專利名稱：一種沙棘銅/鋅sod的制備與修飾過程同步完成的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶的制備與修飾過程同步完成的方法，尤其涉及一種沙棘銅/鋅 SOD的制備與修飾過程同步完成的方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶是一類清除自由基的蛋白酶，能夠平衡機(jī)體的氧自由基，從而避 免當(dāng)體內(nèi)超氧陰離子自由基濃度過高時(shí)引起的不良反應(yīng)，是生物體防御氧毒性的關(guān)鍵。在 抗防輻射損傷、預(yù)防衰老、治療自身免疫性疾病、防治各種炎癥和腫瘤以及再灌流損傷等方 面也具有重要作用。SOD基于金屬輔基不同，可分為銅鋅超氧化物歧化酶(銅/鋅SOD)、錳超氧化物歧 化酶、鐵超氧化物歧化酶三種類型。銅鋅超氧化物歧化酶是由二個(gè)亞基組成的金屬酶，每個(gè) 亞基含一個(gè)銅原子和一個(gè)鋅原子，故稱“銅鋅超氧化物歧化酶”，它是一種重要的生化試劑， 也是一種很有前途的藥用酶，又是一種人體內(nèi)自由的基的清除劑，具有專一性強(qiáng)、時(shí)效高等 優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，銅鋅超氧化物歧化酶也存在著容易被機(jī)體快速消除，不穩(wěn)定，易被酶水解等問 題。而化學(xué)修飾的目的之一就是保護(hù)蛋白質(zhì)，修飾基團(tuán)可有效地提高其穩(wěn)定性，阻止蛋白水 解酶與蛋白質(zhì)骨架本身的接觸，從而阻止蛋白質(zhì)的降解，減小其免疫原性等。化學(xué)修飾劑之 一的單甲醚聚乙二醇(mPEG-20000)具有完全的生物相容性及親水性，沒有抗原性及免疫 原性，而且在耐熱、耐酸堿及抗蛋白酶水解能力方面明顯優(yōu)于天然酶，特別是大大延長在體 內(nèi)停留時(shí)間。長期實(shí)驗(yàn)也表明其沒有毒性，由于修飾產(chǎn)物其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)及生物學(xué) 功能，對蛋白質(zhì)進(jìn)行PEG化修飾已成為化學(xué)修飾法中較為成功的一種方法。沙棘又名沙棗、醋柳果、黑刺、酸刺，是胡頹子科植物沙棘(Hippophaerhamnoides L.)。沙棘分布范圍極廣，中國擁有世界上最豐富的沙棘資源，是防風(fēng)固沙的“先鋒樹種”，具 有耐寒、耐旱、耐瘠薄及迅速繁殖成林的優(yōu)良生態(tài)學(xué)特征。中國專利申請?zhí)?2109883公開 了由沙棘提取分離超氧化物歧化酶工藝，采用的方式主要是用氯仿-乙醇混合溶劑，加入 錢鹽使SOD分離，再精制。該方法為SOD制備開辟新途徑。中國專利申請?zhí)?4112613公開 了沙棘超氧物歧化酶及小分子抗氧化復(fù)合物，其中用天然沙棘漿果或葉為原料，加入磷酸 緩沖液，低溫冷凍勻降，熱沉淀、過濾、離心分離而得復(fù)合物。酶純度不高。中國專利申請?zhí)?200510011365公開了從沙棘鮮嫩枝葉提取蛋白質(zhì)、總黃酮和超氧化物歧化酶的方法，主要 采用鹽析法。中國專利申請?zhí)?00810045010公開了一種沙棘銅/鋅超氧化物歧化酶及其 制備，主要離心取沙棘果汁，加入有機(jī)溶劑乙醇沉淀，膜過濾，濃縮，冷凍干燥而得，制備方 法簡單。以上方法都主要是從沙棘果、葉或枝中提取或制備SOD或銅/鋅SOD的方法。對沙 棘中提取、制備超氧化物歧化酶的提供了多種方法，但是，這些方法都未能解決所制備SOD 的半衰期短、穩(wěn)定性差、易被蛋白酶水解等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種操作步驟少、周期短的沙棘銅/鋅SOD的
3制備與修飾過程同步完成的方法。為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種沙棘銅/鋅SOD的制備與修飾過程同步完成 的方法，包括以下步驟(1)將潔凈的沙棘枝在0 4°C溫度下粉碎后，按1 5 1 15的料液重量體 積比加入磷酸緩沖液，并在該溫度下進(jìn)行超聲提取，得到提取液；(2)將所述提取液經(jīng)離心過濾后，得到上清液；(3)在所述上清液中加入其體積的0. 3 0. 4倍的丙酮，置冰浴中攪拌后離心過 濾，得到超氧化物歧化酶沉淀物；(4)在0 4°C溫度下，用料液重量體積比為1 2 1 5的磷酸緩沖液對所述 超氧化物歧化酶沉淀物進(jìn)行溶解，經(jīng)離心分離后得到沙棘超氧化物歧化酶粗制品；(5)選擇KCN和H2O2作為抑制劑，并根據(jù)不同類型超氧化物歧化酶對不同抑制劑 的敏感性不同來判斷所述沙棘超氧化物歧化酶粗制品為銅鋅超氧化物歧化酶粗制品；(6)將所述銅鋅超氧化物歧化酶粗制品上平衡后的DEAE-52層析柱，并用5BV 7BV的Tris-HCl緩沖液平衡；其中Tris-HCl緩沖液的pH值為7. 4 8. 6，濃度為25mmol/ L 60mmol/L ；(7)在所述裝有銅鋅超氧化物歧化酶粗制品的DEAE-52層析柱上，用溶于的硼 酸-硼砂緩沖液的活化好的分子量為20000的單甲醚聚乙二醇來修飾銅鋅超氧化物歧化 酶；(8)用pH值為7. 4 8. 6、濃度為15mmol/L 30mmol/L的Tris-HCl緩沖液對所 述修飾銅鋅超氧化物歧化酶的DEAE-52層析柱進(jìn)行濃度為0. lmol/L 0. 4mol/L的NaCl 梯度洗脫，得到洗脫液，該洗脫液經(jīng)電泳鑒定修飾酶后，收集修飾酶，并測定所述修飾酶的 活力即可。所述步驟(1)和(4)中磷酸緩沖液的濃度為50mmol/L，且其pH值為7. 8。所述步驟(6)中DEAE-52層析柱的平衡是指采用pH值為7. 4 8. 6、濃度為 25mmol/L 60mmol/L 的 Tris-HCl 緩沖液平衡。所述步驟(7)中的活化好的分子量為20000的單甲醚聚乙二醇是指分子量為
20000的單甲醚聚乙二醇用三聚氯氰在苯中進(jìn)行反應(yīng)活化所得。所述步驟(7)中的硼酸-硼砂緩沖液的濃度為45mmol/L 60mmol/L，pH值為 8. 5 9. 5。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1、沙棘銅鋅超氧化物歧化酶分離純化和修飾過程同步完成。本發(fā)明利用層析分 離技術(shù)吸附，先不經(jīng)洗脫步驟，直接對吸附在層析分離介質(zhì)上的銅鋅超氧化物歧化酶進(jìn)行 化學(xué)修飾，再通過特異性洗脫獲得修飾蛋白。這種方法不但解決了目前蛋白質(zhì)的分離純化 和修飾是兩個(gè)相互獨(dú)立的過程而引起的蛋白質(zhì)變性失活，過程操作步驟多、周期長等長期 困擾的問題，而且也保證了所獲得的銅鋅超氧化物歧化酶具有高活性，使得其在多肽、蛋白 質(zhì)、藥用酶等生化藥物的生產(chǎn)、研究和臨床上有較高的應(yīng)用價(jià)值。2、經(jīng)測試，本發(fā)明獲得的PEG-銅鋅超氧化物歧化酶具有良好溶解性，比銅鋅SOD 酶的溶解度高82%，且不易被水解酶降解，例如加入胃蛋白酶4小時(shí)后，活力保留仍為 87. 1%,同樣條件下，銅/鋅SOD的活力僅為43. 6%；加入胰蛋白酶4小時(shí)后，PEG-銅鋅SOD活力保留為92.4%，而銅鋅SOD活力僅為36.7%。PEG-銅鋅SOD熱穩(wěn)定性也顯著提高，銅 鋅SOD在70°C保溫5小時(shí)后活力保留11. 9%，而PEG-銅鋅SOD活力保留45. 2%。3、本發(fā)明操作步驟少、周期短。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 一種沙棘銅/鋅SOD的制備與修飾過程同步完成的方法，包括以下步 驟(1)摘取新鮮的沙棘枝用去離子水洗凈，將潔凈的沙棘枝在0°C 4°C下粉碎后， 按1 5的料液重量體積比加入濃度為50mmol/L、且其pH值為7. 8的磷酸緩沖液，并在該 溫度下、功率為90W進(jìn)行超聲提取，超聲每2分鐘間斷一次，共超聲20分鐘，得到提取液。(2)將提取液以4000rpm/min的速率離心20分鐘，過濾，得到上清液。(3)在上清液中由少到多，分三次加入其體積的0. 38倍的丙酮，置0 4°C的冰浴 中攪拌后，以4000rpm/min的速率離心40分鐘，過濾，得到超氧化物歧化酶沉淀物。(4)在0 4°C溫度下，用料液重量體積比為1 2的磷酸緩沖液對超氧化物歧化 酶沉淀物進(jìn)行溶解，經(jīng)離心分離后得到沙棘超氧化物歧化酶粗制品；磷酸緩沖液的濃度為 50mmol/L，且其 pH 值為 7. 8。(5)選擇KCN和H2O2作為抑制劑，并根據(jù)不同類型超氧化物歧化酶對不同抑制劑 的敏感性不同來判斷沙棘超氧化物歧化酶粗制品為銅鋅超氧化物歧化酶粗制品。由于銅鋅SOD對KCN和H2O2均敏感；Fe-SOD對KCN不敏感，而對H2O2敏感；Mn-SOD 對KCN和H2O2均不敏感；因此可用這兩種抑制劑將三種SOD區(qū)分開。該酶對KCN和H2O2都 很敏感，因此可判斷該酶是銅鋅SOD。(6)將銅鋅超氧化物歧化酶粗制品上平衡后的DEAE-52層析柱，并用5BV的pH值 為7. 8、濃度為45mmol/L的Tris-HCl緩沖液平衡。其中DEAE-52層析柱的平衡是指采用pH值為7. 8、濃度為45mmol/L的Tris-HCl 緩沖液平衡。(7)在裝有銅鋅超氧化物歧化酶粗制品的DEAE-52層析柱上，用溶于的硼酸-硼砂 緩沖液的活化好的mPEG-20000循環(huán)過DEAE-52層析柱4h，對固定在柱上的銅鋅超氧化物歧 化酶進(jìn)行修飾。其中活化好的mPEG-20000是指分子量為20000的單甲醚聚乙二醇 (mPEG-20000)用三聚氯氰在苯中進(jìn)行反應(yīng)活化所得。硼酸-硼砂緩沖液的濃度為45mmol/L，pH值為8. 5。(8)用pH值為7. 8、濃度為25mmol/L的Tris-HCl緩沖液對修飾銅鋅超氧化物歧 化酶的DEAE-52層析柱進(jìn)行濃度為0. lmol/L的NaCl梯度洗脫，得到洗脫液，該洗脫液經(jīng)電 泳鑒定修飾酶后，收集修飾酶，并測定修飾酶的活力為2832. 48U/mL。實(shí)施例2 —種沙棘銅/鋅SOD的制備與修飾過程同步完成的方法，包括以下步 驟(1)摘取新鮮的沙棘枝用去離子水洗凈，將潔凈的沙棘枝在0 4°C下粉碎后，按 1 8的料液重量體積比加入濃度為50mmol/L，且其pH值為7. 8的磷酸緩沖液，并在該溫 度下、功率為90W進(jìn)行超聲提取，超聲每2分鐘間斷一次，共超聲20分鐘，得到提取液。
(2)將提取液以4000rpm/min的速率離心25分鐘，過濾，得到上清液。(3)在上清液中由少到多，分三次加入其體積的0. 3倍的丙酮，置0 4°C的冰浴 中攪拌后，以4000rpm/min的速率離心30分鐘，過濾，得到超氧化物歧化酶沉淀物。(4)在0 4°C溫度下，用料液重量體積比為1 3的磷酸緩沖液對超氧化物歧化 酶沉淀物進(jìn)行溶解，經(jīng)離心分離后得到沙棘超氧化物歧化酶粗制品；磷酸緩沖液的濃度為 50mmol/L，且其 pH 值為 7. 8。(5)選擇KCN和H2O2作為抑制劑，并根據(jù)不同類型超氧化物歧化酶對不同抑制劑 的敏感性不同來判斷沙棘超氧化物歧化酶粗制品為銅鋅超氧化物歧化酶粗制品。判斷方式 同實(shí)施例1。(6)將銅鋅超氧化物歧化酶粗制品上平衡后的DEAE-52層析柱，并用7BV的pH值 為7. 4、濃度為25mmol/L的的Tris-HCl緩沖液平衡。其中DEAE-52層析柱的平衡是指采用pH值為7. 4、濃度為25mmol/L的Tris-HCl 緩沖液平衡。(7)在裝有銅鋅超氧化物歧化酶粗制品的DEAE-52層析柱上，用溶于的硼酸-硼砂 緩沖液的活化好的mPEG-20000循環(huán)過DEAE-52層析柱4. 5h，對固定在柱上的銅鋅超氧化物 歧化酶進(jìn)行修飾。其中活化好的mPEG-20000同實(shí)施例1。硼酸-硼砂緩沖液的濃度為50mmol/L，pH值為9. 0。(8)用pH值為7. 4、濃度為20mmol/L的Tris-HCl緩沖液對修飾銅鋅超氧化物歧 化酶的DEAE-52層析柱進(jìn)行濃度為0. 3mol/L的NaCl梯度洗脫，得到洗脫液，該洗脫液經(jīng)電 泳鑒定修飾酶后，收集修飾酶，并測定修飾酶的活力為3685. 07U/mL。實(shí)施例3 —種沙棘銅/鋅SOD的制備與修飾過程同步完成的方法，包括以下步 驟(1)摘取新鮮的沙棘枝用去離子水洗凈，將潔凈的沙棘枝在0 4°C下粉碎后，按 1 10的料液重量體積比加入濃度為50mmol/L，且其pH值為7. 8的磷酸緩沖液，并在該溫 度下、功率為90W進(jìn)行超聲提取，超聲每2分鐘間斷一次，共超聲20分鐘，得到提取液。(2)將提取液以4000rpm/min的速率離心30分鐘，過濾，得到上清液。(3)在上清液中由少到多，分三次加入其體積的0. 35倍的丙酮，置0 4°C的冰浴 中攪拌后，以4000rpm/min的速率離心30分鐘，過濾，得到超氧化物歧化酶沉淀物。(4)在0 4°C溫度下，用料液重量體積比為1 4的磷酸緩沖液對超氧化物歧化 酶沉淀物進(jìn)行溶解，經(jīng)離心分離后得到沙棘超氧化物歧化酶粗制品；磷酸緩沖液的濃度為 50mmol/L，且其 pH 值為 7. 8。(5)選擇KCN和H2O2作為抑制劑，并根據(jù)不同類型超氧化物歧化酶對不同抑制劑 的敏感性不同來判斷沙棘超氧化物歧化酶粗制品為銅鋅超氧化物歧化酶粗制品。判斷方式 同實(shí)施例1。(6)將銅鋅超氧化物歧化酶粗制品上平衡后的DEAE-52層析柱，并用6BV的pH值 為8. 0、濃度為50mmol/L的Tris-HCl緩沖液平衡。其中DEAE-52層析柱的平衡是指采用pH值為8. 0、濃度為50mmol/L的Tris-HCl 緩沖液平衡。
(7)在裝有銅鋅超氧化物歧化酶粗制品的DEAE-52層析柱上，用溶于的硼酸-硼砂 緩沖液的活化好的mPEG-20000循環(huán)過DEAE-52層析柱5h，對固定在柱上的銅鋅超氧化物歧 化酶進(jìn)行修飾。其中活化好的mPEG-20000同實(shí)施例1。硼酸-硼砂緩沖液的濃度為55mmol/L，pH值為9. 0。(8)用pH值為8. 0、濃度為30mmol/L的Tris-HCl緩沖液對修飾銅鋅超氧化物歧 化酶的DEAE-52層析柱進(jìn)行濃度為0. 3mol/L的NaCl梯度洗脫，得到洗脫液，該洗脫液經(jīng)電 泳鑒定修飾酶后，收集修飾酶，并測定修飾酶的活力為2903. 85U/mL。實(shí)施例4 一種沙棘銅/鋅SOD的制備與修飾過程同步完成的方法，包括以下步 驟(1)摘取新鮮的沙棘枝用去離子水洗凈，將潔凈的沙棘枝在0 4°C下粉碎后，按 1 15的料液重量體積比加入濃度為50mmol/L，且其pH值為7. 8的磷酸緩沖液，并在該溫 度下、功率為90W進(jìn)行超聲提取，超聲每2分鐘間斷一次，共超聲20分鐘，得到提取液。(2)將提取液以4000rpm/min的速率離心40分鐘，過濾，得到上清液。(3)在上清液中由少到多，分三次加入其體積的0. 4倍的丙酮，置0 4°C的冰浴 中攪拌后，以4000rpm/min的速率離心40分鐘，過濾，得到超氧化物歧化酶沉淀物。(4)在0 4°C溫度下，用料液重量體積比為1 5的磷酸緩沖液對超氧化物歧化 酶沉淀物進(jìn)行溶解，經(jīng)離心分離后得到沙棘超氧化物歧化酶粗制品；磷酸緩沖液的濃度為 50mmol/L，且其 pH 值為 7. 8。(5)選擇KCN和H2O2作為抑制劑，并根據(jù)不同類型超氧化物歧化酶對不同抑制劑 的敏感性不同來判斷沙棘超氧化物歧化酶粗制品為銅鋅超氧化物歧化酶粗制品。判斷方式 同實(shí)施例1。(6)將銅鋅超氧化物歧化酶粗制品上平衡后的DEAE-52層析柱，并用6BV的pH值 為8. 6、濃度為60mmol/L的Tris-HCl緩沖液平衡。其中DEAE-52層析柱的平衡是指采用pH值為8. 6、濃度為60mmol/L的Tris-HCl 緩沖液平衡。(7)在裝有銅鋅超氧化物歧化酶粗制品的DEAE-52層析柱上，用溶于的硼酸-硼砂 緩沖液的活化好的mPEG-20000循環(huán)過DEAE-52層析柱6h，對固定在柱上的銅鋅超氧化物歧 化酶進(jìn)行修飾。其中活化好的mPEG-20000同實(shí)施例1。硼酸-硼砂緩沖液的濃度為60mmol/L，pH值為9. 5。(8)用pH值為8. 6、濃度為30mmol/L的Tris-HCl緩沖液對修飾銅鋅超氧化物歧 化酶的DEAE-52層析柱進(jìn)行濃度為0. 4mol/L的NaCl梯度洗脫，得到洗脫液，該洗脫液經(jīng)電 泳鑒定修飾酶后，收集修飾酶，并測定修飾酶的活力為3697. 43U/mL。實(shí)施例5 —種沙棘銅/鋅SOD的制備與修飾過程同步完成的方法，包括以下步 驟(1)摘取新鮮的沙棘枝用去離子水洗凈，將潔凈的沙棘枝在0 4°C下粉碎后，按 1 10的料液重量體積比加入濃度為50mmol/L，且其PH值為7. 8的磷酸緩沖液，并在該溫 度下、功率為90W進(jìn)行超聲提取，超聲每2分鐘間斷一次，共超聲20分鐘，得到提取液。
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(2)將提取液以4000rpm/min的速率離心35分鐘，過濾，得到上清液。(3)在上清液中由少到多，分三次加入其體積的0. 4倍的丙酮，置0 4°C的冰浴 中攪拌后，以4000rpm/min的速率離心35分鐘，過濾，得到超氧化物歧化酶沉淀物。(4)在0 4°C溫度下，用料液重量體積比為1 3的磷酸緩沖液對超氧化物歧化 酶沉淀物進(jìn)行溶解，經(jīng)離心分離后得到沙棘超氧化物歧化酶粗制品；磷酸緩沖液的濃度為 50mmol/L，且其 pH 值為 7. 8。(5)選擇KCN和H2O2作為抑制劑，并根據(jù)不同類型超氧化物歧化酶對不同抑制劑 的敏感性不同來判斷沙棘超氧化物歧化酶粗制品為銅鋅超氧化物歧化酶粗制品。判斷方式 同實(shí)施例1。(6)將銅鋅超氧化物歧化酶粗制品上平衡后的DEAE-52層析柱，并用5BV的pH值 為7. 4、濃度為25mmol/L的Tris-HCl緩沖液平衡。其中DEAE-52層析柱的平衡是指采用pH值為7. 4、濃度為25mmol/L的Tris-HCl 緩沖液平衡。(7)在裝有銅鋅超氧化物歧化酶粗制品的DEAE-52層析柱上，用溶于的硼酸-硼砂 緩沖液的活化好的mPEG-20000循環(huán)過DEAE-52層析柱4h，對固定在柱上的銅鋅超氧化物歧 化酶進(jìn)行修飾。其中活化好的mPEG-20000同實(shí)施例1。硼酸-硼砂緩沖液的濃度為45mmol/L，pH值為8. 5。(8)用pH值為7. 4、濃度為15mmol/L的Tris-HCl緩沖液對修飾銅鋅超氧化物歧 化酶的DEAE-52層析柱進(jìn)行濃度為0. 2mol/L的NaCl梯度洗脫，得到洗脫液，該洗脫液經(jīng)電 泳鑒定修飾酶后，收集修飾酶，并測定修飾酶的活力為3155. 45U/mL。
權(quán)利要求
一種沙棘銅/鋅SOD的制備與修飾過程同步完成的方法，包括以下步驟(1)將潔凈的沙棘枝在0～4℃溫度下粉碎后，按1∶5～1∶15的料液重量體積比加入磷酸緩沖液，并在該溫度下進(jìn)行超聲提取，得到提取液；(2)將所述提取液經(jīng)離心過濾后，得到上清液；(3)在所述上清液中加入其體積的0.3～0.4倍的丙酮，置冰浴中攪拌后離心過濾，得到超氧化物歧化酶沉淀物；(4)在0～4℃溫度下，用料液重量體積比為1∶2～1∶5的磷酸緩沖液對所述超氧化物歧化酶沉淀物進(jìn)行溶解，經(jīng)離心分離后得到沙棘超氧化物歧化酶粗制品；(5)選擇KCN和H2O2作為抑制劑，并根據(jù)不同類型超氧化物歧化酶對不同抑制劑的敏感性不同來判斷所述沙棘超氧化物歧化酶粗制品為銅鋅超氧化物歧化酶粗制品；(6)將所述銅鋅超氧化物歧化酶粗制品上平衡后的DEAE 52層析柱，并用5BV～7BV的Tris HCl緩沖液平衡；其中Tris HCl緩沖液的pH值為7.4～8.6，濃度為25mmol/L～60mmol/L；(7)在所述裝有銅鋅超氧化物歧化酶粗制品的DEAE 52層析柱上，用溶于的硼酸 硼砂緩沖液的活化好的分子量為20000的單甲醚聚乙二醇來修飾銅鋅超氧化物歧化酶；(8)用pH值為7.4～8.6、濃度為15mmol/L～30mmol/L的Tris HCl緩沖液對所述修飾銅鋅超氧化物歧化酶的DEAE 52層析柱進(jìn)行濃度為0.1mol/L～0.4mol/L的NaCl梯度洗脫，得到洗脫液，該洗脫液經(jīng)電泳鑒定修飾酶后，收集修飾酶，并測定所述修飾酶的活力即可。
2.如權(quán)利要求1所述的一種沙棘銅/鋅SOD的制備與修飾過程同步完成的方法，其特 征在于所述步驟(1)和(4)中磷酸緩沖液的濃度為50!1111101/1，且其PH值為7.8。
3.如權(quán)利要求1所述的一種沙棘銅/鋅SOD的制備與修飾過程同步完成的方法，其 特征在于所述步驟(6)中DEAE-52層析柱的平衡是指采用pH值為7. 4 8. 6、濃度為 25mmol/L 60mmol/L 的 Tris-HCl 緩沖液平衡。
4.如權(quán)利要求1所述的一種沙棘銅/鋅SOD的制備與修飾過程同步完成的方法，其 特征在于所述步驟(7)中的活化好的分子量為20000的單甲醚聚乙二醇是指分子量為 20000的單甲醚聚乙二醇用三聚氯氰在苯中進(jìn)行反應(yīng)活化所得。
5.如權(quán)利要求1所述的一種沙棘銅/鋅SOD的制備與修飾過程同步完成的方法，其 特征在于所述步驟(7)中的硼酸-硼砂緩沖液的濃度為45mmol/L 60mmol/L，pH值為 8. 5 9. 5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種沙棘銅/鋅SOD的制備與修飾過程同步完成的方法，該方法首先將新鮮沙棘枝的粗提液經(jīng)丙酮分級沉淀后，根據(jù)SOD對抑制劑的敏感性不同判斷為銅/鋅SOD；然后將銅/鋅SOD粗制品吸附在DEAE-52層析柱上，不經(jīng)洗脫分離，直接用活化的mPEG-20000對吸附在柱上的銅/鋅SOD進(jìn)行化學(xué)耦合修飾，最后通過特異性洗脫分離獲得PEG-銅/鋅SOD，從而實(shí)現(xiàn)了沙棘中銅/鋅SOD分離純化和修飾過程同步完成。本發(fā)明不但解決了目前蛋白質(zhì)的分離純化和修飾是兩個(gè)相互獨(dú)立的過程而引起的蛋白質(zhì)變性失活，過程操作步驟多、周期長等長期困擾的問題，而且修飾后的mPEG-銅/鋅SOD的活力比未修飾前有所提高，具有安全性高、穩(wěn)定性更好的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/08GK101955919SQ20101029875
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者利毛才讓, 索有瑞 申請人:中國科學(xué)院西北高原生物研究所