專利名稱：一種地衣芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種菌株及其應(yīng)用，具體涉及一種地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)及其在生產(chǎn)白酒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，國內(nèi)有關(guān)研究單位與生產(chǎn)廠家，對醬香型白酒的微量成分、生產(chǎn)工藝進(jìn)行了大量的研究與分析，取得了一些有益的進(jìn)展，但是對于醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的本質(zhì)及醬香產(chǎn)生所必須的微生物種類尚不清楚；而從其生理生化角度，對于微生物在醬香物質(zhì)產(chǎn)生過程中產(chǎn)生何種酶及其具體作用及各種微生物之間存在怎樣的相互協(xié)同作用等方面亦一直沒有確切的解釋。濃醬兼香型白云邊酒吸取了醬香型白酒的工藝特點(diǎn)——高溫曲、高溫堆積和濃香型白酒的工藝特點(diǎn)——混蒸續(xù)渣、泥窖發(fā)酵，把兩者的生產(chǎn)工藝創(chuàng)造性地結(jié)合在一起，形成了其獨(dú)特的生產(chǎn)工藝。兼香型白酒的主體香主要來自高溫大曲，其主體香成分一直是白酒行業(yè)的研究熱點(diǎn)。到目前為止，關(guān)于醬香型白酒和兼香型白酒的特征香氣成分，在學(xué)術(shù)界仍未有定論。但可以確定的是，這些香味物質(zhì)的產(chǎn)生、風(fēng)格的形成，是美拉德反應(yīng)的結(jié)果，而高溫大曲中的產(chǎn)香功能菌所代謝的生物酶對美拉德反應(yīng)起了較強(qiáng)的催化作用。因此，從產(chǎn)香細(xì)菌的角度來分析白酒的主要呈香物質(zhì)及其形成機(jī)制，是非常必要的。盡管通過氣相色譜分離等手段可檢測高溫大曲中的香氣成分，但仍存在著香味成分的形成是由哪些微生物參與以及哪一種微生物起著主導(dǎo)作用等問題。白云邊高溫大曲中微生物的數(shù)量大，種類多，且含有數(shù)量巨大的嗜熱微生物，其中以耐高溫的芽孢桿菌為最。 然而目前還沒有報(bào)道關(guān)于分離醬香高溫大曲中有益于醬香風(fēng)味產(chǎn)生的功能微生物。中國專利CN 101215538公開了一株地衣芽孢桿菌及其應(yīng)用。該地衣芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌(BACILLUS LICHENIFORMIS)BL57CGMCC Ns . 2277，該菌株可以利用含纖維素的工農(nóng)業(yè)廢棄物為原料，如植物秸稈、葉片、其它農(nóng)業(yè)廢棄組織、酒糟等，將這些原料其中的纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖。中國專利CN1390942公開了一種編碼β _1，3_1，4葡聚糖酶的基因和含有前述基因的地衣芽孢桿菌菌株(Bacillus licheniformis)EGW039。該菌株所產(chǎn)生的β-1，3-1，4-葡聚糖酶對β-葡聚糖的β-1，3和β _1，4鍵都有高效的分解作用，能提高大麥、小麥等飼料糧利用率，節(jié)約飼料糧。此外，在啤酒生產(chǎn)中降低啤酒生產(chǎn)中過濾的困難，提高原料利用率。中國專利CN1369552公開了一種微生物復(fù)合菌劑及使用其制成的微生物發(fā)酵劑和肥料，采用枯草芽孢桿菌35-45%、地衣芽孢桿菌25-35%、嗜熱脂肪芽孢桿菌25-35%作為菌種，以上菌種分別經(jīng)接種、一級菌種培養(yǎng)，使菌數(shù)含量達(dá)108個(gè)/ml，然后再按上述菌種配比混合并經(jīng)二級菌種培養(yǎng)，使菌數(shù)含量達(dá)5-9X 109個(gè)/ml，即得復(fù)合菌劑。 然而該文獻(xiàn)公開的是含有地衣芽孢桿菌及其它兩種芽孢桿菌的復(fù)合菌劑，且僅僅用來將池塘泥、草炭土、雞畜糞、酒糟、粉煤灰、作物秸稈、城市廢棄物等作為基料發(fā)酵生產(chǎn)微生物肥料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種嗜熱芽孢桿菌，該菌株適用于兼香型及醬香型固態(tài)法白酒發(fā)酵生產(chǎn)，能夠?yàn)樯a(chǎn)用高溫大曲增香，提升濃醬兼香型白酒的典型風(fēng)味，經(jīng)濟(jì)環(huán)保。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過大量試驗(yàn)篩選，最終從白云邊酒廠的高溫大曲中，篩選分離得到適應(yīng)性良好、能在55°C _65°C高溫環(huán)境下生長良好的地衣芽孢桿菌 (Bacilluslicheniformis)BG05菌株，并于2009年12月10日保藏于湖北武漢武昌珞珈山武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC N0.M2010251。本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)BG05菌株CCTCC NO. M2010251 具有以下培養(yǎng)特征牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基50°C培養(yǎng)24h，菌落呈圓形，灰色，凸起，邊緣有細(xì)小絨毛，表面光滑，濕潤，粘稠不易挑。菌落大小為(0.3-0. 5) cmX (0.3-0. 5) cm，生長速度快。葡萄糖培養(yǎng)基50°C培養(yǎng)24h，菌落呈山丘狀，濕潤，有大量粘液，表面有光澤，無皺紋，邊緣缺刻至明顯，缺刻呈羽毛狀。菌落大小為(0. 4-0. 5) cmX (0. 4-0. 5) cm，菌落生長極為迅速。本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)BG05菌株CCTCC NO. M2010251 具有以下形態(tài)特征于1000倍顯微鏡觀察嗜熱芽孢桿菌的菌體形態(tài)，菌株形態(tài)特征為菌體桿狀，單生，大小約0. 87 X 1. 43 μ m(平均)，復(fù)紅染色均勻，未見不著色脂肪粒，抗酸復(fù)紅染色陽性， 芽孢紅色。孢囊不膨大，芽孢橢圓形，中生或次中生。本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)BG05菌株CCTCC NO. M2010251 具有以下生物學(xué)特性嗜熱芽孢桿菌BG05的生長溫度為20°C 65°C，最適生長溫度為40°C 50°C，在 PH2. 0 9. 0的范圍內(nèi)均能生長。本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)BG05菌株CCTCC NO. M2010251
在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基和葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基50°C培養(yǎng)24h，連續(xù)傳代數(shù)代培養(yǎng)，其培養(yǎng)特征及形態(tài)特征均無明顯變化，該菌株的生物學(xué)性狀基本穩(wěn)定。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株 CCTCCN0. M2010251在生產(chǎn)濃醬兼香型白酒中的用途。本發(fā)明涉及的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株CCTCC NO. M2010251能夠耐高溫，以麩皮作為發(fā)酵基質(zhì)高溫培養(yǎng)可獲得香味突出的發(fā)酵物，發(fā)酵物中游離氨基酸含量較高。將其制成人工大曲投入釀造生產(chǎn)可提高經(jīng)濟(jì)效益。具體表現(xiàn)為如下優(yōu)點(diǎn)1)根據(jù)實(shí)施例2表1的溫度耐受性實(shí)驗(yàn)可以看出，實(shí)驗(yàn)菌在50°C作用生長情況良好，在55°C下仍能保持一定的生長量，在60°C時(shí)菌株生長速度受到抑制。這說明本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株溫度耐受性強(qiáng)，完全適合工業(yè)上濃醬兼香型白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用；2)根據(jù)實(shí)施例3表2的菌株大豆發(fā)酵實(shí)驗(yàn)可以看出，實(shí)驗(yàn)組在地衣芽孢桿菌 (Bacilluslicheniformis)BG05菌株的作用下，大豆隨發(fā)酵溫度的上升逐漸增香，在55°C高溫條件下香味濃郁，發(fā)酵完畢，其吸光度達(dá)到0.693。這說明本發(fā)明的地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)BG05菌株溫度耐受性強(qiáng)，而且在55°C以下隨著溫度的升高，增香能力越強(qiáng)。3)根據(jù)實(shí)施例4表3、表4的單菌發(fā)酵麥麩產(chǎn)游離氨基酸的含量測定試驗(yàn)中可以看出，試驗(yàn)組和對照組在氨基酸種類上沒有差別；然而從含量上看，試驗(yàn)組發(fā)酵分解得到的各類氨基酸含量大多高于對照組。這表明，本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株發(fā)酵代謝分泌的酶類分解蛋白質(zhì)的能力較強(qiáng)。4)根據(jù)實(shí)施例5表5的菌株產(chǎn)香培養(yǎng)基的選擇實(shí)驗(yàn)可以看出，試驗(yàn)菌株在麩皮浸出汁中發(fā)酵產(chǎn)香效果最好，香味濃郁，其次為麩皮固體培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(Bacillus lichenifOrmis)BG05菌株在以麩皮為底物的發(fā)酵物中產(chǎn)香效果最好，液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)香效果優(yōu)于固態(tài)發(fā)酵。


圖1為本發(fā)明所述的地衣芽孢桿菌(Bacillus 膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上的菌落2為本發(fā)明所述的地衣芽孢桿菌(Bacillus 糖瓊脂培養(yǎng)基上的菌落3為本發(fā)明所述的地衣芽孢桿菌(Bacillus 倍顯微鏡菌體形態(tài)圖
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步作描述，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。實(shí)施例1地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株的培養(yǎng)從白云邊酒廠生產(chǎn)用高溫大曲中篩選分離得到適應(yīng)性良好、能在55°C -65°C高溫環(huán)境下生長良好的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株，并于2009年12 月10日保藏于湖北武漢武昌珞珈山武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO. M2010251。該菌株的保藏采用牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaC15g，瓊脂 20g,自來水 lOOOmL，pH7. 2-7. 4，121°C滅菌 20min。該菌株的培養(yǎng)采用以下兩種培養(yǎng)基⑴牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏3g，蛋白胨 10g，NaC15g，瓊脂 20g，自來水 IOOOmL,pH7. 2-7. 4，121°C滅菌 20min ； (2) LB 培養(yǎng)基蛋白胨 lg，酵母浸出汁 0. 5g, NaC llg，水 IOOmL, ρΗ7· 0，121°C滅菌 20min。根據(jù)培養(yǎng)基不同，該菌株的培養(yǎng)方式可選用兩種⑴液體培養(yǎng)制種子液把菌株接種于LB培養(yǎng)基中，在40°C溫度下，150rpm搖瓶培養(yǎng)16h ；⑵固體培養(yǎng)活化菌株接種于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，于50°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h。實(shí)施例2地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株的溫度耐受性實(shí)驗(yàn)將活化后的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株培養(yǎng)液按無菌操
licheniformis)BG05 菌株在牛肉 licheniformis)BG05 菌株在葡萄 licheniformis)BG05 菌株在 1000作法分別接種到裝有IOOmL實(shí)施例1所述的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角瓶中，將接種后的培養(yǎng)管置于搖床上，分別放置在35 V、40°C、45 V、50°C、55°C、60°C下，160rpm振蕩培養(yǎng)24h后，測定600nm波長下的OD值，對濃度大的菌懸液用未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后測定，使其OD值在0. 10 0. 65以內(nèi)，經(jīng)稀釋后測得的OD值乘以稀釋倍數(shù)，即為培養(yǎng)液實(shí)際的OD值。從表1中可以看出，實(shí)驗(yàn)菌地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)BG05在50°C 作用生長情況良好，在55°C下仍能保持一定的生長量，在60°C時(shí)菌株生長速度受到抑制。 這說明本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(Baci 1 Ius licheniformis) BG05菌株溫度耐受性強(qiáng)，完全適合工業(yè)上濃醬兼香型白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用。表1不同溫度下吸光度值
權(quán)利要求
1.地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)BG05 菌株 CCTCC N0.M2010251。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于它的培養(yǎng)特征為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基50°C培養(yǎng)24h，菌落呈圓形，灰色，凸起，邊緣有細(xì)小絨毛，表面光滑，濕潤，粘稠不易挑，菌落大小為(0. 3-0. 5) cmX (0. 3-0. 5) cm ；葡萄糖培養(yǎng)基50°C培養(yǎng)24h，菌落呈山丘狀，濕潤，有大量粘液，表面有光澤，無皺紋， 邊緣缺刻至明顯，缺刻呈羽毛狀，菌落大小為(0. 4-0. 5) cmX (0. 4-0. 5) cm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于于1000倍顯微鏡觀察得到的形態(tài)特征為菌體桿狀，單生，平均大小為0. 87 X 1. 43 μ m,復(fù)紅染色均勻，未見不著色脂肪粒，抗酸復(fù)紅染色陽性，芽孢紅色，孢囊不膨大，芽孢橢圓形，中生或次中生。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于它的生長溫度為20°C 65°C，最適生長溫度為40°C 50°C，在pH2. 0 9. 0的范圍內(nèi)均能生長。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的菌株，其特征在于它的生長溫度為40°C 50°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基或葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基50°C培養(yǎng)24h，連續(xù)傳代數(shù)代培養(yǎng)，它的培養(yǎng)特征和形態(tài)特征均無明顯變化。
7.權(quán)利要求1所述的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)BG05菌株CCTCC NO. M2010251在生產(chǎn)濃醬兼香型白酒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)BG05菌株CCTCC NO.M2010251，及其在生產(chǎn)濃醬兼香型白酒中的應(yīng)用。本發(fā)明的菌株最適pH7.0左右，最適生長溫度為40℃～50℃，以大豆或麩皮為發(fā)酵基質(zhì)能夠產(chǎn)香，發(fā)酵底物中游離氨基酸含量較高，具有較好的耐熱性能，適用于兼香型及醬香型固態(tài)法白酒發(fā)酵生產(chǎn)，能夠?yàn)樯a(chǎn)用高溫大曲增香，提升濃醬兼香型白酒的典型風(fēng)味，經(jīng)濟(jì)環(huán)保。
文檔編號C12R1/10GK102168029SQ20101029649
公開日2011年8月31日 申請日期2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月29日
發(fā)明者張明春, 曹敬華, 楊團(tuán)元, 熊小毛, 陳茂彬 申請人:湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司