 28 :425_449 ;Duan 等人(1996) Nat Biotech 14 :494_498)、wunl 和 wun2 基因的 啟動(dòng)子(US 5，428，148)、winl 和 win2 基因的啟動(dòng)子(Stanford 等人(1989)Mol Gen Genet 215 :200-208)、系統(tǒng)素的啟動(dòng)子(McGurl 等人(1992) Science 225 1570-1573)、WIPl 基 因的啟動(dòng)子(Rohmeier 等人(1993)Plant Mol Biol 22 :783_792 ;Eckelkamp 等人(1993)FEBS Letters 323 :73_76)、MPI 基因的啟動(dòng)子(Corderok 等人(1994)ThePlant J 6(2) 141-150)等等。e)發(fā)育依賴性啟動(dòng)子其他適宜的啟動(dòng)子為例如，果實(shí)成熟特異啟動(dòng)子，如番茄果實(shí)成熟特異啟動(dòng)子(W0 94/21794、EP 409 625)。發(fā)育依賴性啟動(dòng)子部分包括組織特異啟動(dòng)子，因?yàn)閭€(gè)體組織本質(zhì) 上以發(fā)育依賴性方式發(fā)育。本發(fā)明的多肽僅在本文提到的病原體感染或者穿透的組織中具有活性或者具有 增加的活性是有利的。特別優(yōu)選組成型啟動(dòng)子和葉和/或莖干_特異的、病原體可誘導(dǎo)和 表皮特異的啟動(dòng)子，最優(yōu)選病原體可誘導(dǎo)的和表皮特異的啟動(dòng)子。還優(yōu)選天然啟動(dòng)子，其例 如包含在Seq. ID NO. 5和6中描繪的基因組片段中。此外，其他啟動(dòng)子可以有效連接待表達(dá)的核酸序列，所述啟動(dòng)子使得可能在其他 植物組織或者其他生物，例如，大腸桿菌細(xì)菌中表達(dá)。適宜的植物啟動(dòng)子原則上為所有上述 啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“遺傳控制序列”在廣義上理解并且指對(duì)根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的實(shí)體化或者 功能具有影響的所有那些序列。例如，遺傳控制序列修飾原核或者真核生物中轉(zhuǎn)錄和翻譯。 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒包含待重組表達(dá)的所述核酸序列的5’上游的對(duì)胚表皮和/或 花具有特異性的啟動(dòng)子，和3’下游終止子序列作為額外的遺傳控制序列和，如果適宜，其他 常規(guī)調(diào)節(jié)元件，在每種情況中，它們都有效連接待重組表達(dá)的核酸序列。遺傳控制序列還包含其他啟動(dòng)子、啟動(dòng)子元件、或者最小啟動(dòng)子，它們都可以修飾 表達(dá)控制性質(zhì)。從而，例如，由于遺傳控制序列，組織特異表達(dá)還可以額外地依賴于某些 應(yīng)激子。已經(jīng)關(guān)于例如，水脅迫、脫落酸(LamE和Chua NH, J Biol Chem 1991 ；266 (26) 17131-17135)和熱脅迫(SchofflF 等人，Molecular & General Genetics 217(2-3) 246-53,1989)描述了此類元件。其他有利的控制序列為例如，革蘭氏陽(yáng)性啟動(dòng)子amy和SP02，酵母或者真菌啟動(dòng) 子 ADCl、MFa, AC、P-60、CYCl、GAPDH、TEF、rp28、ADH。原則上，它們的調(diào)節(jié)序列像上述調(diào)節(jié)序列的所有天然啟動(dòng)子都可以用于根據(jù)本發(fā) 明的方法。此外，也可以有利地使用合成啟動(dòng)子。遺傳控制序列還包括基因的5’非翻譯區(qū)、內(nèi)含子和非編碼3’區(qū)，如肌動(dòng)蛋白-1內(nèi) 含子或者Adhl-S內(nèi)含子1、2和6(—般參考The MaizeHandbook，第116章，F(xiàn)reeling和 Walbot，編著，Springer, New York(1994))。已經(jīng)闡明它們?cè)诨虮磉_(dá)的調(diào)節(jié)中起重要作 用。從而，已經(jīng)闡明5’非翻譯序列可以增強(qiáng)異源基因的瞬時(shí)表達(dá)?？梢蕴峒暗姆g增強(qiáng)子 的實(shí)例為煙草花葉病毒5，前導(dǎo)序列(Gallie等人(1987)Nucl Acids Res 15:8693-8711) 等等。此外，它們可以促進(jìn)組織特異性(Rouster J等人(1998)Plant J 15:435-440)。表達(dá)盒可以有利地包含一個(gè)或多個(gè)所稱作的增強(qiáng)子序列，其有效連接啟動(dòng)子，使 得核酸序列的增強(qiáng)的重組表達(dá)成為可能。額外有利的序列，如其他調(diào)節(jié)序列或者終止子也 可以插入待重組表達(dá)的核酸序列的3’末端?；驑?gòu)建體中可以存在待重組表達(dá)的核酸序 列的一個(gè)或多個(gè)拷貝。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用Seq ID No. :5和/或6中描繪的基因組片段中包含的天 然終止子序列。
適宜作為控制序列的多腺苷酸化信號(hào)為植物多腺苷酸化信號(hào)，優(yōu)選基本上相應(yīng)于 來(lái)自根癌農(nóng)桿菌的T-DNA多腺苷酸化信號(hào)的多腺苷酸化信號(hào)，尤其Ti質(zhì)粒pTiACHS (Gielen 等人(1984)EMB0 J3 :835et seq.)的T-DNA(章魚堿合酶)3’的基因或者其功能等價(jià)物。 特別適宜的終止子序列的實(shí)例是OCS(章魚堿)終止子和NOS(胭脂堿合酶)終止子?？刂菩蛄羞€進(jìn)一步被理解為使得可以同源重組或者插入到宿主生物的基因組或 者允許從基因組除去的控制序列。對(duì)于同源重組，例如，具體基因的天然啟動(dòng)子可以與對(duì)胚 表皮和/或花具有特異性的啟動(dòng)子交換。諸如cre/lox技術(shù)的方法允許組織特異性，如果 適宜可誘導(dǎo)地從宿主生物的基因組除去表達(dá)盒(Sauer B (1998)Methods. 14(4) :381_92)。 在該方法中，特定側(cè)翼序列(Iox序列)附著到靶基因，所述側(cè)翼序列以后允許通過(guò)ere重 組酶除去。表達(dá)盒和從其衍生的載體可以包含其他功能元件。術(shù)語(yǔ)功能元件將在廣義上理解 并且指對(duì)根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒、載體或者轉(zhuǎn)基因生物的產(chǎn)生、擴(kuò)增或功能具有影響的所有 那些元件。作為實(shí)例但不作為限制，可以提及下面的a)選擇標(biāo)記，其賦予對(duì)代謝抑制劑，諸如2-脫氧葡萄糖_6_磷酸(W098/45456)、 抗生素或者殺生物劑，優(yōu)選除草劑，如卡那霉素、G418、博來(lái)霉素或者潮霉素，或者膦絲菌素 等等的抗性。特別優(yōu)選的選擇標(biāo)記是賦予除草劑抗性的那些選擇標(biāo)記?？梢蕴峒暗膶?shí)例 為編碼膦絲菌素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(PAT)和失活谷氨酰胺合酶抑制劑(bar和pat基因)的 DNA序列；5-烯醇-丙酮酸基莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSN合酶基因)，其賦予對(duì)草苷膦 (N-(膦?；谆?甘氨酸)的抗性；gox基因，其編碼草苷膦降解酶(草苷膦氧化還原酶)； deh基因(編碼失活茅草枯的脫鹵素酶)；失活磺酰脲和咪唑啉酮的乳酸乙酰合酶；和bxn 基因，其編碼降解溴草腈的腈水解酶；aasa基因，其賦予對(duì)抗生素apectinomycin的抗性； 鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(SPT)基因，其允許對(duì)鏈霉素的抗性；新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因， 其賦予對(duì)卡那霉素或者geneticidin的抗性；潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)基因，其介導(dǎo)對(duì)潮霉 素的抗性；乙酰乳酸合酶基因(ALS)，其賦予對(duì)磺酰脲除草劑的抗性(例如，具有S4和/或 Hra突變的突變ALS變體)。b)報(bào)道基因，其編碼容易定量的蛋白質(zhì)和，通過(guò)它們的顏色或者酶活性，使得可能 評(píng)估轉(zhuǎn)化功效、表達(dá)部位或者表達(dá)時(shí)間。在該上下文中非常特別優(yōu)選的是編碼報(bào)道蛋白的 基因(Schenborn E,Groskreutz D. MolBio-technol. 1999 ；13(1) 29-44)，所述報(bào)道蛋白為 例如，綠色熒光蛋白(GFP) (Sheen 等人(I995)Plant Journal 8(5) :777_784 ;Haseloff■等 A (1997)Proc Natl Acad Sci USA 94(6) :2122_2127 ；Reichel 等人(1996)Proc NatlAcad Sci USA 93(12) :5888_5893 ；Tian等人(1997)Plant Cell Rep 16 :267_271 ；WO 97/41228 ； Chui WL等人(1996) Curr Biol 6 325-330 ；Leffel SM等人(1997) Biotechniques. 23 (5) 912-8)、氯霉素轉(zhuǎn)移酶、螢光素酶(Ow等人(1986) Science 234 :856_859 ；Millar等人 (1992)Plant Mol Biol Rep 10 :324_414)，和水母發(fā)光蛋白基因(Prasher 等人(1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3) 1259-1268), β -半乳糖苷酶 R 基因座基因(其編 碼調(diào)節(jié)植物組織中產(chǎn)生花色素苷色素(紅色)的蛋白質(zhì)從而使得可以直接分析啟動(dòng)子活 性而不加入額外的輔助物質(zhì)或者顯色底物；Dellaporta等人Chromosome Structure and Function Impact of NewConcepts,18th Stadler Genetics Symposium,11 :263_282, 1988)，特別優(yōu)選 β -葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson 等人，EMBO J. 1987，6，3901-3907)。
c)復(fù)制起點(diǎn)，其確保根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒或者載體在例如大腸桿菌中的擴(kuò)增。所 提及的實(shí)例為 ORI (DNA 復(fù)制起點(diǎn))、pBR322ori 或者 P15A ori (Sambrook 等人=Molecular Cloning. A Laboratory Manual,第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)。d)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化必需的元件，如T-DNA或者vir區(qū)的右邊界或者左邊界。為了選擇成功經(jīng)歷同源重組的細(xì)胞，或者選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，通常必須還導(dǎo)入選 擇標(biāo)記，其賦予已經(jīng)成功經(jīng)歷重組的細(xì)胞對(duì)殺生物劑(例如，除草劑)、代謝抑制劑(如 2_脫氧葡萄糖-6-磷酸(W0 98/45456))或者抗生素的抗性。選擇標(biāo)記允許從未轉(zhuǎn)化的細(xì) 胞選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(McCormick 等人(1986)Plant Cell Reports 5:81-84)?？梢杂欣厥褂冒磉_(dá)盒的載體實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒向生物或者其細(xì)胞、 組織、器官、部分或者種子的導(dǎo)入(優(yōu)選導(dǎo)入植物或植物細(xì)胞、組織、器官、部分或者種子 中)?？梢酝ㄟ^(guò)適宜的限制性切割位點(diǎn)將表達(dá)盒導(dǎo)入載體(例如，質(zhì)粒)中。首先將所形成 的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中。選擇、生長(zhǎng)正確轉(zhuǎn)化的大腸桿菌并通過(guò)技術(shù)人員熟悉的方法得到 重組質(zhì)粒。限制性分析和測(cè)序可以用于驗(yàn)證克隆步驟。用于在特定植物部分中表達(dá)的其他啟動(dòng)子為例如，來(lái)自油菜籽的油菜籽蛋白 基因啟動(dòng)子、來(lái)自蠶豆(Vicia faba)的USP啟動(dòng)子(Baeumlein等人，Mol Gen Genet, 1991，225 (3) :459_67)、來(lái)自擬南芥的油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子(W09845461)、來(lái)自菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白啟動(dòng)子(US5504200)，來(lái)自蕓苔的Bce4_啟動(dòng)子(W09113980)或者豆 球蛋白 B4 啟動(dòng)子(LeB4 ；Baeumlein 等人，1992，Plant Journal, 2 (2) :233_9)以及在像玉 米、大麥、小麥、黑麥、稻等的單子葉植物中賦予種子特異表達(dá)的啟動(dòng)子。所提及的適宜啟動(dòng) 子為來(lái)自大麥的Ipt2或者Iptl基因啟動(dòng)子(W09515389和W09523230)或者在W09916890 中描繪的那些啟動(dòng)子(來(lái)自大麥醇溶蛋白基因、稻谷蛋白基因、稻水稻素基因、稻醇溶蛋白 基因、小麥醇溶蛋白基因、小麥谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麥谷蛋白基因、高 梁kasirin基因、黑麥黑麥醇溶蛋白基因的啟動(dòng)子)。此外，可以將本發(fā)明的多核苷酸以反義方向克隆到表達(dá)載體中。即，DNA分子有效 連接調(diào)節(jié)序列，所述連接的方式允許表達(dá)(通過(guò)DNA分子的轉(zhuǎn)錄)本發(fā)明的多核苷酸編碼 的mRNA反義的RNA分子。可以選擇有效連接以反義方向克隆的核酸的調(diào)節(jié)序列，其指導(dǎo)所 述反義RNA分子在多種細(xì)胞類型中連續(xù)表達(dá)，例如，可以選擇指導(dǎo)反義RNA的組成型、組織 特異的或者細(xì)胞類型特異表達(dá)的病毒啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，或調(diào)節(jié)序列。反義表達(dá)載體可 以為重組質(zhì)粒、噬菌?；蛘邷p毒病毒的形式，其中所產(chǎn)生的反義核酸分子處于高效率調(diào)節(jié) 區(qū)的控制下，所述調(diào)節(jié)區(qū)的活性可以通過(guò)確定載體所導(dǎo)入的細(xì)胞類型確定。關(guān)于使用反義 基因調(diào)節(jié)基因表達(dá)的討論，見Weintraub，H.等人，Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1 (1) 1986 禾口 Mol 等人，1990, FEBS Letters268 :427_430。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞的方法，其包括向宿主細(xì)胞導(dǎo) 入本發(fā)明的載體或者多核苷酸或者所述載體或所述多核苷酸和表達(dá)另一種抗性蛋白質(zhì)的 載體?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)向原核或真核細(xì)胞導(dǎo)入載體DNA。本文所用的術(shù)語(yǔ) “轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”、接合和轉(zhuǎn)導(dǎo)意在指多種本領(lǐng)域已知的將外源核酸(例如，DNA)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、天然感受態(tài)、 化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，或者電穿孔。轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞(包括植物細(xì)胞)的適宜的方法可 以參見 Sambrook，等人(Molecular Cloning :A Laboratory Manual.第二片反，ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press， ColdSpring Harbor， NY, 1989)和其他實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，如 Methods in MolecularBiology，1995，卷 44，Agrobacterium protocols，編者Gar land 禾口 Davey，Humana Press，Totowa, New Jersey。為了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，已知取決于所用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅一小部分細(xì) 胞可以將外來(lái)DNA整合到它們的基因組。為了鑒定和選擇這些整合體，通常將選擇性標(biāo)記 (例如，對(duì)抗生素的抗性)隨目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記包括賦予對(duì)藥物 (如G418、潮霉素和氨甲蝶呤)抗性的那些選擇性標(biāo)記或者在植物中為賦予對(duì)除草劑如草 苷膦或草銨膦的抗性的選擇性標(biāo)記。可以將編碼選擇性標(biāo)記的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中與編碼 本發(fā)明多肽相同的載體上或者導(dǎo)入單獨(dú)的載體。用所導(dǎo)入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以通 過(guò)例如，藥物選擇鑒定(例如，具有所摻入的選擇性標(biāo)記基因的細(xì)胞將存活，而其他細(xì)胞死 亡)?？梢援a(chǎn)生其他宿主細(xì)胞，其含有允許所導(dǎo)入的基因的受調(diào)節(jié)的表達(dá)的選擇系統(tǒng)。 例如，將本發(fā)明的多核苷酸包括在載體中處于Iac操縱子控制下允許僅在存在IPTC時(shí)表達(dá) 該多核苷酸。此類調(diào)節(jié)系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的。優(yōu)選地，所導(dǎo)入的核酸分子是宿主細(xì)胞外來(lái)的?！巴鈦?lái)的”指核酸分子關(guān)于宿主細(xì)胞是異源的，這意味著來(lái)自具有不同基因組背景 的細(xì)胞或者生物，或者所述核酸分子關(guān)于宿主細(xì)胞是同源的但是位于不同于所述核酸分子 的天然發(fā)生的對(duì)應(yīng)物的基因組環(huán)境中。這意味著，如果核酸分子關(guān)于所述宿主細(xì)胞是同源 的，其不位于所述宿主細(xì)胞的基因組中的天然位置，尤其它被不同的基因包圍。在該情況 中，核酸分子可以處于其自身啟動(dòng)子控制下或者處于異源啟動(dòng)子控制下。宿主細(xì)胞中存在 的根據(jù)本發(fā)明的載體或者核酸可以整合到宿主細(xì)胞的基因組或者可以以某種形式保持在 染色體外。在該方面，還理解本發(fā)明的核酸分子可以用于通過(guò)同源重組恢復(fù)或者產(chǎn)生突變 基因(Paszkowski (編者)，HomologousRecombination and Gene Silencing in Plants. Kluwer Academic Publishers (1994))。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用本發(fā)明的多核苷酸或者本發(fā)明的載體，或 者用所述載體或所述多核苷酸和用于表達(dá)另一種抗性蛋白質(zhì)的載體或者多核苷酸基因工 程化的宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”在本文中互換使用。將理解此類術(shù)語(yǔ)不僅指 具體受試者細(xì)胞，而且指此類細(xì)胞的后代或者潛在后代。因?yàn)橛捎谀承┩蛔兓蛘攮h(huán)境影響， 在連續(xù)世代中可以發(fā)生某些修飾，所以此類后代可能實(shí)際上不與親代細(xì)胞相同，但是仍然 包括在本文所用的術(shù)語(yǔ)的范圍內(nèi)。例如，可以將本發(fā)明的多核苷酸導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、真菌細(xì)胞或者哺乳動(dòng)物 細(xì)胞(如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或者COS細(xì)胞)、藻類、纖毛蟲、植物細(xì)胞或者真菌中。適 宜的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。優(yōu)選大腸桿菌、桿狀病毒、農(nóng)桿菌或者植物細(xì)胞。此外，還可以轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞從而(過(guò))表達(dá)其他酶和蛋白質(zhì)，所述表達(dá)支持植物對(duì) 病原體抗性的增加。優(yōu)選地，還表達(dá)另一抗性基因，優(yōu)選還表達(dá)一種或多種抗性基因，優(yōu)選本文提及的基因。最優(yōu)選地是Rpi_blb2和Rpi-blb的共表達(dá)。進(jìn)一步優(yōu)選的是本文提及的植物之一，尤其上面提及的茄科植物之一的細(xì)胞，最 優(yōu)選馬鈴薯、番茄、矮牽牛、樹番茄、pear melon或者茄子的細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽，尤其具有Rpi_blb2活性的蛋 白質(zhì)的方法，其包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞并從培養(yǎng)基或細(xì)胞回收所述多核苷酸編碼并且 宿主細(xì)胞表達(dá)的所述多肽。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”指在細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)或者核苷酸序列。然而，所述術(shù)語(yǔ)還包括在無(wú) 細(xì)胞體系中表達(dá)蛋白質(zhì)。它包括從編碼產(chǎn)物的DNA轉(zhuǎn)錄成RNA產(chǎn)物，轉(zhuǎn)錄后修飾和/或翻 譯成蛋白質(zhì)產(chǎn)物或者多肽，以及可能的翻譯后修飾。取決于所用的特定構(gòu)建體和條件，可用從細(xì)胞、培養(yǎng)基或者兩者回收蛋白質(zhì)。對(duì)于 本領(lǐng)域技術(shù)人員，公知不僅可以表達(dá)天然蛋白質(zhì)，而且可以表達(dá)作為融合多肽的蛋白質(zhì)或 者加入指導(dǎo)蛋白質(zhì)到達(dá)宿主細(xì)胞的特定隔室，例如，確保蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基等等的信號(hào) 肽。此外，此類蛋白質(zhì)和其片段可以經(jīng)化學(xué)合成和/或根據(jù)例如下文描述的標(biāo)準(zhǔn)方法修飾。本發(fā)明的宿主細(xì)胞，如培養(yǎng)中的原核或者真核宿主細(xì)胞可以用于產(chǎn)生(即表達(dá)) 本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽，優(yōu)選具有Rpi_blb2活性的多肽。此外，通過(guò)電穿孔或者農(nóng) 桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移通過(guò)直接轉(zhuǎn)移DNA到正發(fā)育的花中也可以應(yīng)用備選方法。因此，本發(fā) 明還提供了使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞產(chǎn)生Rpi-blb2的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包 括在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞從而產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。此外，所述方法包括 從培養(yǎng)基或者宿主細(xì)胞分離和/或回收所述多肽。優(yōu)選通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。例如，將編碼蛋白質(zhì)的核酸分子克隆 到表達(dá)載體(如上述)中，將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞(如上述)并且在該宿主細(xì)胞中表達(dá) 所述多肽。然后通過(guò)適宜的純化方案，使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)從細(xì)胞分離所述多肽。重 組表達(dá)的備選方案是可以使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)合成本發(fā)明的多肽或者肽。此外，例如， 使用下文描述的本發(fā)明的抗體，尤其抗Rpi_blb2抗體從細(xì)胞(例如，內(nèi)皮細(xì)胞)分離天然 Rpi-blb2，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，使用本發(fā)明的多肽或者其片段，即本發(fā)明的多肽可以產(chǎn)生所述抗 體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及Rpi_blb2蛋白質(zhì)或者具有Rpi_blb2活性的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有本發(fā)明的多核苷酸編碼的氨基酸序列或者可 以通過(guò)本發(fā)明的方法得到的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽不由Seq. ID NO. :8禾Π /或10中描繪的序列組成和 /或不由Seq. ID NO. :7和/或9中描繪的核酸分子編碼的序列組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽不由Mil. 1或者M(jìn)il. 2蛋白質(zhì)的序列組成和/ 或不由編碼Mil. 1或者M(jìn)il. 2蛋白質(zhì)的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)組成。從而，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可以不由Rossi等人1998，PNAS USA 95 9750-9754，Milligan 等人，1998. Plant Cell 10 1307-1319 ；和 / 或 WO 9806750 中所示的 序列組成。用于本申請(qǐng)中的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”和“多肽”是可以互換的。“多肽”指氨基酸的聚合 物(氨基酸序列)并且不涉及分子的特定長(zhǎng)度。從而多肽的定義中包括肽和寡肽。該術(shù)語(yǔ)還指或者包括多肽的翻譯后修飾，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等等。所述定義包括例如， 含有氨基酸的一個(gè)或多個(gè)類似物(包括例如，非天然氨基酸等等)的多肽、具有取代的連接 的多肽，以及本領(lǐng)域已知的天然發(fā)生和非天然發(fā)生的其他修飾。優(yōu)選地，所述多肽是分離的?！胺蛛x的”或者“純化的”蛋白質(zhì)或者其生物活性部分 當(dāng)通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時(shí)基本上細(xì)胞材料，或者當(dāng)化學(xué)合成時(shí)基本上無(wú)化學(xué)前體或者其 他化學(xué)品。術(shù)語(yǔ)“基本上無(wú)細(xì)胞材料”包括本發(fā)明多肽的制備物，其中所述蛋白質(zhì)與天然或者 重組產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的細(xì)胞中的細(xì)胞組分分離。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“基本上無(wú)細(xì)胞材 料”包括具有小于約30% (按照干重)“污染性蛋白質(zhì)”，更優(yōu)選小于約20% “污染性蛋白 質(zhì)”，更優(yōu)選小于約10% “污染性蛋白質(zhì)”，最優(yōu)選小于約5% “污染性蛋白質(zhì)”的制備物。 術(shù)語(yǔ)“污染性蛋白質(zhì)”涉及不是本發(fā)明的多肽的多肽。當(dāng)重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽或者其生 物活性部分時(shí)，還優(yōu)選基本上無(wú)培養(yǎng)基，即，培養(yǎng)基為蛋白質(zhì)制備物體積的約20%以下，更 優(yōu)選約10%以下，最優(yōu)選約5%以下。術(shù)語(yǔ)“基本上無(wú)化學(xué)前體或者其他化學(xué)品”包括制備 物，其中本發(fā)明的主題，例如，本發(fā)明的多肽與涉及該蛋白質(zhì)合成的化學(xué)前體或者其他化學(xué) 品分離。術(shù)語(yǔ)“基本上無(wú)化學(xué)前體或者其他化學(xué)品”包括制備物，其具有小于約30% (按干 重計(jì))化學(xué)前體或者非Rpi_blb2化學(xué)品，更優(yōu)選小于約20%化學(xué)前體或者非Rpi-blb2化 學(xué)品，更優(yōu)選小于約10%化學(xué)前體或者非Rpi-blb2化學(xué)品，最優(yōu)選小于約5%化學(xué)前體或 者非Rpi-blb2化學(xué)品。在優(yōu)選實(shí)施方案中，分離的蛋白質(zhì)或者其生物活性部分缺少污染性 蛋白質(zhì)，其中所述污染性蛋白質(zhì)與本發(fā)明的多肽來(lái)自相同生物。通常，通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn) 生此類蛋白質(zhì)。本發(fā)明的多肽或者其部分可以優(yōu)選包含與SEQID No :2或4的氨基酸序列足夠同 源的氨基酸序列，從而所述蛋白質(zhì)或者其部分保持賦予本發(fā)明的抗性的能力。所述蛋白質(zhì) 的部分優(yōu)選為本文描述的生物活性部分。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽具有與SEQID No :2或4中 所示相同的氨基酸序列。此外，所述多肽可以具有由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述 核苷酸序列與本發(fā)明的多核苷酸的核苷酸序列雜交，優(yōu)選在上文描述的嚴(yán)格雜交條件下雜 交。因此，所述多肽具有核苷酸序列編碼的氨基酸序列，其與SEQ IDNo 2或4的氨基酸序 列之一具有至少約70 %，優(yōu)選至少約75 %，更優(yōu)選至少約80 %、90 %、95 %，甚至更優(yōu)選至 少約96%、97%、98%、99%或以上的同源性。本發(fā)明的優(yōu)選的多肽優(yōu)選具有本文描述的至 少一種Rpi-blb2蛋白質(zhì)活性，例如，其抗性或者免疫活性。本發(fā)明的優(yōu)選多肽包括核苷酸 序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與SEQID No :1或3或5或6的核苷酸序列雜交， 優(yōu)選在嚴(yán)格條件下與所述核苷酸序列雜交，或者與所述核苷酸序列同源(如上定義的)。因此，如本文詳述，本發(fā)明的多肽可以由于天然變異或者誘變?cè)诎被嵝蛄兄信c SEQID No :2或4不同。因此，所述多肽可以包含與SEQ ID No 1或3或5或6的完整氨 基酸至少約70 %，優(yōu)選至少約75 %，更優(yōu)選至少約80 %、90 %、95 %，最優(yōu)選至少約96 %、 97%、98%、99%或以上同源的氨基酸序列。本發(fā)明多肽的生物活性部分包括包含來(lái)源于Rpi_blb2蛋白質(zhì)的氨基酸序列的氨 基酸序列，例如，SEQ ID No :2或4中所示的氨基酸序列或者與其同源的蛋白質(zhì)的氨基酸序 列，其包括的氨基酸少于全長(zhǎng)Rpi_blb2蛋白質(zhì)的氨基酸或者少于如下全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的氨基 酸，所述全長(zhǎng)蛋白質(zhì)與本文描繪的Rpi-blb2蛋白質(zhì)同源并且顯示出Rpi_blb2蛋白質(zhì)的至少一種活性。通常，生物(或者免疫學(xué))活性部分，即肽，例如，長(zhǎng)為5、10、15、20、30、35、36、 37、38、39、40、50、100或更多氨基酸的肽包含具有Rpi_blb2蛋白質(zhì)的至少一種活性或表位 的結(jié)構(gòu)域或者基序。此外，其中缺失多肽的其他區(qū)域的其他生物活性部分可以通過(guò)重組技 術(shù)制備并且評(píng)估本文描述的一種或多種活性。本發(fā)明的Rpi_blb2多核苷酸的操作可以導(dǎo)致產(chǎn)生具有與野生型Rpi_blb2蛋白質(zhì) 功能不同的Rpi_blb2。這些蛋白質(zhì)可以在效率或者活性方面得到提高，可以以比通常更大 的數(shù)目存在于細(xì)胞中，或者效率或活性減小。Rpi-blb2的誘變策略導(dǎo)致所述化合物的所述抗性增加或者對(duì)另一種植物病原體 種或者前述提到的植物病原體種的另一種株系的抗性增加，所述誘變策略不意在限制；這 些策略的變通方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。使用此類策略，并且整合本文公開的機(jī) 制，可以用本發(fā)明的多核苷酸和多肽產(chǎn)生植物或其部分，其表達(dá)野生型Rpi_blb2或者突變 的Rpi-blb2多核苷酸和蛋白質(zhì)分子從而所希望的化合物的生產(chǎn)的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率提 高了。該所希望的化合物可以是植物的任意天然產(chǎn)物，其包括生物合成途徑的終產(chǎn)物和天 然發(fā)生的代謝途徑的中間物，以及在所述細(xì)胞的代謝中不天然發(fā)生的分子，但是其通過(guò)本 發(fā)明的所述細(xì)胞產(chǎn)生。本發(fā)明還提供了嵌合或融合蛋白質(zhì)。本文所用的“嵌合蛋白質(zhì)”或者“融合蛋白質(zhì)”包含有效連接非Rpi_blb2多肽的 多肽。"Rpi-blb2多肽”指具有相應(yīng)于具有Rpi_blb2活性的多肽的氨基酸序列的多肽， 而“非Rpi-blb2多肽”指具有相應(yīng)于不基本上同源于Rpi-blb2的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的多 肽，例如，不賦予本文描述的抗性，尤其不賦予對(duì)致病疫霉抗性和來(lái)源于相同或不同生物的 蛋白質(zhì)。在融合蛋白質(zhì)中，術(shù)語(yǔ)“有效連接”意在表示Rpi_blb2多肽和非Rpi-blb2多肽相 互融合，從而兩條序列都完成所用序列的計(jì)劃的功能。非Rpi-blb2多肽可以與Rpi-blb2多 肽的N-末端或者C-末端融合。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白質(zhì)是GST-LMRP融合蛋白 質(zhì)，其中Rpi_blb2序列融合GST序列的C-末端。此類融合蛋白質(zhì)可以方便重組Rpi_blb2 的純化。在另一實(shí)施方案中，融合蛋白質(zhì)是在其N-末端含有異源信號(hào)序列的Rpi-blb2。在 某些宿主細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞)中，通過(guò)使用異源信號(hào)序列可以增加Rpi_blb2 的表達(dá)和/或分泌。優(yōu)選地，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的Rpi_blb2嵌合或者融合蛋白質(zhì)。例 如，根據(jù)常規(guī)技術(shù)將編碼不同多肽序列的DNA片段連接在框內(nèi)，例如，通過(guò)平末端或者交錯(cuò) 末端用于連接，用限制酶消化以提供適宜的末端，如果適宜，填充粘性末端，堿性磷酸酶處 理以避免不希望的連接，和酶連接。通過(guò)常規(guī)技術(shù)(包括自動(dòng)化DNA合成儀)可以合成融 合基因。備選地，可以用錨定引物實(shí)施基因片段的PCR擴(kuò)增，所述引物在兩個(gè)連續(xù)基因片 段之間形成互補(bǔ)突出端，所述基因片段可以隨后退火并再擴(kuò)增產(chǎn)生嵌合基因序列(見，例 如，Current Protocols in Molecular Biology，編者Ausubel 等人，John Wiley&Sons 1992)。此外，可以通過(guò)商業(yè)途徑得到已經(jīng)編碼融合部分(例如，GST多肽)的許多表達(dá)載 體?？梢詫⒈景l(fā)明的多核苷酸克隆到此類表達(dá)載體中從而融合部分在框內(nèi)連接所編碼的蛋 白質(zhì)。此外，使用適宜的計(jì)算機(jī)程序可以進(jìn)行本發(fā)明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基序的折疊模擬和計(jì)算機(jī)再設(shè)計(jì)(Olszewski，Protein 25 (1996)，286-299 ；Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995)，675-679)。蛋白質(zhì)折疊的計(jì)算機(jī)建?？梢杂糜谠敿?xì)的肽和蛋白質(zhì)模 型的構(gòu)象和能量分析(Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012 ；Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995)，37-45)。具體地，可以用適宜的程序鑒定促有絲分裂的cyplin及其受體 的相互作用位點(diǎn)，并通過(guò)互補(bǔ)肽序列的計(jì)算機(jī)輔助搜索鑒定它的配體或者其他相互作用蛋 白質(zhì)(Fassina，Immunomethods (1994)，114-120。用于設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)和肽的其他適宜的計(jì)算 機(jī)系統(tǒng)描述于現(xiàn)有技術(shù)，例如，Berry, Biochem, Soc. Trans. 22(1994), 1033-1036 ；ffodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 (1987)，1-13 ；Pabo，Biochemistry 25 (1986)，5987-5991。從上述計(jì) 算機(jī)分析得到的結(jié)果可用于例如，制備本發(fā)明蛋白質(zhì)或者其片段的肽模擬物。所述蛋白質(zhì) 的天然氨基酸序列的此類假肽類似物可以非常有效地模擬母蛋白質(zhì)(Benkirane，J.Biol. Chem. 271 (1996)，33218-33224)。例如，容易得到的非手性Q-氨基酸殘基向本發(fā)明蛋白質(zhì) 或者其片段的摻入導(dǎo)致脂肪族鏈的聚亞乙基單位對(duì)酰胺鍵的取代，從而提供構(gòu)建假肽的方 便的策略(Banerjee, Biopolymers 39 (1996)，769—777)。在現(xiàn)有技術(shù)中描述了其他系統(tǒng)中小肽激素的強(qiáng)效肽模擬類似物(Zhang，Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (1996)，327-331)。通過(guò)連續(xù)酰胺烷基化合成肽模擬物組合文庫(kù)， 并測(cè)試所得化合物的例如，結(jié)合和免疫活性，也鑒定了本發(fā)明蛋白質(zhì)的適宜的肽模擬物。產(chǎn) 生和使用肽模擬物組合文庫(kù)的方法在現(xiàn)有技術(shù)，例如，在OstreshJethods in Enzymology 267 (1996)，220-234 和 Dorner，Bioorg. Med. Chem. 4 (1996)，709-715 中描述。此外，可以用本發(fā)明蛋白質(zhì)的三維和/或晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物活性 的肽模擬物抑制劑(Rose，Biochemistry 35 (1996)，12933-12944 ；Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4(1996)，1545-1558)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及特異結(jié)合本發(fā)明的多肽或者部分，即此類蛋白質(zhì) 的特定片段或者表位的抗體。本發(fā)明的抗體可以用于鑒定和分離任意生物中的Rpi-blb和基因，優(yōu)選以本文中 描述的植物制備的植物中的Rpi-blb和基因。這些抗體可以為單克隆抗體、多克隆抗體或 者合成抗體以及抗體片段，如Fab、Fv或者ScFv片段等等。例如，通過(guò)最初在K5hler和 Milstein, Nature 256 (1975)，495，和 Galfr6, Meth. Enzymo 1. 73(1981)，3 中描述的技術(shù)制 備單克隆抗體，所述技術(shù)包括將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與來(lái)自經(jīng)免疫的哺乳動(dòng)物的脾細(xì)胞融合。此夕卜，通過(guò)使用例如，Harlow 禾口 Lane" Antibodies, A LaboratoryManual" ，CSH Press, Cold Spring Harbor，1988中描述的方法可以得到針對(duì)前述肽的抗體或者其片段。 這些抗體可以例如，用于根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的免疫沉淀和免疫定位，以及用于監(jiān)視例如， 重組生物中此類蛋白質(zhì)的合成，和用于鑒定與根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)相互作用的化合物。例 如，用于BlAcore系統(tǒng)中的表面等離子體共振可以用于增加噬菌體抗體選擇的效率，從 結(jié)合本發(fā)明蛋白質(zhì)表位的噬菌體抗體的單個(gè)文庫(kù)產(chǎn)生親和力的高度增加(Schier，Human Antibodies Hybridomas 7 (1996),97-105 ；Malmborg, J. Immunol. Methods 183(1995), 7-13)。在許多情況中，抗體對(duì)抗原的結(jié)合現(xiàn)象等價(jià)于其他配體/抗配體結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多肽的互補(bǔ)序列的反義核酸分子。修飾表達(dá)水平和/或活性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且包括例如過(guò)表達(dá)、 共抑制、使用核酶、有義和反義策略、基因沉默方法?！坝辛x鏈”指雙鏈DNA分子的鏈，其與其mRNA轉(zhuǎn)錄物同源。“反義鏈”含有與“有義鏈”的序列互補(bǔ)的倒置序列。“反義”核酸分子包含與編碼蛋白質(zhì)的“有義”核酸分子互補(bǔ)，例如，與雙鏈cDNA分 子的編碼鏈互補(bǔ)或者與mRNA序列互補(bǔ)的核苷酸序列。因此，反義核酸分子可以通過(guò)氫鍵結(jié) 合有義核酸分子。反義核酸分子可以與整個(gè)Rpi_blb2編碼鏈互補(bǔ)，或者僅與其一部分互 補(bǔ)。因此，反義核酸分子可以為本發(fā)明多核苷酸的核苷酸序列的編碼鏈的“編碼區(qū)”的反義 序列。術(shù)語(yǔ)“編碼區(qū)”指包含密碼子的核苷酸序列區(qū)，所述密碼子翻譯成氨基酸殘基。此外， 反義核酸分子是編碼Rpi_blb2的核苷酸序列的編碼鏈的“非編碼區(qū)”反義的。術(shù)語(yǔ)“非編碼 區(qū)”指編碼區(qū)側(cè)翼的5’和3’序列，其不翻譯成多肽，即也稱作5’和3’非翻譯區(qū)(5’ -UTR 或者 3’ -UTR)?？紤]到編碼本文公開的Rpi_blb2的編碼鏈序列，可以根據(jù)Watson和Crick堿基 配對(duì)法則設(shè)計(jì)本發(fā)明的反義核酸分子。反義核酸分子可以與Rpi_blb2mRNA的完整編碼區(qū) 互補(bǔ)，但是也可以是與Rpi_blb2mRNA的編碼或者非編碼區(qū)的僅一部分反義的寡核苷酸。例 如，反義寡核苷酸可以與Rpi_blb2mRNA的翻譯起始位點(diǎn)周圍的區(qū)域互補(bǔ)。反義寡核苷酸可 以長(zhǎng)為例如，約5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50個(gè)核苷酸。使用化學(xué)合成和酶促連接 反應(yīng)，用本領(lǐng)域公知的方法可以構(gòu)建本發(fā)明的反義核酸分子。例如，使用天然發(fā)生的核苷 酸或者設(shè)計(jì)用于增加分子的生物學(xué)穩(wěn)定性或者增加反義和有義核酸之間形成的雙鏈體的 物理穩(wěn)定性的多種經(jīng)修飾的核苷酸可以化學(xué)合成反義核酸分子(例如，反義寡核苷酸)，例 如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。經(jīng)修飾的核苷酸的實(shí)例可以用于產(chǎn) 生反義核酸，包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、
4-乙?；奏?、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基-氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧 基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、日-0-半乳糖基(11^0&1^、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、 1-甲基鳥嘌呤、1-甲基-肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲 基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基 氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基que0Sine、5’ -甲氧基羧基甲基-尿嘧啶、5-甲氧 基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(ν)、wybutoxosine、假 尿嘧啶、q ue0Sine、2-巰基胞嘧啶、5-甲基_2_硫尿嘧啶、2_硫代-尿嘧啶、4_硫尿嘧啶、
5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基-乙酸(ν)、5_甲基-2-硫尿嘧 啶、3-(3_氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)W、和2，6_ 二氨基嘌呤。備選地，可以使 用表達(dá)載體通過(guò)生物學(xué)方法產(chǎn)生反義核酸，其中已經(jīng)以反義方向?qū)⒍嗪塑账醽喛寺〉剿?表達(dá)載體(即，從所插入的多核苷酸轉(zhuǎn)錄的RNA將為與目的靶多核苷酸反義方向，在下面的 小節(jié)中進(jìn)一步描述)。通常將本發(fā)明的反義核酸分子施用于細(xì)胞或者原位產(chǎn)生從而它們與編碼 Rpi-blb2的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA雜交或者結(jié)合，從而例如，通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻 譯抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)。雜交可以通過(guò)常規(guī)核苷酸互補(bǔ)形成穩(wěn)定的雙鏈體，或者例如，對(duì)于結(jié) 合DNA雙鏈體的反義核酸分子，通過(guò)雙螺旋的大溝中的特異相互作用?？梢孕揎椃戳x分子 從而其特異結(jié)合表達(dá)于所選細(xì)胞表面上的受體或者抗原，例如，通過(guò)將反義核酸分子連接 到結(jié)合細(xì)胞表面受體或者抗原的肽或者抗體實(shí)現(xiàn)所述特異結(jié)合。使用本文描述的載體也可 以遞送反義核酸分子。為了實(shí)現(xiàn)反義分子的足夠細(xì)胞內(nèi)濃度，優(yōu)選其中反義核酸分子置于 強(qiáng)原核生物、病毒或者真核生物(包括植物)啟動(dòng)子的控制下的載體構(gòu)建體。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義核酸分子可以是異頭核酸分子。α-異頭核酸分 子與互補(bǔ)RNA形成特異雙鏈雜合分子，其中與常規(guī)單位相反，所述鏈相互平行(Gaultier等 人(1987) Nucleic Acids. Res. 15 :6625_6641)。反義核酸分子還可以包含2’_0_甲基-核 糖核苷酸(Inoue 等人(1987) NucleicAcids Res. 15 :6131_6148)或者嵌合的 RNA-DNA 類似 物(Inoue 等人(1987)FEBS Lett. 215 :327_330)。此外，本發(fā)明的反義核酸分子可以是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化 性DNA分子，其能夠切割與其有互補(bǔ)區(qū)的單鏈核酸，如mRNA。從而，核酶(例如，錘頭核酶 (在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334:585-591)中描述)可以用于催化性切割 Rpi-blb2mRNA轉(zhuǎn)錄物從而抑制mRNA的翻譯?？梢曰诒疚墓_的Rpi_blb2cDNA的核苷酸 序列或者基于將根據(jù)本發(fā)明中教導(dǎo)的方法分離的異源序列設(shè)計(jì)對(duì)編碼Rpi_blb2的核酸分 子具有特異性的核酶。例如，可以構(gòu)建四膜蟲L-19IVS RNA的衍生物，其中活性位點(diǎn)的核苷 酸序列與編碼mRNA中待切割的核苷酸序列互補(bǔ)。見，例如，Cech等人美國(guó)專利號(hào)4，987,071 和Cech等人美國(guó)專利號(hào)5，116，742。備選地，可以用Rpi_blb2mRNA從RNA分子庫(kù)選擇具有 特異核糖核酸酶活性的催化性RNA。見，例如，Bartel，D.和Szostak，J. W. (1993) Science 261 :1411-1418。本發(fā)明的反義分子還包含多核苷酸，其包含與Rpi_blb2核苷酸序列的調(diào) 節(jié)區(qū)(例如，其啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)互補(bǔ)的核苷酸序列，例如，以形成三螺旋結(jié)構(gòu)，其防 止靶細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)錄。一般見，Helene, C. (1991)Anticancer Drug Des. 6(6) :569_84 ； Helene, C.等人(1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660 :27_36 ；和 Maher, L. J. (1992) Bioassays 14(12) :807-15。此外，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞或者植物組織 的方法，其包括將本發(fā)明的多核苷酸或者載體導(dǎo)入所述植物、植物組織或者植物細(xì)胞的基 因組。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述載體或者所述多核苷酸在用于表達(dá)另一抗性基因，尤其 Rpi-blb的載體或多核苷酸之前、之后或一起導(dǎo)入所述植物、植物組織或者植物細(xì)胞的基因組。為了在植物細(xì)胞中以有義或者反義方向表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，將分子置于 確保在植物細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)元件的控制下。這些調(diào)節(jié)元件可以關(guān)于待表達(dá)的核酸分子以 及關(guān)于待轉(zhuǎn)化的植物種類是異源或同源的并且在上文中詳細(xì)描述。通常，此類調(diào)節(jié)元件包含在植物細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。為了得到轉(zhuǎn)基因植物 的所有組織中的表達(dá)，例如，使用組成型啟動(dòng)子，如CaMV的35S啟動(dòng)子(Odell，Nature 313 (1985)，810-812)或者玉米的聚泛蛋白(polyubiquitin)基因的啟動(dòng)子(Christensen, Plant Mol. Biol. 18 (1982)，675-689)。為了實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物中特定組織的表達(dá)，可能使用 組織特異啟動(dòng)子(見，例如，Stockhaus, EMBO J. 8 (1989)，2245-2251)。還已知在馬鈴薯的 塊莖或者不同植物種，如玉米、蠶豆、小麥、大麥等的種子中具有特異活性的啟動(dòng)子?？梢杂?誘導(dǎo)型啟動(dòng)子以便能夠精確控制表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也包含通過(guò)植物的感染誘導(dǎo)的啟動(dòng) 子。其他實(shí)施方案在上文描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生抗卵菌門病原體的植物或其部分的方法，其 包括步驟在植物或其部分中表達(dá)本發(fā)明的多肽和另一抗性蛋白質(zhì)。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的或者根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基 因植物或植物組織，其當(dāng)存在所述多核苷酸或載體時(shí)抗所述病原體。
經(jīng)轉(zhuǎn)化的生物(或者轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織)的產(chǎn)生需要向相關(guān)宿主細(xì)胞導(dǎo)入所述 DNA、RNA或者蛋白質(zhì)。許多方法可用于該步驟，其稱作轉(zhuǎn)化(或者轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)(Keown等 人(1990)Methods in Enzymology 185:527-537)。例如，通過(guò)微注射或者用DNA包被的微 粒轟擊可以直接導(dǎo)入DNA或RNA。而且，例如，使用聚乙二醇可以化學(xué)透化細(xì)胞，從而DNA可 以通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。還可以通過(guò)原生質(zhì)體與其他含有DNA的單位，如小細(xì)胞(minicell)、 細(xì)胞、溶菌酶或者脂質(zhì)體融合導(dǎo)入DNA。導(dǎo)入DNA的另一種適宜的方法是電穿孔，其中通 過(guò)電脈沖可逆地透化細(xì)胞。已經(jīng)描述了適宜的方法(例如，Bilang等人(1991)Gene 100 247-250 ；Scheid 等人(1991)Mol Gen Genet 228 :104_112 ；Guerche 等人(1987)Plant Science 52 :111_116 ;Neuhause 等人(1987)Theor Appl Genet 75 :30_36 ;Klein 等人
(1987)Nature327 :70_73 ；Howell 等人(1980)Science 208 1265 ；Horsch 等人(1985) Science 227 :1229_1231 ;DeBlock 等人(1989)Plant Physiology 91 694-701 ；Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach 禾口 Weissbach,編著)Academic Press Inc.
(1988)；禾口Methods in Plant MolecularBiology (Schuler 禾口 Zielinski，編著)Academic Press Inc. (1989))。在植物中，上述從植物組織或植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化和再生植物的方法用于瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn) 化。適宜的方法特別為通過(guò)聚乙二醇誘導(dǎo)的DNA攝入的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、使用基因槍的生物 射彈方法(其也稱作微粒轟擊方法)、電穿孔、將干燥胚胎在含有DNA的溶液中孵育，和微注 射。除了這些“直接”轉(zhuǎn)化技術(shù)，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌或者毛根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的細(xì)菌感染也可以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化最適于雙子葉植物細(xì)胞。所 述方法由例如，Horsch RB 等人(1985) Science225 :1229f 描述。當(dāng)使用農(nóng)桿菌時(shí)，表達(dá)盒必需整合到特定質(zhì)粒中，可以整合到穿梭載體或者中間 載體，或者整合到雙元載體中。如果用Ti或者Ri質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，Ti或者Ri質(zhì)粒T-DNA的 至少右邊界，但是在多數(shù)情況中，右邊界和左邊界以側(cè)翼區(qū)的形式連接待導(dǎo)入的表達(dá)盒。優(yōu)選使用雙元載體。雙元載體能夠在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中復(fù)制。通常，它們包含 選擇標(biāo)記基因和接頭或多接頭，其側(cè)翼是右和左T-DNA邊界序列?？梢詫⑺鼈冎苯愚D(zhuǎn)移到 農(nóng)桿菌中(Holsters等人(1978)Mol Gen Genetl63 181-187)。選擇標(biāo)記基因允許選擇所 轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌并且為，例如，nptll基因，其賦予對(duì)卡那霉素的抗性。作為宿主生物的農(nóng)桿 菌在該情況中應(yīng)該已經(jīng)含有具有vir區(qū)的質(zhì)粒。vir區(qū)是將T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞所需的。 以這種方法轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌可以用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。T-DNA用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的用途已經(jīng)詳 細(xì)研究禾口描述(EP 120516 ；Hoekema, The Binary PlantVector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V.，Alblasserdam, V 章；An 等人(1985) EMBO J 4 :277_287)。多種雙元載 體是已知的，它們的一些可以通過(guò)商業(yè)途徑得到，如ρΒΙΙΟΙ. 2或者pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA)。已經(jīng)描述了適宜在植物中表達(dá)的其他啟動(dòng)子(Rogers等人(1987) Methin Enzymol 153 :253_277 ；Schardl 等人(1987) Gene 61 :1_11 ；Berger 等人(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86 :8402_8406)。直接轉(zhuǎn)化技術(shù)適于任意生物和細(xì)胞類型。對(duì)于DNA或者RNA注射或者電穿孔到植物細(xì)胞的情況，所用的質(zhì)粒不必滿足任何具體要求?？梢允褂煤?jiǎn)單質(zhì)粒，如PUC系列的質(zhì)粒。如果將從所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生完整植物， 必需額外的選擇標(biāo)記基因位于質(zhì)粒上。選擇標(biāo)記是所導(dǎo)入的DNA的部分時(shí)，可以從未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞， 即含有整合到宿主細(xì)胞的DNA的所導(dǎo)入DNA的那些細(xì)胞?？梢宰鳛闃?biāo)記的基因的實(shí)例為能 夠賦予抗生素或者除草劑(如卡那霉素、G418、博來(lái)霉素、潮霉素或者膦絲菌素)抗性的基 因(見上文)。表達(dá)此類標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠在相應(yīng)抗生素或除草劑的一定濃度存在 下存活，而所述抗生素或除草劑殺死未轉(zhuǎn)化的野生型。實(shí)例在上文描述并且優(yōu)選包含bar 基因，其賦予對(duì)除草劑膦絲菌素的抗性(Rathore KS等人(1993)PlantMol Biol 21(5) 871-884)，還包括nptll基因，其賦予卡那霉素抗性；hpt基因，其賦予潮霉素抗性，或者 EPSP基因，其賦予除草劑草甘膦抗性。選擇標(biāo)記允許從未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞 (McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5 :81_84)。可以以常規(guī)方式培育和雜交所得 植物。為了確?；蚪M整合是穩(wěn)定和可遺傳的，應(yīng)該生長(zhǎng)兩代或更多代。上述方法描述于例如，SD Kung和R Wu編著的Jenes B等人(1993) Techniques for Gene Transfer Transgenie Plants,卷 1, Engineering andUtilization, Academic Press,128-143 頁(yè)禾口 Potrykus(1991)Annu Rev PlantPhysiol PlantMolec Biol 42: 205-225)。優(yōu)選將待表達(dá)的構(gòu)建體克隆到適于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的載體，例如，pBinl9中(Bevan 等人(1984)Nucl Acids Resl2 :8711f)。一旦已經(jīng)產(chǎn)生了經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，就可以使用技術(shù)人員已知的方法得到完整植 物。例如，愈傷組織培養(yǎng)物用作起始材料?？梢杂迷撨€未分化的細(xì)胞生物量以已知方式誘 導(dǎo)芽和根的發(fā)育。所得的芽可以移植到戶外并繁殖。技術(shù)人員熟悉從植物細(xì)胞和植物部分再生完整植物的方法。再生方法描述于例 如，F(xiàn)ennell 等人(1992)Plant Cell Rep. 11 :567_570 ；Stoeger 等人(1995)Plant Cell Rep. 14 273-278 Jahne 等人(1994)Theor Appl Genet 89 :525_533。根據(jù)本發(fā)明的方法可以有利地與產(chǎn)生病原體抗性(例如，對(duì)昆蟲、真菌、細(xì)菌、線 蟲等的抗性)、脅迫抗性和植物性質(zhì)的另一種改善的其他方法聯(lián)合使用。實(shí)例由Dimwell JM,Transgenic approaches to crop improvement,JExp Bot. 2000 ；51Spec No ;487_96頁(yè) 提及。農(nóng)桿菌的適宜株系和載體以及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化和適宜的生長(zhǎng)和選擇培養(yǎng)基 是技術(shù)人員公知的并且描述于現(xiàn)有技術(shù)中(GV31 01 (pMK90RK)，Koncz, Mol. Gen. Genet. 204(1986)，383-396 ；C58C1(pGV 3850kan)，Deblaere, Nucl. Acid Res. 13(1985)， 4777 ；Bevan, Nucleic. Acid Res. 12(1984) , 8711 ；Koncz, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 86(1989),8467-8471 ；Koncz, Plant Mol. Biol. 20(1992),963-976 ；Koncz, Specialized vectors for gene tagging andexpression studies. In :Plant Molecular Biology Manual 卷 2, Gelvin 禾口 Schilperoort(Eds. ), Dordrecht,荷蘭Kluwer AcademicPubl. (1994),1-22 ；EP-A-120 516 ；Hoekema :The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V. , Alblasserdam(1985), Chapter V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sci.，4，1-46 ；An, EMBO J. 4 (1985)，277-287)。盡管在本發(fā)明方法中優(yōu)選使用根癌農(nóng)桿菌，但是如果希望所述株系賦予的表型， 也可以使用其他農(nóng)桿菌株系，如毛根農(nóng)桿菌。
使用上述方法可能轉(zhuǎn)化多數(shù)雙子葉植物。但是對(duì)于單子葉植物的轉(zhuǎn)化，也已經(jīng)開 發(fā)了一些成功的轉(zhuǎn)化技術(shù)。這些技術(shù)包括使用例如，上述生物射彈方法轉(zhuǎn)化以及原生質(zhì)體 轉(zhuǎn)化、部分透化細(xì)胞的電穿孔、使用玻璃纖維導(dǎo)入DNA，等等。本文所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”指將外源多核苷酸轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞，而不管用于轉(zhuǎn)移的方 法?？梢詫⒍嗪塑账崴矔r(shí)或者穩(wěn)定導(dǎo)入宿主細(xì)胞并且可以例如作為質(zhì)?；蛘咦鳛榍逗线B接 保持不整合，或者備選地，可以整合到宿主基因組。然后所得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以用于以技 術(shù)人員已知的方式再生經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及植物細(xì)胞，其包含本發(fā)明的或者通過(guò)本發(fā)明 方法可以得到的多核苷酸或載體。優(yōu)選地，細(xì)胞包含賦予另一抗性的多核苷酸或者載體，更 優(yōu)選地，為編碼Rpi-blb的載體或者多核苷酸。從而，本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其含有(優(yōu)選穩(wěn)定整合到基因組)根據(jù)本發(fā) 明的多核苷酸，其連接到允許在植物細(xì)胞中表達(dá)所述多核苷酸的調(diào)節(jié)元件，并且其中所述 多核苷酸是轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞外來(lái)的。對(duì)于外來(lái)的含義，見上文。從而，本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因植 物組織。由于本發(fā)明多肽的(過(guò))表達(dá)，所述植物或植物組織抗植物病原體，尤其抗卵菌。 優(yōu)選地，所述植物還抗其他病原體，例如，抗吮吸性植物病原體。本文描述了其他病原體。優(yōu) 選所述植物或者植物組織抗疫霉種，最優(yōu)選地抗致病疫霉。例如，為了得到表達(dá)Rpi_blb2基因的轉(zhuǎn)基因植物，可以將其編碼區(qū)克隆到例如， pBinAR 載體(HSfgen和 Willmitzer，Plant-Science，66，1990，221-230)中。例如，根據(jù) 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，可以用實(shí)施例和附圖，例如，表3b中所示引物，尤其用ARFl F和 ARFl R擴(kuò)增Rpi_blb2的編碼區(qū)?？梢约兓肞CR片段并隨后將該片段克隆到載體中。 可以將所得載體轉(zhuǎn)移到根癌農(nóng)桿菌中。該株系可以用于轉(zhuǎn)化并且可以選擇轉(zhuǎn)基因植物。在 另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物或者植物組織。例如，關(guān)于核酸序列、包含所述核酸序列的表達(dá)盒或者載體或者用所述核酸序列、 表達(dá)盒或者載體轉(zhuǎn)化的生物，“轉(zhuǎn)基因的”指通過(guò)重組方法產(chǎn)生的所有那些構(gòu)建體，在所述 構(gòu)建體中，a) Rpi-blb2核酸序列，或者b)有效連接Rpi_blb2核酸序列的遺傳控制序列，例如，啟動(dòng)子，或c) (a)和(b)不位于它們的天然遺傳環(huán)境中或者已經(jīng)通過(guò)重組方法修飾，修飾的一個(gè)實(shí)例是替 代、加入、缺失、倒置或者插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基。天然遺傳環(huán)境指最初生物中天然染 色體基因座，或者指存在于基因組文庫(kù)中。對(duì)于基因組文庫(kù)，優(yōu)選保持，至少部分保持核酸 序列的天然遺傳環(huán)境。所述環(huán)境在核酸序列側(cè)翼的至少一邊并且具有長(zhǎng)為至少50bp，優(yōu) 選至少500bp，特別優(yōu)選至少lOOObp，非常特別優(yōu)選至少5000bp的序列。天然發(fā)生的表達(dá) 盒_例如，Rpi_blb2啟動(dòng)子與相應(yīng)Rpi_blb2基因的天然發(fā)生的組合-當(dāng)用非天然的、合成 的“人工“方法如誘變修飾時(shí)，變成轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。已經(jīng)描述了此類方法(US 5，565，350 ；WO 00/15815 ；也見上文)。此外，還可以轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、植物組織或者植物，從而(過(guò))表達(dá)其他酶和蛋白 質(zhì)，所述表達(dá)支持植物或者植物組織抗性的增加，例如，Rpi-blb (同義詞Rpi-blbl、RB或Sbul)、Rl、Rpi-mcd、R-ber (同義詞 R12)、Rpil、Rpi_blb3、Rpi-ABPTU R2, R3a 或 R3b、R4、 R5、R6、R7、R8、R9、RIO、Rll、Ph_l、Ph_2 和 / 或 Ph_3_ 蛋白質(zhì)。優(yōu)選 Rpi-blb 和 Rpi_blb2
共表達(dá)。本發(fā)明還涉及包含如上述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的培養(yǎng)的植物組織，所述植物細(xì)胞顯 示出根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)。根據(jù)上面的定義，優(yōu)選作為轉(zhuǎn)基因生物的宿主和起始生 物主要是植物。本發(fā)明的范圍內(nèi)包括植物界高等和低等植物的所有屬和種。還包括具有增 加的Rpi-blb2活性的成熟植物、種子、芽和幼苗，和部分、繁殖材料和從中得到的培養(yǎng)物， 例如，細(xì)胞培養(yǎng)物。成熟植物指幼苗之外的任意發(fā)育階段的植物。術(shù)語(yǔ)幼苗指早期發(fā)育階 段的年幼的不成熟的植物。根據(jù)本發(fā)明得到的任意轉(zhuǎn)化的植物可以用于常規(guī)育種方案中或者用于體外植物 繁殖以產(chǎn)生更多具有相同特征的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物和/或可以用于在相同或相關(guān)種的其他品 種中引入相同特征。此類植物也是本發(fā)明的部分。從經(jīng)轉(zhuǎn)化植物得到的種子在遺傳上也含 有相同的特征并且是本發(fā)明的部分。如前面提到的，本發(fā)明原則上可以應(yīng)用于可以用本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的任意轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化的任意植物和農(nóng)作物。通常，可以根據(jù)本發(fā)明修飾并且顯示出根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)或者此類蛋 白質(zhì)合成減少的植物可以來(lái)自任意希望的植物種。它們可以是單子葉植物或者雙子葉植 物，優(yōu)選它們屬于在農(nóng)業(yè)、林業(yè)或者園藝上重要的植物種，如農(nóng)作物植物(例如，玉米、稻、 大麥、小麥、黑麥、燕麥等等)、馬鈴薯、產(chǎn)油植物(例如，油菜籽、向日葵、花生、大豆等等)、 棉花、甜菜、甘蔗、豆科植物(例如，豆類、豌豆等等)、產(chǎn)木材植物，優(yōu)選樹等等。然而，優(yōu)選 可以受疫霉種感染的植物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的或者根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的植物、植物細(xì)胞或 者植物組織選自根據(jù)Systema Naturae 2000, Brands, S. J, Amsterdam的荇菜科、茄科、厚 殼樹科、核果茄科、Goetzeaceae、旋花科、菟絲子科、花惹科和田基麻科(Hydrophyllaceae) 構(gòu)成的組或者具有其來(lái)源。優(yōu)選地，本發(fā)明的或者根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的所述植物、植物 細(xì)胞或者植物組織為茄科，優(yōu)選選自根據(jù)Systema Naturae 2000，Brands, S. J, Amsterdam 的由顛茄屬、Browallia、番茉莉?qū)?、辣椒?Capsicum)、夜香樹屬、Cyphomandra、曼陀羅 屬(Datura)、Fabiana> Franciscea、天仙子屬(Hyoscyamus)、枸杞屬(Lycium)、爺參屬 (Mandragora)、假酸漿屬(Nicandra)、煙草屬(Nicotiana)、碧冬茄屬(Petunia)、酸漿屬 (Physalis)、Schizanthus和茄屬(Solanum)構(gòu)成的組或者具有其來(lái)源。更優(yōu)選地，本發(fā)明的或者根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的植物、植物細(xì)胞或者植物組織 為 S. bulbocastanum、馬鈴薯(S. tuberosum)、番爺(S. Iycopersicum)、矮牽牛、樹番爺 (S. betaceum)、pear melon(S. muricatum)和茄子(S. melongena)。甚至更優(yōu)選地，所述植 物、植物組織或植物細(xì)胞是馬鈴薯或番茄。最優(yōu)選地為馬鈴薯。在其他系統(tǒng)中，分類將是 類似的。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知所述差異，例如，更通常，番茄被系統(tǒng)命名為L(zhǎng)ycopersicon lycopesicum(L.)Karsten ex Farwell0在再一方面，本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的可收獲部分和繁殖材料， 其含有表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的核酸分子和/或多肽的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或者含有顯示出本發(fā)明 多肽的增加的水平的細(xì)胞?？墒斋@部分原則上可以為植物的任意有用的部分，例如，花、花粉、幼苗、塊莖、葉子、莖干、果實(shí)、種子、根等等。繁殖材料包括例如，種子、果實(shí)、插條、幼苗、塊莖、根莖等等。 優(yōu)選馬鈴薯、番茄、eggfruits或者pear melons作為可收獲的或者繁殖材料。對(duì)于本發(fā)明 的植物為矮牽牛的情況，本發(fā)明在一個(gè)實(shí)施方案中涉及矮牽牛的花作為可收獲的部分。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物和(對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物生物)從它們來(lái)源的 細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、部分，例如，根、葉等等，和轉(zhuǎn)基因繁殖材料(如種子或果實(shí))的用途，用 于生產(chǎn)食品或飼料、藥物或者精細(xì)化學(xué)品。具體地，馬鈴薯可以用于產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多核苷酸、植物、植物細(xì)胞或者植 物組織、載體或者多肽的用途，用于制備脂肪酸、類胡蘿卜素、類異戊二烯、維生素、脂類、蠟 酯、(多)糖和/或聚羥基鏈烷酸酯，和/或其代謝產(chǎn)物，尤其類固醇激素、膽固醇、前列腺 素、甘油三酯、膽汁酸和/或酮體產(chǎn)生細(xì)胞、組織、和/或植物。有許多機(jī)制，通過(guò)這些機(jī)制 可以實(shí)現(xiàn)脂肪酸、類胡蘿卜素、類異戊二烯、維生素、蠟酯、脂類、(多)糖和/或聚羥基鏈烷 酸酯，和/或其代謝產(chǎn)物，尤其類固醇激素、膽固醇、甘油三酯、前列腺素、膽汁酸和/或酮體 或者摻入此類經(jīng)改變的蛋白質(zhì)的上面定義的精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)生、生產(chǎn)和/或生產(chǎn)效率。對(duì) 于植物，例如，通過(guò)增加乙酰輔酶A的表達(dá)，可能增加所產(chǎn)生的所述化合物的量，從而允許 更容易收獲和純化，或者對(duì)于植物，更有效分配，乙酰輔酶A是細(xì)胞中許多產(chǎn)物的基礎(chǔ)，所 述產(chǎn)物為例如，脂肪酸、類胡蘿卜素、類異戊二烯、維生素、脂類、(多)糖、蠟酯、和/或聚羥 基鏈烷酸酯，和/或其代謝產(chǎn)物，尤其前列腺素、類固醇激素、膽固醇、甘油三酯、膽汁酸和/ 或酮體。此外，可能需要一種或多種所述代謝產(chǎn)物、增量輔因子、前體分子，和適宜的生物 合成途徑的中間化合物。因此，通過(guò)增加參與營(yíng)養(yǎng)(如碳源(即糖)、氮源(即，氨基酸、銨 鹽)、磷酸和硫)輸入的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的數(shù)目和/或活性，由于除去了對(duì)生物合成過(guò)程的營(yíng)養(yǎng)供 給限制，可以提高如上所述的乙酰輔酶A和其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。具體地，可以提高植物中所 述化合物的產(chǎn)生、生產(chǎn)和/或生產(chǎn)效率，所述化合物為例如，脂肪酸、類胡蘿卜素、類異戊二 烯、維生素、脂類、(多)糖、和/或聚羥基鏈烷酸酯，和/或其代謝產(chǎn)物，尤其類固醇激素、 膽固醇、前列腺素、甘油三酯、膽汁酸和/或酮體分子。進(jìn)一步優(yōu)選的是在宿主生物中重組產(chǎn)生藥物或者精細(xì)化學(xué)品的方法，其中用上述 表達(dá)盒之一轉(zhuǎn)化宿主生物，并且該表達(dá)盒包含一種或多種結(jié)構(gòu)基因，其編碼所希望的精細(xì) 化學(xué)品或者催化所希望的精細(xì)化學(xué)品的生物合成，培養(yǎng)所轉(zhuǎn)化的宿主生物，并從培養(yǎng)基分 離所希望的精細(xì)化學(xué)品。該方法可以廣泛應(yīng)用于精細(xì)化學(xué)品如酶、維生素、氨基酸、糖、脂肪 酸，和天然和合成調(diào)味劑、香料物質(zhì)和著色劑。特別優(yōu)選的是產(chǎn)生生育酚和生育三烯酸和類 胡蘿卜素類。培養(yǎng)所轉(zhuǎn)化的生物并通過(guò)技術(shù)人員公知的方法從宿主生物或者培養(yǎng)基分離產(chǎn) 物。藥物，如抗體或者疫苗的產(chǎn)生由 Hood EE,Jilka JM. Curr Opin Biotechnol. 1999Aug ； 10(4) 382-6 ；Ma JK, Vine ND. Curr Top Microbiol Immunol. 1999 ；236 :275_92 描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多核苷酸、載體或者多肽的用途，用于 產(chǎn)生具有所述抗性的植物或植物或其部分的組織、器官或者細(xì)胞。此外，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及鑒定刺激對(duì)所述植物病原體的抗性的化合 物的方法，其包括a)在細(xì)胞培養(yǎng)條件下將表達(dá)本發(fā)明多肽或者其mRNA的細(xì)胞與候選化合物接觸；b)測(cè)定所述多肽或者所述mRNA的表達(dá)的增加；c)比較不存在所述候選化合物時(shí)，做出的對(duì)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)答的表達(dá)水平；其中相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)增加的表達(dá)表明所述化合物刺激抗性。所述化合物可以化學(xué)合成或者經(jīng)微生物產(chǎn)生和/或包含于例如來(lái)自例如，植物、 動(dòng)物或者微生物，例如，病原體的的樣品中，例如，細(xì)胞提取物中。此外，所述化合物可以是 本領(lǐng)域已知的但是迄今為止還不知道能夠抑制或者激活Rpi_blb2。反應(yīng)混合物可以是無(wú) 細(xì)胞提取物或者可以包含細(xì)胞或者組織培養(yǎng)物。本發(fā)明方法的適宜的構(gòu)成是本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的并且例如，通常描述于Alberts等人，Molecular Biology of the Cell，第三版 (1994)，尤其第17章?；衔锟梢岳纾拥椒磻?yīng)混合物、培養(yǎng)基、注射到細(xì)胞或者噴霧到 植物上。如果以本發(fā)明的方法鑒定了含有化合物的樣品，那么可能從鑒定為含有能夠激活 或者增加對(duì)所述病原體抗性的化合物的原始樣品分離所述化合物，或者可以進(jìn)一步細(xì)分原 始樣品(例如，如果它由許多不同化合物組成)以便減小每個(gè)樣品不同物質(zhì)數(shù)并用原始樣 品的細(xì)分樣品重復(fù)所述方法。取決于所述樣品的復(fù)雜性，上述步驟可以進(jìn)行數(shù)次，優(yōu)選直到 根據(jù)本發(fā)明鑒定的樣品僅包含有限數(shù)目的或者僅一種物質(zhì)。優(yōu)選地，所述樣品包含具有相 似化學(xué)和/或物理性質(zhì)的物質(zhì)，最優(yōu)選地，所述物質(zhì)是相同的。優(yōu)選地，根據(jù)上述方法鑒定 化合物或者其衍生物進(jìn)一步以適于應(yīng)用于植物育種或者植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)的形式配制?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的方法測(cè)試和鑒定的化合物可以是表達(dá)文庫(kù)，例如，cDNA表達(dá) 文庫(kù)、肽、蛋白質(zhì)、核酸、抗體、小有機(jī)化合物、激素、肽模擬物、PNA等等(Milner，Nature Medicine 1 (1995),879-880 ；Hupp, Cell 83(1995), 237-245 ；Gibbs, Cell 79(1994)， 193-198和如上引用的參考文獻(xiàn))。所述化合物還可以是已知抑制劑或者激活劑的功能衍 生物或者類似物。制備化學(xué)衍生物和類似物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且描述于 例如，Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New Yorklnc., 175Fifth Avenue, New York, N. Y. 10010U. S. A.禾口 OrganicSynthesis，Wiley, New York, USA。此外，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法測(cè)試所述衍生物和類似物的效果。此外，例如，根據(jù) 上述方法，可以使用肽模擬物和/或計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)適宜的衍生物和類似物?？梢杂糜诒?發(fā)明方法中的細(xì)胞或者組織優(yōu)選為上文實(shí)施方案中描述的本發(fā)明的宿主細(xì)胞、植物細(xì)胞或 者植物組織?？梢匀鐚?shí)施例中描述的，尤其通過(guò)孢子形成指數(shù)測(cè)定可以確定化合物是否能夠抑 制或者激活所述物質(zhì)。通過(guò)上述方法鑒定的激活劑可以證明用作殺真菌劑或者植物保護(hù) 劑。從而，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明方法得到或鑒定的化合物，所述化合 物為Rpi_blb2的激動(dòng)劑。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及通過(guò)本發(fā)明方法鑒定的化合物。所述化合物為例如，Rpi_blb2的同源物。通過(guò)誘變，例如Rpi_blb2的離散點(diǎn)突變 或者截短可以產(chǎn)生本發(fā)明多肽的同源物。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“同源物”指作為Rpi_blb2的 活性激動(dòng)劑的蛋白質(zhì)的變體形式。所述蛋白質(zhì)的激動(dòng)劑可以基本上保持Rpi_blb2的相同 生物活性或者其一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及特異識(shí)別本發(fā)明化合物的抗體。本發(fā)明還涉及診斷組合物，其包含至少一種前述多核苷酸、核酸分子、載體、蛋白 質(zhì)、本發(fā)明的抗體或者化合物和任選適宜的檢測(cè)方法。本發(fā)明的診斷組合物適于從細(xì)胞分離mRNA并在雜交條件下將所得到的mRNA與包含如上述的核酸探針的探針接觸，檢測(cè)與所述探針雜交的mRNA的存在，從而檢測(cè)細(xì)胞中所 述蛋白質(zhì)的表達(dá)。檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的存在的其他方法包括本領(lǐng)域公知的免疫技 術(shù)，例如，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。此外，可能使用根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，尤其實(shí)施例，例如表 3a或3b中描述的標(biāo)記作為植物育種中的分子標(biāo)記或者引物。適宜檢測(cè)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如，用于雜交測(cè)定的緩沖液和溶液，例 如，前述融合和緩沖液，和例如Sambrook等人中描述的DNA印跡、蛋白質(zhì)印跡、RNA印跡等 是已知的。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及試劑盒，其包含本發(fā)明的多核苷酸、載體、宿主細(xì) 胞、多肽、反義核酸、抗體、植物細(xì)胞、植物或植物組織、可收獲部分、繁殖材料或者化合物。本發(fā)明的試劑盒的化合物可以包裝在諸如瓶子的容器中，任選使用緩沖液和/或 溶液。如果適宜，可以將一種或多種所述組分包裝在一個(gè)和相同容器中。額外或備選地，可 以將一種或多種所述組分吸附到固相支持體，如硝酸纖維素濾膜、玻璃板、芯片或者尼龍膜 或者微量滴定板的孔。所述試劑盒可以用于任一種本文描述的方法和實(shí)施方案中，例如，用 以產(chǎn)生宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物、藥物組合物、檢測(cè)同源序列、鑒定拮抗劑或激動(dòng)劑等等。此外，試劑盒可以還包含關(guān)于試劑盒用于任意所述實(shí)施方案，尤其用于增加植物 細(xì)胞、植物組織或植物對(duì)一種或多種所述病原體的抗性的使用說(shuō)明。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含多核苷酸，其編碼一種或多種前述抗性蛋 白質(zhì)，優(yōu)選Rpi-blb，和/或與所述抗性蛋白質(zhì)，優(yōu)選與Rpi-blb相關(guān)的抗體、載體、宿主細(xì) 胞、反義核酸、植物細(xì)胞或植物組織和/或植物。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生植物保護(hù)劑的方法，所述植物保護(hù)劑提供本 發(fā)明的多核苷酸、載體或者多肽，所述方法包括本發(fā)明方法的步驟；和以可以用作植物農(nóng)業(yè) 組合物的形式配制本發(fā)明的多核苷酸、載體或者多肽或者所述方法的步驟(C)中鑒定的化 合物。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生植物保護(hù)劑組合物的方法，其包括本發(fā)明方 法的步驟；和(a)以可以作為農(nóng)業(yè)組合物接受的形式配制步驟(C)中鑒定的化合物?！翱梢宰鳛檗r(nóng)業(yè)組合物接受”理解為此類組合物符合規(guī)定殺真菌劑、植物營(yíng)養(yǎng)、除 草劑等的含量的法律。優(yōu)選地，此類組合物對(duì)所保護(hù)的植物和用該植物飼養(yǎng)的動(dòng)物(包括 人)沒有任何害處。本發(fā)明還涉及與此類用途和方法有關(guān)的一些實(shí)施方案?？梢砸砸环N或多種下面的 方法使用本文描述的多核苷酸、多肽、蛋白質(zhì)同源物、融合蛋白質(zhì)、引物、載體、宿主細(xì)胞鑒 定抗所提及的植物病原體和相關(guān)生物的的植物；基因組作圖；鑒定和定位目的序列；進(jìn)化 研究；確定功能所需區(qū)域；活性的調(diào)節(jié)。因此，本發(fā)明的多核苷酸具有許多用途。首先，它們可以用于鑒定生物為 S. bulbocastanum或者其親戚。而且它們可以用于鑒定混合植物群體中S. bulbocastanum 或者其親戚的存在。通過(guò)在嚴(yán)格條件下用跨該S. bulbocastanum獨(dú)特的本發(fā)明基因的區(qū)域 的探針探測(cè)從植物的單一或者混合群體培養(yǎng)物所提取的基因組DNA，可以確定本發(fā)明是否 使用了 S. bulbocastanum或者其親戚，例如近親，或者是否存在S. bulbocastanum或者其親 戚，例如，近親。
此外，本發(fā)明的多核苷酸可以與相關(guān)物種的序列足夠同源從而這些核酸分子可以 作為構(gòu)建相關(guān)生物中基因組圖譜的標(biāo)記。本發(fā)明的多核苷酸還可以用于進(jìn)化和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究。通過(guò)比較本發(fā)明的 Rpi-blb2的序列與編碼來(lái)自其他生物的相似酶的序列，可以評(píng)估生物的進(jìn)化相關(guān)性。類似 地，此類比較允許評(píng)估所述序列的哪些區(qū)是保守的，哪些不是保守的，這可以有助于確定蛋 白質(zhì)的對(duì)于所述酶功能必要的那些區(qū)。這種確定對(duì)于蛋白質(zhì)工程化研究是有價(jià)值的并且可 以指示在誘變而不喪失功能方面，所述蛋白質(zhì)可以耐受什么。本發(fā)明的描述和實(shí)施例公開并包括這些和其他實(shí)施方案。關(guān)于按照本發(fā)明使用 的方法、用途和化合物任一種的其他文獻(xiàn)可以使用例如電子裝置從公共圖書館檢索。例 如，可以利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)"Medline”，其可以在因特網(wǎng)上以http //www. ncbi. nlm. nih. gov/PubMed/medline. html 提供。其他數(shù)據(jù)庫(kù)禾口網(wǎng)址，如 http://www.ncbi.nim.nih. gov/, http://www. infobiogen. fr/, http://www. fmi. ch/biology/research-tools. html, http://www. tigr. org/是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以使用例如，http//www. lycos, com得到。在Berks，TIBTECH 12 (1994)，352-364中給出了生物技術(shù)專利信息綜述和可用 于回溯檢索和最新文獻(xiàn)通報(bào)的專利信息的相關(guān)來(lái)源的調(diào)查。表表1 序列表2. 2000年在荷蘭的Marknesse進(jìn)行的田間試驗(yàn)中BC4作圖群ARG95-3和ARP 96-11的2851個(gè)子代克隆中抗性的分離。用括號(hào)中的百分?jǐn)?shù)表示分類為具有抗性、敏感或 者未知表型的克隆數(shù)。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生或者增加植物對(duì)卵菌門植物病原體的抗性的方法，其包括增加植物或植物組 織、器官或細(xì)胞或植物部分中Rpi_blb2蛋白質(zhì)的活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述Rpi_blb2蛋白質(zhì)由包含核酸分子的多核苷酸編碼，所 述核酸分子選自(a)編碼SEQID NO 2或者4中描述的多肽的至少成熟形式的核酸分子；(b)核酸分子，其包含編碼所述多肽的至少成熟形式的如SEQIDNO :1或3或5或6中 描繪的編碼序列；(c)核酸分子，其核苷酸序列由(a)或者(b)的核苷酸序列的遺傳密碼簡(jiǎn)并產(chǎn)生；(d)核酸分子，其編碼的多肽通過(guò)從(a)到(c)的多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列的 一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的替代、缺失和/或加入從(a)到(c)的多核苷酸編碼的多肽衍生；(e)核酸分子，其編碼的多肽的序列與(a)或(b)的核酸分子編碼的多肽的氨基酸序列 具有70%或以上的同一性；(f)核酸分子，其包含(a)到(e)任一項(xiàng)的核酸分子編碼的多肽的片段或者具有表位的 部分；(g)核酸分子，其包含的多核苷酸具有用表3b中所列引物從核酸文庫(kù)擴(kuò)增的核酸分子 的序列；(h)核酸分子，其編碼(a)到(g)任一項(xiàng)編碼的多肽的以氨基酸1、30、50、100、200、 300,500或1000開始并以氨基酸1267、1000、500、300、200、50、30、或1結(jié)束的片段；(i)包含(a)或(d)任一項(xiàng)的多核苷酸的至少20個(gè)核苷酸的核酸分子；(j)核酸分子，其編碼的多肽被針對(duì)(a)到(h)任一項(xiàng)的核酸分子編碼的多肽產(chǎn)生的單 克隆抗體識(shí)別；(k)核酸分子，其可以通過(guò)用具有(a)到(j)任一項(xiàng)的核酸分子序列或者其至少20個(gè) 核苷酸的片段的探針在嚴(yán)格條件下篩選適宜文庫(kù)得到；和(1)核酸分子，其互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下與(a)或(k)任一項(xiàng)的核酸分子雜交；或者(a)到⑴任一項(xiàng)的互補(bǔ)鏈；或者表達(dá)Solanum bulbocastanum或者馬鈴薯的染色體或連鎖群6的區(qū)段編碼的多 肽，所述區(qū)段與選自表3a或3b的標(biāo)記共分離，并且所述多肽介導(dǎo)對(duì)卵菌門病原體的抗性；其中所述多核苷酸不由Seq. ID NO. :7或9中描述的序列組成。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中至少一種其他抗性蛋白質(zhì)的活性增加。
4.權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)的方法，其中活性由于從頭表達(dá)而增加。
5.權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)的方法，其中Rpi-blb2和/或至少一種其他抗性蛋白質(zhì)的內(nèi) 源活性增加。
6.權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的方法，其包括一個(gè)或多個(gè)下面的步驟a)穩(wěn)定抗性蛋白質(zhì)；b)穩(wěn)定編碼抗性蛋白質(zhì)的mRNA；c)增加抗性蛋白質(zhì)的比活；d)表達(dá)用于抗性蛋白質(zhì)表達(dá)的同源或者人工轉(zhuǎn)錄因子或者增加用于抗性蛋白質(zhì)表達(dá) 的同源或者人工轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)；e)通過(guò)外源誘導(dǎo)因子刺激抗性蛋白質(zhì)活性；f)表達(dá)轉(zhuǎn)基因抗性蛋白質(zhì)編碼基因；和/或g)增加抗性蛋白質(zhì)編碼基因的拷貝數(shù)。
7.權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)的方法，其導(dǎo)致與野生型相比用致病疫霉感染后孢子形成指 數(shù)減小至少30%。
8.編碼Rpi_blb2蛋白質(zhì)的多核苷酸，其包含核酸分子，所述核酸分子選自(a)編碼SEQID NO 2或者4中描述的多肽的至少成熟形式的核酸分子；(b)核酸分子，其包含編碼所述多肽的至少成熟形式的如SEQIDNO :1或3或5或6中 描繪的編碼序列；(c)核酸分子，其核苷酸序列由(a)或者(b)的核苷酸序列的遺傳密碼簡(jiǎn)并產(chǎn)生；(d)核酸分子，其編碼的多肽通過(guò)從(a)到(c)的多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列的 一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的替代、缺失和/或加入從(a)到(c)的多核苷酸編碼的多肽衍生；(e)核酸分子，其編碼的多肽的序列與(a)或(b)的核酸分子編碼的多肽的氨基酸序列 具有70%或以上的同一性；(f)核酸分子，其包含(a)到(e)任一項(xiàng)的核酸分子編碼的多肽的片段或者具有表位的 部分；(g)核酸分子，其包含的多核苷酸具有用表3b中所列引物從核酸文庫(kù)擴(kuò)增的核酸分子 的序列；(h)核酸分子，其編碼(a)到(g)任一項(xiàng)編碼的多肽的以氨基酸1、30、50、100、200、 300,500或1000開始并以氨基酸1267、1000、500、300、200、50、30、或1結(jié)束的片段；(i)包含(a)或(d)任一項(xiàng)的多核苷酸的至少20個(gè)核苷酸的核酸分子；(j)核酸分子，其編碼的多肽被針對(duì)(a)到(h)任一項(xiàng)的核酸分子編碼的多肽產(chǎn)生的單 克隆抗體識(shí)別；(k)核酸分子，其可以通過(guò)用具有(a)到(j)任一項(xiàng)的核酸分子序列或者其至少20個(gè) 核苷酸的片段的探針在嚴(yán)格條件下篩選適宜文庫(kù)得到；和(1)核酸分子，其互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下與(a)或(k)任一項(xiàng)的核酸分子雜交；或者(a)到⑴任一個(gè)的互補(bǔ)鏈；或者所述核酸分子編碼Solanum bulbocastanum或者馬鈴薯的染色體或者連鎖群6的 區(qū)段編碼的多肽，所述區(qū)段與選自表3a或3b的標(biāo)記共分離或者包含所述標(biāo)記的復(fù)制位點(diǎn) 或者雜交位點(diǎn)，并且介導(dǎo)對(duì)卵菌門病原體的抗性；其中所述多核苷酸不由Seq. ID NO. 7或9中描述的序列組成。
9 權(quán)利要求8的多核苷酸或者權(quán)利要求2到7任一項(xiàng)的方法，其中所述標(biāo)記為E40M58、 CT119 或 CT216。
10.權(quán)利要求8到9的多核苷酸，其是DNA或RNA。
11.產(chǎn)生重組載體的方法，其包括將權(quán)利要求8到10任一項(xiàng)的多核苷酸插入到載體中 或者插入所述多核苷酸和另一抗性蛋白質(zhì)。
12.載體，其含有權(quán)利要求8到10任一項(xiàng)的多核苷酸或者包含所述多核苷酸和另一抗 性基因或者所述載體通過(guò)權(quán)利要求11的方法產(chǎn)生。
13.權(quán)利要求12的載體或者權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的方法，其中編碼Rpi_blb2蛋白質(zhì) 或者編碼另一抗性蛋白質(zhì)的多核苷酸有效連接表達(dá)控制序列和/或有效連接編碼轉(zhuǎn)基因表達(dá)調(diào)節(jié)信號(hào)的核酸序列，所述調(diào)節(jié)信號(hào)允許在原核或者真核宿主細(xì)胞中表達(dá)。
14.權(quán)利要求12或13的載體或者權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的方法，其中編碼Rpi_blb2 蛋白質(zhì)或者編碼另一抗性蛋白質(zhì)的多核苷酸有效連接與所述編碼Rpi_blb2蛋白質(zhì)或者編 碼另一抗性蛋白質(zhì)的多核苷酸相同物種來(lái)源的表達(dá)控制序列。
15.產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞的方法，其包括向宿主細(xì)胞導(dǎo)入權(quán)利要求12到14任一項(xiàng)的載體 或者導(dǎo)入所述載體和表達(dá)另一抗性蛋白質(zhì)的載體。
16.宿主細(xì)胞，其通過(guò)權(quán)利要求15的方法產(chǎn)生或者用權(quán)利要求8到10任一項(xiàng)的多核苷 酸或者權(quán)利要求12到14任一項(xiàng)的載體基因工程化或者用所述載體或多核苷酸和表達(dá)另一 抗性蛋白質(zhì)的載體或多核苷酸基因工程化。
17.權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞，其是大腸桿菌、桿狀病毒、農(nóng)桿菌或者植物細(xì)胞。
18.產(chǎn)生Rpi-blb2多肽的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求16或17的宿主細(xì)胞并從培養(yǎng)基 或者宿主細(xì)胞回收所述多核苷酸編碼并通過(guò)所述宿主細(xì)胞表達(dá)的多肽。
19.多肽，具有權(quán)利要求8到10任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的氨基酸序列或者可以通過(guò)權(quán) 利要求18的方法得到，其中所述多肽不由Seq. ID. No. 8和10中所示氨基酸序列組成。
20.多肽，其具有Rpi_blb2活性。
21.抗體，其特異結(jié)合權(quán)利要求19或20的多肽。
22.反義核酸分子，其包含權(quán)利要求8到10任一項(xiàng)的多核苷酸的互補(bǔ)序列。
23.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物、其植物細(xì)胞或者植物組織或部分的方法，該方法包括向所述植 物、其植物組織或者植物細(xì)胞或部分的基因組導(dǎo)入權(quán)利要求8到10任一項(xiàng)的多核苷酸或者 所述多核苷酸和編碼另一抗性蛋白質(zhì)的多核苷酸，或者權(quán)利要求12到14任一項(xiàng)的載體。
24.植物細(xì)胞，其包含權(quán)利要求8到10任一項(xiàng)的多核苷酸、權(quán)利要求12到14任一項(xiàng)的 載體或者可以通過(guò)權(quán)利要求23的方法得到。
25.轉(zhuǎn)基因植物或其植物組織或部分，其包含權(quán)利要求24的植物細(xì)胞。
26.產(chǎn)生抗卵菌門植物病原體的植物或其部分的方法，其包括步驟在所述植物或其 部分中表達(dá)權(quán)利要求19或20的多肽和另一抗性蛋白質(zhì)。
27.產(chǎn)生具有對(duì)疫霉具有持久抗性的植物或其部分的方法，該方法包括在植物或者其 部分中共表達(dá)Rpi_blb2和Rpi-blb2蛋白質(zhì)或者權(quán)利要求19或20的多肽。
28.權(quán)利要求25的或者根據(jù)權(quán)利要求26或27產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物或者植物組織，當(dāng)存 在所述多核苷酸或者載體時(shí)所述轉(zhuǎn)基因植物或植物組織抗卵菌門的植物病原體。
29.權(quán)利要求25的轉(zhuǎn)基因植物或植物組織的可收獲部分，其包含權(quán)利要求24的植物細(xì)胞。
30.權(quán)利要求25的轉(zhuǎn)基因植物或植物組織的繁殖材料，其包含權(quán)利要求24的植物細(xì) 胞，所述細(xì)胞具有增加的Rpi_blb2活性。
31.權(quán)利要求8到10任一項(xiàng)的多核苷酸、權(quán)利要求12到14任一項(xiàng)的載體，或者權(quán)利要 求19或20的多肽的用途，用于產(chǎn)生抗卵菌門植物病原體的植物或植物組織、植物器官或植 物細(xì)胞或植物部分。
32.鑒定刺激針對(duì)卵菌門植物病原體的抗性的化合物的方法，其包括a)在細(xì)胞培養(yǎng)條件下將表達(dá)權(quán)利要求19或20的多肽或者其mRNA的細(xì)胞與候選化合 物接觸；b)測(cè)定所述多肽或者所述mRNA的表達(dá)的增加；c)比較不存在所述候選化合物時(shí)，做出的對(duì)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)答的表達(dá)水平；從而相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)增 加的表達(dá)表明所述化合物刺激抗性。
33.權(quán)利要求8到10任一項(xiàng)的多核苷酸、權(quán)利要求12到14任一項(xiàng)的載體、權(quán)利要求 19或20的多肽或者權(quán)利要求21的抗體的用途，用于鑒定和/或產(chǎn)生激活或者刺激針對(duì)卵 菌門植物病原體的植物抗性的化合物。
34.診斷組合物，其包含權(quán)利要求8到10任一項(xiàng)的多核苷酸、權(quán)利要求12到14任一項(xiàng) 的載體、權(quán)利要求21的抗體或者權(quán)利要求22的反義核酸和任選適宜的檢測(cè)方法。
35.試劑盒，其包含權(quán)利要求8到12任一項(xiàng)的多核苷酸、權(quán)利要求12到14任一項(xiàng)的 載體、權(quán)利要求16或17的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求19或20的多肽、權(quán)利要求22的反義核酸、 權(quán)利要求21的抗體、權(quán)利要求24的植物細(xì)胞、權(quán)利要求25的植物或植物組織、權(quán)利要求29 的可收獲部分、或權(quán)利要求30的繁殖材料和任選編碼Rpi-blb的多核苷酸、Rpi-blb蛋白 質(zhì)或者針對(duì)Rpi-blb的抗體。
36.產(chǎn)生提供權(quán)利要求8到10任一項(xiàng)的多核苷酸、權(quán)利要求12到14任一項(xiàng)的載體或 權(quán)利要求19或20的多肽的植物作物保護(hù)劑的方法，其包括權(quán)利要求32的方法的步驟；和 以農(nóng)業(yè)組合物可以應(yīng)用的形式配制權(quán)利要求8到10任一項(xiàng)的多核苷酸、權(quán)利要求12或14 的載體或權(quán)利要求19或20的多肽或權(quán)利要求32的步驟(c)中鑒定的化合物。
37.權(quán)利要求1到36任一項(xiàng)的載體、宿主細(xì)胞、植物細(xì)胞、植物組織、植物、用途、試劑盒 或方法，其中所述植物病原體是腐霉目(Pythiales)或者Peronosperales。
38.權(quán)利要求1到37任一項(xiàng)的載體、宿主細(xì)胞、植物細(xì)胞、植物組織、植物、用途、試劑盒 或方法，其中所述植物病原體是致病疫霉、紅腐疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉、寄生疫霉煙草致 病變種、萵苣盤梗霉、Peronospora tabaci或者葡萄生單軸霉。
39.權(quán)利要求1到38任一項(xiàng)的載體、宿主細(xì)胞、植物細(xì)胞、植物組織、植物、用途、試劑盒 或方法，其中所述抗性蛋白質(zhì)的特征是P-環(huán)和NBS結(jié)構(gòu)域。
40.權(quán)利要求2到39任一項(xiàng)的載體、宿主細(xì)胞、植物細(xì)胞、植物組織、植物、用途、試 劑盒或方法，其中另一抗性基因是編碼Rpi-blb、RU R-ber、RpiU Rpi_blb3、Rpi-ABPTU Rpi-mcd、R2、R3a 和 R3b、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、Rll、Ph_l、Ph_2 和 / 或 Ph_3 的基因。
41.權(quán)利要求2到40任一項(xiàng)的載體、宿主細(xì)胞、植物細(xì)胞、植物組織、植物、用途、試劑盒 或方法，其中另一抗性蛋白質(zhì)是Rpi-blb蛋白質(zhì)。
42.權(quán)利要求1到41任一項(xiàng)的載體、宿主細(xì)胞、植物細(xì)胞、植物組織、植物、用途、試劑 盒或方法，其中所述植物、植物細(xì)胞或植物組織選自根據(jù)Systema Naturae 2000，Brands, S. J，AmSterdam的荇菜科、茄科、厚殼樹科、核果茄科、Goetzeaceae、旋花科、菟絲子科、花惹 科和田基麻科構(gòu)成的組或者具有其來(lái)源。
43.權(quán)利要求1到42任一項(xiàng)的載體、宿主細(xì)胞、植物細(xì)胞、植物組織、植物、用途、 試劑盒或方法，其中所述多核苷酸、多肽、植物細(xì)胞、宿主細(xì)胞、植物組織或植物來(lái)自 前禾斗，優(yōu)選來(lái)自 S. bulbocastanum、馬鈴薯(S. tuberosum)、番前(S. Iycopersicum 或 Lycopersiconlycopersicum (L.) Karsten ex Farwel 1))、矮牽牛、樹番前(S. betaceum)、 pear melon (S. muricatum)或前子(S. melongena) 0
全文摘要
本發(fā)明涉及增加植物，尤其茄科(Solanaceae)植物，優(yōu)選馬鈴薯和番茄對(duì)卵菌門(Oomycetes)的植物病原體的抗性的新方法，所述方法包括增加本發(fā)明多肽的活性。本發(fā)明還涉及多核苷酸和包含這些多核苷酸的載體。本發(fā)明還涉及相應(yīng)的載體、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物和來(lái)自它們的轉(zhuǎn)基因繁殖材料，涉及產(chǎn)生它們的方法，還涉及它們用于產(chǎn)生糧食、飼料、種子、藥物或者精細(xì)化學(xué)品的用途。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102002503SQ20101029365
公開日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2004年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月11日
發(fā)明者E·A·G·范德福森, J·J·H·M·阿萊弗斯, M·W·M·穆斯肯斯 申請(qǐng)人:植物育種農(nóng)業(yè)研究所有限公司