專利名稱：：不同類型食用菌新品種選育篩選方法的建立的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于食用菌中錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶定性鑒定方法。
背景技術(shù)：
：木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶可用于紙漿生物漂白、有機(jī)污染物降解(如土壤生物修復(fù)、印染廢水及化工廢水的生物處理)等等，其應(yīng)用非常廣泛，近幾年來對(duì)能夠產(chǎn)生錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶的食用菌種類及新品種的研究也越來越多，但是目前人工選擇育種、誘變育種、原生質(zhì)體融合等食用菌常規(guī)育種手段選育新品種時(shí)缺乏篩選標(biāo)記，融合菌株篩選工作量大，鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力，特別是對(duì)于是否含有錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶不同類型食用菌的融合菌株不能快速定性的鑒定和監(jiān)測(cè)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種不同類型食用菌新品種篩選鑒定的新方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中食用菌或新品種中是否具有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶的鑒定缺乏明顯篩選標(biāo)志、費(fèi)時(shí)、工作量大，不能快速定性的鑒定和監(jiān)測(cè)的問題，該方法可以直接、方便且靈敏的定性判斷食用菌中是否具有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶，特別適合用來定性檢測(cè)兩種不同類型的木腐菌或其他真菌的融合新菌株，檢測(cè)成本低廉。本發(fā)明的不同類型食用菌新品種篩選鑒定的新方法以苯胺藍(lán)為原料之一配制固體培養(yǎng)基，將不同類型食用菌融合后的菌種接種在所述固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基的變色情況，篩選鑒定該菌株是否為類型1即含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶中一種酶的菌株；或者類型2含有錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶兩種酶的菌株；或者類型3本身不含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶中一種或兩種酶的菌株與本身含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶中一種或兩種酶的菌株融合后的新品種，該新品種為含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶中一種或兩種酶的菌株；或者類型4本身不含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶中一種或兩種酶的菌株與本身含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶中一種或兩種酶的菌株融合后的新品種，該新品種為不含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶中一種或兩種酶的菌株。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明根據(jù)錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶與苯胺藍(lán)(苯胺藍(lán)又名醇溶藍(lán)，為棕色粉末，溶于乙醇而不溶于水，主要用于制墨水藍(lán)。它是由堿性副品紅與苯胺加熱縮合，再用鹽酸酸析而得。)發(fā)生反應(yīng)使苯胺藍(lán)的原本顏色發(fā)生改變，由原來的藍(lán)色變成黃色，從而判斷某菌是不是產(chǎn)生錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶，因此可以利用此方法檢測(cè)和篩選產(chǎn)生錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶的菌種和不產(chǎn)生此酶系的菌種的融合菌株，建立食用菌遺傳育種篩選鑒定的新方法，該方法具有操作簡(jiǎn)單、直接、方便且靈敏的特點(diǎn)，可以快速監(jiān)測(cè)雜交種，該方法將會(huì)改變目前各種新品種選育方法缺乏明顯篩選標(biāo)志、費(fèi)時(shí)、工作量大的現(xiàn)狀，極大的推動(dòng)食用菌的遺傳育種研究及新品種的應(yīng)用推廣，并為木素氧化酶系在食用菌中的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)，加快木素氧化酶的研究步伐，同時(shí)進(jìn)一步擴(kuò)大了木素氧化酶的應(yīng)用范圍。圖1是本發(fā)明的實(shí)施例1雪蓮菇的苯胺藍(lán)平板變色情況照片。圖2是本發(fā)明的實(shí)施例1白色茶樹菇的苯胺藍(lán)平板變色情況照片。圖3是本發(fā)明的實(shí)施例1紅平菇的苯胺藍(lán)平板變色情況照片。圖4是本發(fā)明的實(shí)施例1臺(tái)灣1號(hào)(袖珍菇)的苯胺藍(lán)平板變色情況照片。圖5是本發(fā)明的實(shí)施例1雞腿菇的苯胺藍(lán)平板變色情況照片。圖6是本發(fā)明的實(shí)施例1滑菇的苯胺藍(lán)平板變色情況照片。圖7是本發(fā)明的實(shí)施例1香菇的苯胺藍(lán)平板變色情況照片。圖8是本發(fā)明的實(shí)施例1灰樹花的苯胺藍(lán)平板變色情況照片。具體實(shí)施例方式具體步驟包括(1)配制苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基酵母膏10g，葡萄糖10g，苯胺藍(lán)0.lg，瓊脂18-20g，pH自然，自來水定容到1000mL，在12rC下進(jìn)行高壓滅菌20分鐘；(2)將苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基在微波爐中加熱，待溶解后放于超凈工作臺(tái)中，待溫度冷卻到45t:后倒平板；(3)待平板凝固后，將活化7天后的食用菌的菌種接種到PDA固體培養(yǎng)基平板上，置于2『C恒溫箱中培養(yǎng)7天；將長(zhǎng)滿PDA固體培養(yǎng)基平板上的菌種用lcm的打孔器取一個(gè)直徑約lcm的圓形菌體放在已經(jīng)凝固好的苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基平板上，置于2『C恒溫箱中培養(yǎng)10天；觀察其對(duì)苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基平板的變色作用，以變色圈的大小來衡量菌對(duì)苯胺藍(lán)染料的脫色能力(根據(jù)變色圈顏色的深淺初步定性的判斷菌株中錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶的活性大小，如變色圈黃色明顯的菌株中錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶的活性越大，反之越小)，每天記錄一次并拍照；10天后進(jìn)行苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基的變色情況對(duì)比，定性鑒定出該食用菌是否含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶的食用菌。觀察苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基的變色情況，當(dāng)所述固體培養(yǎng)基的顏色由原來的藍(lán)色變成黃色時(shí)，鑒定出培養(yǎng)的食用菌中含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶；當(dāng)所述固體培養(yǎng)基的顏色為原來的藍(lán)色沒有發(fā)生變化時(shí)，鑒定出培養(yǎng)的食用菌中不含有錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶。所述食用菌的菌種活化7天的培養(yǎng)步驟為1、配制PDA固體斜面培養(yǎng)基土豆200g，葡萄糖20g，ffl自然，定容到1000ml，再分裝到18*180規(guī)格的試管中，每支約裝5ml。2、將分裝好的試管培養(yǎng)基在12rC、高壓滅菌20分鐘。3、待滅菌鍋壓強(qiáng)降到Opa時(shí)，打開鍋將試管培養(yǎng)基進(jìn)行擺斜面，斜面高度不能超過試管的三分之二。4、將冰箱中的食用菌菌種取出和PDA斜面一起放在超凈工作臺(tái)中紫外滅菌20分鐘后進(jìn)行接種，接種時(shí)用接種鏟鏟取一塊菌塊放在斜面上即可。5、接種完成后，將接種好的斜面放在2『C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天即可。食用菌的菌種接種到平板上為將活化好的試管斜面菌種用接種鏟鏟取一小塊菌種放在已經(jīng)凝固好的PDA固體培養(yǎng)基平板上，用封口膜封好后放在2『C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后待用。本發(fā)明的方法適用于各種食用菌；特別適用于定性檢測(cè)兩種不同類型的木腐菌或其他真菌的融合新菌株。以下是本發(fā)明的幾個(gè)具體實(shí)施例，并結(jié)合附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是本發(fā)明不僅限于此。以下實(shí)施例中每個(gè)食用菌菌種的檢測(cè)的具體步驟都是將長(zhǎng)滿PDA固體培養(yǎng)基平板上的菌種用lcm的打孔器取一個(gè)菌塞放在已經(jīng)凝固好的苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基平板上，用封口膜封好后放在2『C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天。其中每天記錄各個(gè)菌種菌絲圈的直徑和變色圈的直徑大小，并拍照。其余的培養(yǎng)步驟均按照具體實(shí)施方式中的進(jìn)行。(1)苯胺藍(lán)平板變色實(shí)施例1雪蓮菇結(jié)果如圖1中從圖l可以看出，在苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基平板上雪蓮菇菌絲圈直徑和苯胺藍(lán)變色圈直徑是同等的，說明雪蓮菇產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶或錳過氧化物酶或兩種酶的能力很強(qiáng)。實(shí)施例2白色茶樹菇結(jié)果如圖2中從圖2可以發(fā)現(xiàn)白色茶樹菇在十天后苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基平板變色非常明顯，且和菌絲一起占滿整個(gè)平皿。說明其以上兩種酶或其中一種很強(qiáng)。實(shí)施例3紅平菇結(jié)果如圖3中從圖3可以看出紅平菇在十天后平板也發(fā)生變色，但是顏色不如雪蓮菇和白色茶樹菇好，說明它產(chǎn)酶能力一般。實(shí)施例4臺(tái)灣1號(hào)(袖珍菇)結(jié)果如圖4中從圖4從上面的相片可以看出臺(tái)灣1號(hào)(袖珍菇)在十天后平板也會(huì)發(fā)生變色，但還不如紅平菇顏色變化明顯，由此可知它的產(chǎn)酶能力不如以上三種好。(2)苯胺藍(lán)平板不變色實(shí)施例5雞腿菇結(jié)果如圖5中從圖5可以看出雞腿菇在十天內(nèi)菌絲圈直徑每天都有所增加十天后長(zhǎng)滿整個(gè)平皿，可是苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基平板一直沒有變色，說明雞腿菇不能產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化物酶或錳過氧化物酶。實(shí)施例6滑菇結(jié)果如圖6中從圖6可以看出滑菇在十天后菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)平皿但是平板顏色沒有發(fā)生改變，說明滑菇也不產(chǎn)以上任何一種酶。實(shí)施例7香菇結(jié)果如圖7中由圖7可以看出香菇在十天后長(zhǎng)滿了整個(gè)平皿，可是平板顏色并未發(fā)生改變，說明香菇不產(chǎn)以上任何一種酶。實(shí)施例8灰樹花6結(jié)果如圖8中由圖8可以看出灰樹花在十天內(nèi)一直沒有長(zhǎng)滿整個(gè)平皿且平板顏色也沒有發(fā)生改變，所以灰樹花也不產(chǎn)以上兩種任何一種酶。食用菌種類繁多，各具有優(yōu)缺點(diǎn)，由上面的例子可以看出通過苯胺藍(lán)平板變色法檢測(cè)有些食用菌含有錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶，使苯胺藍(lán)的原本顏色發(fā)生改變，由原來的藍(lán)色變成黃色；有些食用菌不含有錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶，平板中培養(yǎng)基苯胺藍(lán)顏色沒有發(fā)生變化，因此苯胺藍(lán)平板法適合用來定性檢測(cè)這兩種不同類型的木腐菌或其他真菌的融合新菌株，且該法直接、方便且靈敏。驗(yàn)證試驗(yàn)亞甲基藍(lán)(MB)法檢測(cè)木素過氧化物酶(Lip)Lip的定性反應(yīng)混合液2.7mL酶液，0.lmLlmmol/L的MB，0.3mL0.5mol/L的酒石酸鈉緩沖液(pH4.0)，加入0.lmL4.5mmol/L的H202啟動(dòng)反應(yīng)。用滅活的酶液體系做空白對(duì)照。愈創(chuàng)木酚法檢測(cè)錳過氧化物酶(Mnp)Mnp的定性反應(yīng)混合液2mL酶液，含有終濃度為0.4mmol/L的愈創(chuàng)木酚，0.lmmol/L的H202，0.2,1/L的MnS04及50,1/L的琥珀酸鈉緩沖體系，調(diào)節(jié)pH至4.5，加入H202啟動(dòng)反應(yīng)。用滅活的酶液體系做空白對(duì)照。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從以上表中的結(jié)果中可以得出采用驗(yàn)證試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明定性判斷的這幾種菌種中的確含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶中的一種或兩種，說明采用本發(fā)明的方法是完全可以定性的判斷出菌種中是否含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶中的一種或兩種或初步篩選類型3。權(quán)利要求一種不同類型食用菌新品種篩選鑒定的新方法，其特征在于以苯胺藍(lán)為原料之一配制固體培養(yǎng)基，將不同類型食用菌融合后的菌種接種在所述固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基的變色情況，篩選鑒定該菌株是否為類型1即含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶中一種酶的菌株；或者類型2含有錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶兩種酶的菌株；或者類型3本身不含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶中一種或兩種酶的菌株與本身含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶中一種或兩種酶的菌株融合后的新品種，該新品種為含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶中一種或兩種酶的菌株；或者類型4本身不含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶中一種或兩種酶的菌株與本身含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶中一種或兩種酶的菌株融合后的新品種，該新品種為不含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶中一種或兩種酶的菌株。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不同類型食用菌新品種篩選鑒定的新方法，其特征在于觀察苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基的變色情況，當(dāng)所述固體培養(yǎng)基的顏色由原來的藍(lán)色變成黃色時(shí)，鑒定出培養(yǎng)的食用菌中含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶或兩種酶均有；當(dāng)所述固體培養(yǎng)基的顏色為原來的藍(lán)色沒有發(fā)生變化時(shí)，鑒定出培養(yǎng)的食用菌中不含有錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不同類型食用菌新品種篩選鑒定的新方法，其特征在于所述方法適用于各種食用菌。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的不同類型食用菌新品種篩選鑒定的新方法，其特征在于所述方法適用于定性篩選和鑒定兩種不同類型的木腐菌或其他真菌的融合新菌株。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不同類型食用菌新品種篩選鑒定的新方法，其特征在于具體步驟包括(1)配制苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基酵母膏10g，葡萄糖lOg，苯胺藍(lán)O.lg，瓊脂18-20g，pH自然，自來水定容到1000mL，在12rC下進(jìn)行高壓滅菌20分鐘；(2)將苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基在微波爐中加熱，待溶解后放于超凈工作臺(tái)中，待溫度冷卻到45。C后倒平板；(3)待平板凝固后，將活化7天后的食用菌的菌種接種到PDA固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，然后將長(zhǎng)滿PDA固體培養(yǎng)基平板上的菌種用lcm的打孔器取一個(gè)直徑lcm的圓形菌體放在步驟(2)已經(jīng)凝固好的苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基平板上，用封口膜封好后放在28t:恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天，觀察其對(duì)苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基平板的變色作用，10天后進(jìn)行苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基平板的變色情況對(duì)比，定性鑒定出該食用菌是否含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶的食用菌。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的不同類型食用菌新品種篩選鑒定的新方法，其特征在于步驟(3)中對(duì)接種菌株后的苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行觀察，以變色圈顏色的深淺來衡量菌對(duì)苯胺藍(lán)染料的脫色能力，每天記錄各個(gè)菌種菌絲圈的直徑和變色圈的直徑大小，并拍照；根據(jù)變色圈顏色的深淺初步定性的判斷菌株中錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶的活性大小。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的不同類型食用菌新品種篩選鑒定的新方法，其特征在于所述食用菌的菌種活化7天的培養(yǎng)步驟為(1)配制PDA固體斜面培養(yǎng)基土豆200g，葡萄糖20g，pH自然，定容到1000ml，再分裝到18*180規(guī)格的試管中，每支裝5ml;(2)將分裝好的試管培養(yǎng)基在12rC、高壓滅菌20分鐘；(3)待滅菌鍋壓強(qiáng)降到Opa時(shí)，打開鍋將試管培養(yǎng)基進(jìn)行擺斜面，斜面高度不能超過試管的三分之二；(4)將冰箱中的食用菌菌種取出和PDA斜面一起放在超凈工作臺(tái)中紫外滅菌20分鐘后進(jìn)行接種，接種時(shí)用接種鏟鏟取一塊菌塊放在斜面上即可；(5)接種完成后，將接種好的斜面放在2『C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天即可。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的不同類型食用菌新品種篩選鑒定的新方法，其特征在于所述步驟(3)的活化后的食用菌的菌種接種到平板上為將活化好的試管斜面菌種用接種鏟鏟取一小塊菌種放在已經(jīng)凝固好的PDA固體培養(yǎng)基平板上，用封口膜封好后放在2『C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后待用。全文摘要本發(fā)明提供一種食用菌遺傳育種新品種篩選鑒定的新方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中食用菌或新品種中是否具有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶的鑒定缺乏明顯篩選標(biāo)志、費(fèi)時(shí)、工作量大，不能快速定性的鑒定和監(jiān)測(cè)的問題，以苯胺藍(lán)為原料之一配制固體培養(yǎng)基，將食用菌的菌種接種在所述固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基的變色情況，鑒定出該食用菌是否含有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶或其兩種酶的食用菌。本發(fā)明的方法可以直接、方便且靈敏的定性判斷食用菌中是否具有錳過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶，特別適合用來定性檢測(cè)兩種不同類型的木腐菌或其他真菌的融合新菌株，檢測(cè)成本低廉。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101760505SQ20101030054公開日2010年6月30日申請(qǐng)日期2010年1月21日優(yōu)先權(quán)日2010年1月21日發(fā)明者孫淑靜,張俊蘭,徐建中,林胤煌,胡開輝申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)