專利名稱：一種新型的選擇標記及其在植物遺傳轉化中的應用的制作方法
一種新型的選擇標記及其在植物遺傳轉化中的應用技術領域
本發(fā)明屬生物技術領域，確切地說是一種安全選擇標記及其在獲得轉基因植株 中的應用。
背景技術：
現(xiàn)階段轉基因技術效率較低，外源基因整合到目標生物基因組中的頻率通常為 千分之幾至百萬分之幾。因此，目的基因的導入通常需要串聯(lián)易于識別的標記基因用于 篩選轉化子，這種標記基因又稱為“選擇標記”或“篩選標記”，目前廣泛使用的選 擇標記基因常常是一些顯性基因編碼抗生素或除草劑抗性基因(Yoder and Goldsbrough, 1994)?？股鼗虺輨┠軞⑺婪寝D基因細胞，但抗性選擇標記基因中也存在著一些問 題(1)抗生素或除草劑的使用常常對轉化細胞的發(fā)育和分化產生負面的影響，可能會 延遲不定芽的分化；( 對于不敏感的品種，這些選擇試劑不能很好的區(qū)分轉化和非轉 化細胞，因此不能起到應有的作用CEbinuma etal.，1997) ； (3)選擇標記因常常與目的基 因一起整合到植物基因組中，對轉基因植株產生一系列不良的影響。大多數(shù)選擇標記基 因為組成型表達這樣消耗了植株大量的生物能，對轉基因植株的生長和發(fā)育有負面的影 響；(4)從健康及安全性角度考慮，抗性選擇標記基因表達產物在食物中存在可能被轉 移到人或動物的腸道寄生菌中使其產生耐藥性，從而降低或喪失某種抗生素的治療作用 (ZechendorfB.1994.12 870 87 。若選擇性標記基因通過某種渠道發(fā)生漂流，可能導 致生態(tài)平衡被破壞、自然生物種群發(fā)生改變(Dale PJ. 1992.Plant PhysioLlOO 13 15)。
為了避免上述問題的發(fā)生，尋求安全的選擇標記基因成為轉基因技術研究的熱 點。利用安全選擇標記基因建立的轉化系統(tǒng)通常不是將非轉化細胞殺死，而是使轉化細 胞處于某種有利的代謝或發(fā)育條件，從而篩選出轉化體。這種方法的主要優(yōu)點在于選擇 劑無毒副作用，且在多數(shù)情況下有利于轉化體的再生，從而提高轉化效率。目前，主要 的安全選擇標記有下述四類
(1)有關糖代謝途徑的基因
已用于植物轉化的此類標記基因有6-磷酸甘露糖異構酶(phosphormnnaoes isomerase，PMI)基因，木糖異構酶(xylose isomeasre，XYIA)基因以及核糖操縱子。它們的作用原理基本相同，都是使在含有碳源的培養(yǎng)基上只有轉化細胞能正常生長，而非 轉化細胞將被淘汰悼。
(2)代謝產物選擇標記
代謝產物選擇標記是一種新的篩選標記，這種標記是把外源的功能基因轉入受 體并在受體中得到表達，從而利用其特有的代謝產物進行篩選。
(3)耐脅迫基因
此類標記基因和傳統(tǒng)的抗性標記基因的作用機制相似，屬于負選擇標記基因。 其編碼產物可催化對細胞生長有毒的或有脅迫的化合物轉變成無毒且對生長有益的化合 物，或保護細胞不受逆境傷害，從而使轉化細胞能在有毒或脅迫條件下生長，而非殺死轉化細胞。近年來，許多非生物抗逆基因，如抗鹽堿、干旱、低溫等基因相繼被發(fā)現(xiàn)并 克降，其中耐鹽、耐旱基因研究較多，已分離克隆了幾十種基因。
(4)熒光標記基因
20世紀60年代，Shimomura等首次從多管水目屬(Aequorea Victoria)中分離純化出一種熒光物質，并將其定性為蛋白質，稱之為綠色熒光蛋白(green fluorescent proteins, GFPs),在一定波長的光子激發(fā)下，會發(fā)出強烈的熒光。其熒光的發(fā)生無需底 物和輔助因子，表達產物對細胞無毒害作用，不影響細胞的正常生長和功能(趙華等， 2003)。此外，還有一些GFP基因的突變體，包括黃色熒光蛋白基因(YFP)，青色熒光 蛋白基因(CFP)和紅色熒光蛋白基因(RFP)等(Bajaj mdMohanty，2005)。
近年來，世界大豆需求量快速增長，然而大豆產量與品質受到干旱的極大制 約，因而大豆抗旱育種成了大豆育種工作中的重點，研究表明大量逆境應答基因的表 達為植物獲得抗逆性所必需(Gong etal.，PNAS，99 11507-11512)。 揭示大豆對 干旱的生理響應、適應性和抗旱遺傳機制有助于從生物節(jié)水途徑上提高大豆生產水 平。研究基因干旱誘導表達的特異性，對揭示植物的發(fā)育以及植物與干旱環(huán)境互作的 機制具有重要意義。隨著植物生理的抗旱分子生物學研究，人們逐漸確定了與抗旱性 有關的重要基因，并進行了基因定位研究，取得了一定的進展。研究證實大豆Δ l-pyrroline-5-carboxylate synthetase(P5CS)基因的表達具有干旱誘導的特異性，該基因在 積累脯氨酸以降低滲透脅迫、在正常和脅迫條件下反饋調控植物中脯氨酸合成水平等方 面均起著重要作用。
“Ti質?！笔歉┺r桿菌(Agrobacterium tumefaciens)中的一種環(huán)狀雙鏈DNA 分子，一般具有 T-DNA 區(qū)(transferred-DNA regions)、毒區(qū)(virulence region)、質粒復制 起始區(qū)(origin of replication)。 “T_DNA”是指農桿菌中Ti質粒上一段能從質粒上轉移并整合到寄主植物基因組中的DNA區(qū)。T-DNA兩端各有一段長約25bp的邊界序列，分 別稱為左邊界(LB)和右邊界(RB)。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供適合于大多數(shù)植物培育，安全、高效的一種安全選擇標 記，利用其篩選出耐旱的，同時轉入了目的基因的植株。
一種安全選擇標記，筒稱DP-P5CS，它是由干旱誘導型啟動子DP和抗旱基因 P5CS組成；
所述的干旱誘導型啟動子DP，其堿基序列如SEQIDNo.2所示，它來源于耐 鹽堿大豆HJ-I，抗旱基因P5CS其堿基序列如SEQ ID No.l所示；
一種安全選擇標記的制備方法，它包括
1)人工合成
引物1 CGCCGAGCTCGAACTAATGCTTAACCATGCC
引物2: CTACAAGGATCTGTGTTCTCCATATTCTGACCAAACAGACTGTG
引物 3 ACACAGTCTGTTTGGTCAGAATATGGAGAACACAGATCCTTGTAG
引物4: CCGCTCGAGTCATATAGAAAGGTCTCTGTGAGTG
2)提取的大豆HJ-I基因組DNA作為模板，禾Ij用引物1和引物2，擴增干旱誘導型啟動子DP片段；
幻利用Hoagland基礎培養(yǎng)液水培法水培耐鹽堿大豆HJ-I，當大豆幼苗長出第一 片真葉時，用2 % PEG脅迫處理48h收集根和葉，以TIANGEN RNAprep pure Plant Kit提 取RNA反轉錄成的cDNA作為模板，禾Ij用引物3和引物4，將基因cDNA擴增出來，得 抗旱基因GmP5CS片段；
4)利用引物2和引物3，以步驟2)、3)的PCR產物為模板，進行融合片段 DP-P5CS的全長擴增。
一種安全選擇標記植物表達載體，是植物表達載體中插入了一種安全選擇標記 DP-P5CS ；
所述的表達載體為pCAMBIA1301。
一種植物轉基因的方法，包括
1)將目的基因插入載體pCAMBIA1301-DP_P5CS中；所述的目的基因，包括抗病基因、品質改良基因、抗蟲基因等；
2)利用農桿菌介導的植物表達載體轉化植物，獲得抗旱的轉基因株系；
3)檢測轉化植株，獲得含有目的基因和抗旱基因的轉基因植株；
4)種植轉化植株自交后代株系，培育出具有安全標記的轉基因植株。
本發(fā)明通過對Solexa測序數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)HJ-I大豆P5CS基因的表達具 有干旱誘導的特異性，研究表明該基因在積累脯氨酸以降低滲透脅迫、在正常和脅迫條 件下反饋調控植物中脯氨酸合成水平等方面均起著重要作用；用PCR方法克隆該基因 的啟動子DP和P5CS基因，獲得了安全選擇標記DP-P5CS ；通過含有該安全選擇標記 DP-P5CS的植物表達載體，將目的基因轉化植物中，通過干旱脅迫篩選的植物轉基因方 法，適合于大多數(shù)植物的遺傳轉化，并且安全、高效，解決了人們對于抗性選擇標記基 因安全性擔憂的問題，得到的轉基因植株不僅發(fā)揮了目的基因功效，還具有耐干旱的能 力，具有重要意義和誘人的前景，是生產安全選擇標記轉基因植物的好途徑。


圖1是1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增得到的啟動子1608bp片段產物。
圖2是1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增得到的基因2148bp片段產物。
圖3是瓊脂糖凝膠電泳檢測融合PCR擴增得到的啟動子及基因全長3756bp 片段產物。
圖4是用Xho I和Sac I酶切載體pCAMBIA1301后1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。
圖5是用Xho I和Sac I酶切載體pCAMBIA1301-DP_P5CS后1 %瓊脂糖凝膠電泳結果。
圖6是本發(fā)明所構建的表達載體pCAMBIA1301-DP_P5CS的T-DNA區(qū)的圖譜。
圖7是干旱處理的轉基因大豆植株圖片。
圖8是部分轉基因株系的Southern檢測結果。
圖9是部分轉基因株系的RT-PCR檢測結果。
圖10是部分轉基因株系的GUS檢測結果。
具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，測序由深圳華大基因完 成，所用引物、PCR試劑盒、載體構建過程中的核酸內切酶及平端化所用的T4DNA聚合 酶均購自于寶生物工程有限公司，連接試劑盒來自Invitrogen公司，方法均參照試劑盒提 供的方法進行。實驗中所用的載體PCAMBIA1301來自實驗室保存。
實施例1安全選擇標記啟動子及基因的克隆(通過融合PCR克隆啟動子及基因 全長片段)
DSolexa測序數(shù)據(jù)選擇基因
①植物材料及處理
植物材料為耐鹽堿大豆HJ-I，利用Hoagland基礎培養(yǎng)液水培法水培大豆，當大 豆幼苗長出第一片真葉時用2% PEG脅迫處理。干旱處理的材料和對照材料在脅迫處理 4Sh收集根和葉，對每個樣品取樣三份，采樣完畢，樣品用新的錫箔紙包好立即用液氮冷 凍保存于_80°C ；
②Sokxa測序和數(shù)據(jù)分析
Solexa測序由深圳華大基因完成；分析根葉中差異表達的基因，找出根葉共同 表達的基因GmP5CS，研究證實該基因在積累脯氨酸以降低滲透脅迫、在正常和脅迫條 件下反饋調控植物中脯氨酸合成水平等方面均起著重要作用，從該基因翻譯起始位點前 1.0-2Kb中選擇候選啟動子進而對其進行研究；
2)設計合成克隆啟動子DP及基因GmP5CS所需引物
啟動子DP引物
引物1 (上游)5，-CgCC GAGCTC GAACTAATGCTTAACCATGCC-3’
引物2 (下游)5，-ctacaaggatctgtgttctccat ATTCTGACCAAACAGACTGTG-3，
基因GmP5CS 引物
弓I 物 3 (上 游)5， -acacagtctgtttggtcagaat ATGGAGAACACAGATCCTTGTAG-3 ’
引物4 (下游)5，-CCg CTCGAG TCATATAGAAAGGTCTCTGTGAGTG-3，
弓丨物1禾Π 4中序列GAGCTC為Sac I的酶切位點，CgCC為保護堿基；CTCGAG為Xho I的限制性識別位點，CCg為保護堿基；
3)提取的大豆HJ-I基因組DNA作為模板，利用引物1和引物2 (其中帶下劃線 部分的序列為啟動子序列)，擴增干旱誘導型啟動子DP片段；
4)利用Hoagland基礎培養(yǎng)液水培法水培耐鹽堿大豆HJ-I，當大豆幼苗長出第一 片真葉時，用2 % PEG脅迫處理48h收集根和葉，以TIANGEN RNAprep pure Plant Kit提 取RNA反轉錄成的cDNA作為模板，利用引物3和引物4(其中帶下劃線部分的序列為基 因序列)，將基因cDNA擴增出來，得抗旱基因GmP5CS片段；
5)利用引物1和引物4，以步驟3)、4)的PCR產物為模板，進行融合片段 DP-P5CS的全長擴增。
擴增體系和程序為
2 X Taq Mix 25 μ 權利要求
1.一種安全選擇標記，筒稱DP-P5CS，它是由干旱誘導型啟動子DP和抗旱基因 P5CS組成。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種安全選擇標記，其特征在于所述的干旱誘導型啟動 子DP，其堿基序列如SEQIDNo.2所示，它來源于耐鹽堿大豆HJ-1，抗旱基因P5CS 其堿基序列如SEQ ID No.l所示。
3.一種安全選擇標記的制備方法，它包括1)人工合成弓丨物 1 CGCCGAGCTCGAACTAATGCTTAACCATGCC引物 2 CTACAAGGATCTGTGTTCTCCATATTCTGACCAAACAGACTGTG引物 3 ACACAGTCTGTTTGGTCAGAATATGGAGAACACAGATCCTTGTAG引物 4 CCGCTCGAGTCATATAGAAAGGTCTCTGTGAGTG2)提取的大豆HJ-I基因組DNA作為模板，利用引物1和引物2，擴增干旱誘導型啟 動子DP片段；3)利用Hoagland基礎培養(yǎng)液水培法水培耐鹽堿大豆HJ-I，當大豆幼苗長出第一片真 葉時，用2 % PEG脅迫處理48h收集根和葉，以TIANGEN RNAprep pure Plant Kit提取 RNA反轉錄成的cDNA作為模板，利用引物3和引物4，將基因cDNA擴增出來，得抗旱 基因GmP5CS片段；4)利用引物2和引物3，以步驟2)、3)的PCR產物為模板，進行融合片段DP-P5CS 的全長擴增。
4.一種安全選擇標記植物表達載體，是植物表達載體中插入了一種安全選擇標記 DP-P5CS。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種安全選擇標記植物表達載體，其特征在于所述的表 達載體為pCAMBIA1301。
6.—種植物轉基因的方法，包括1)將目的基因插入載體PCAMBIA1301-DP-P5CS中；所述的目的基因，包括抗病 基因、品質改良基因、抗蟲基因等；2)利用農桿菌介導的植物表達載體轉化植物，產生一種安全選擇標記轉化植株；3)檢測轉化植株，獲得含有目的基因和抗旱基因的轉基因植株；4)種植轉化植株自交后代株系，并培育具有安全標記的轉基因植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型的選擇標記及其在植物遺傳轉化中的應用，用PCR方法克隆P5CS基因及其啟動子DP，獲得了安全選擇標記DP-P5CS；通過含有該安全選擇標記DP-P5CS的植物表達載體，將目的基因轉化植物中，通過干旱脅迫篩選的轉基因方法，適合于大多數(shù)植物的遺傳轉化，并且安全、高效，解決了人們對于抗性選擇標記基因安全性擔憂的問題，得到的轉基因植株不僅發(fā)揮了目的基因功效，還具有耐干旱的能力，具有重要意義和誘人的前景，是生產安全選擇標記轉基因植物的好途徑。
文檔編號C12N15/10GK102021166SQ201010296258
公開日2011年4月20日 申請日期2010年9月29日 優(yōu)先權日2010年9月29日
發(fā)明者李海燕, 王南, 范秀朵, 陳靜 申請人:吉林農業(yè)大學