專(zhuān)利名稱：：直接復(fù)合pei的磁基因載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的載體的制備方法，具體是一種直接復(fù)合PEI的磁基因載體的制備方法。
背景技術(shù)：
：作為遺傳性和感染性疾病的新型治療方式，基因治療近年來(lái)引起越來(lái)越廣泛的關(guān)注。然而，在開(kāi)發(fā)安全有效的基因載體的過(guò)程中所面臨的種種挑戰(zhàn)和困難卻限制了這種治療方式在臨床上的應(yīng)用。三分之二的臨床試驗(yàn)采用病毒載體，但其存在諸多缺陷(C.E.Thomas,A.Ehrhardt，M.A.Kay，Progressandproblemswiththeuseofviralvectorsforgenetherapy。Nat.Rev.Genet.4，2003，346358)，如免疫原性高，潛在至文瘤性，體內(nèi)不能反復(fù)應(yīng)用，價(jià)格昂貴等等。因此，人們開(kāi)始將目光集中在安全，低毒，操作方便的非病毒基因載體的研發(fā)。大多數(shù)非病毒載體是帶有靜電的復(fù)合物，包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體，陽(yáng)離子高聚物，以及脂質(zhì)_高聚物-DNA的三重復(fù)合物等。它們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中顯示出了較高的基因轉(zhuǎn)染效率，然而在體內(nèi)靶組織的聚集速率和表達(dá)水平卻很低。為了克服非病毒基因載體在轉(zhuǎn)染過(guò)程中組織特異性差，細(xì)胞毒性相對(duì)較高以及易被水解酶降解等的缺點(diǎn)，一些物理學(xué)的原理和方法被輔助用來(lái)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，如電擊，超聲，流體力學(xué)，磁介導(dǎo)等。磁介導(dǎo)是將藥物磁靶向輸送的理念引入到基因載體當(dāng)中，并在具體研究中顯示出巨大的潛力。其主要是利用外加磁場(chǎng)將與順磁性粒子結(jié)合的基因載體吸引到細(xì)胞表面，從而達(dá)到快速有效轉(zhuǎn)染的目的，并在一定程度上減少了載體劑量，降低了細(xì)胞毒性，而與順磁性粒子結(jié)合的基因載體的構(gòu)建也成為該方法的重中之重。WenzhongLi等將與DNA復(fù)合的PEI通過(guò)Sulfo-NHS-LC-Biotin連接到包被有鏈霉親和素的磁珠上來(lái)構(gòu)建基因載體并實(shí)現(xiàn)了基因的心臟革巴向(WenzhongLi，CatharinaNesselmarm，ZhaohuiZhou.Genedeliverytotheheartbymagneticnanobeads.JournalofMagnetismandMagneticMaterials.2007，311,336341);PoveyAC等用半透性的尼龍膜將PEI與磁鐵礦包裹起來(lái)構(gòu)建磁微囊(PoveyAC，BartschH，NixonJR，0'NeillIK.Trappingofchemicalcarcinogenswithmagneticpolyethyleneiminemicrocapsules:I.Microcapsulepreparationandinvitroreactivityofenc即sulated皿cleophiles.JPharmSci，1986，75，831837)，該方法后來(lái)被德國(guó)Chemicell公司采用并研制出了商用基因轉(zhuǎn)染磁珠transMAGPEI。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，尚未見(jiàn)與本發(fā)明主題"直接復(fù)合PEI的磁基因載體的制備方法"有關(guān)的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種直接復(fù)合PEI的磁基因載體的制備方法。本發(fā)明制備的磁基因載體具有較強(qiáng)的DNA結(jié)合力，可以攜帶外源基因進(jìn)行體外基因轉(zhuǎn)染；在外加磁場(chǎng)作用下，轉(zhuǎn)染效率明顯提高510倍，轉(zhuǎn)染時(shí)間縮短到1小時(shí)。本發(fā)明是通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明涉及一種直接復(fù)合PEI的磁基因載體的制備方法，包括如下步驟步驟一，取FeCl3和FeCl2，采用共沉淀法制備磁性粒子；步驟二，將磁性粒子與聚乙烯亞胺復(fù)合，即得磁基因載體。步驟一中，所述共沉淀法具體為將FeCl3和FeCl2溶于脫氣水中，制備鐵鹽溶液，將鐵鹽溶液置于冰水浴中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下邊攪拌邊進(jìn)行如下操作逐滴滴加NaOH的水溶液，當(dāng)pH值為10.511時(shí)停止滴定，繼續(xù)冰浴；在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將溶液油浴，離心，得磁性粒子。按摩爾比，F(xiàn)eCl3與FeCl2的比值為2:1。所述NaOH的水溶液的濃度為5M。所述繼續(xù)冰浴的時(shí)間30分鐘。所述油浴為8(TC油浴1小時(shí)。步驟二中，所述復(fù)合具體為將磁性粒子溶于去離子水中，得溶液；攪拌條件下，取溶液逐滴滴加到聚乙烯亞胺的PBS溶液中，之后對(duì)該溶液進(jìn)行透析，得磁基因載體。所述攪拌的時(shí)間為3小時(shí)。所述聚乙烯亞胺的分子量為25000。所述透析使用的為透析分子量為10，0000的透析袋。本發(fā)明以FeCl3和FeCl2為原材料，采用共沉淀法合成磁性納米粒子，然后在其表面復(fù)合PEI，得到攜帶有陽(yáng)離子聚合物的磁性納米載體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明制備的磁基因載體具有較強(qiáng)的DNA結(jié)合力，可以攜帶外源基因進(jìn)行體外基因轉(zhuǎn)染；在外加磁場(chǎng)作用下，轉(zhuǎn)染效率明顯提高510倍，轉(zhuǎn)染時(shí)間縮短到1小時(shí)。圖1為與PEI復(fù)合前后及與DNA結(jié)合后磁性粒子在TEM下的形貌圖；圖2為MP-PEI與DNA結(jié)合后的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖3為MP-PEI，PEI以及MP三者對(duì)C0S-7細(xì)胞的體外毒性對(duì)比圖；圖4為不同量的MPPEI攜帶pGL3-contro1轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞的效果比較圖；圖5為外加磁場(chǎng)吸附對(duì)MP-PEI攜帶外源基因進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效果的影響圖。具體實(shí)施例方式以下實(shí)例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1本實(shí)施例涉及的材料如下氯化亞鐵，氯化鐵及氫氧化鈉均為分析純，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；非洲綠猴腎細(xì)胞系C0S-7細(xì)胞購(gòu)自ATCC;RPMI-1640培養(yǎng)基及血清均購(gòu)自GIBIC0公司；熒光素酶報(bào)道質(zhì)粒pGL3-contro1購(gòu)自美國(guó)Promega公司；PCS質(zhì)粒在中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)CN101095951公開(kāi)說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)；熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；PEI-25K購(gòu)自Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海業(yè)力生物技術(shù)公司；磁基因載體的制備過(guò)程如下，取5.6mmolFeCl3、2.8mmolFeCl2溶解在7ml脫氣水中，得鐵鹽溶液，反應(yīng)在24t:冰水浴中進(jìn)行，邊通入氮?dú)膺厰嚢璺乐笷e2+氧化，并逐滴滴加5M的NaOH的水溶液于上述鐵鹽溶液中，pH計(jì)在線監(jiān)測(cè)pH值；當(dāng)pH值為11時(shí)停止滴定，繼續(xù)冰浴攪拌反應(yīng)30分鐘；之后將溶液于8(TC油浴加熱1小時(shí)，使磁性粒子熟化。反應(yīng)完畢后，9000rpm，4t:離心10分鐘，去掉上清，同樣條件再次離心10分鐘，將沉淀于離心管底的磁性粒子用7ml去離子水重懸，然后取200ul重懸后的磁性粒子溶液，逐滴滴加到200ul0.075g/ml的PEI25000的PBS溶液中(PBS的配制方法如下稱取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HP04和0.24gK^P(V溶于800ml去離子水中，用HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L即得)，室溫下攪拌反應(yīng)3小時(shí)使磁性粒子與PEI25000復(fù)合，再通過(guò)透析的方法將復(fù)合后的產(chǎn)物置于分子量IO，0000的透析袋中透析4小時(shí)以除去游離的PEI，即得磁基因載體MP-PEI。本實(shí)施例的實(shí)施效果如下(l)Zeta電位和粒徑檢測(cè)將磁性粒子MP，未透析(beforeanalysis)的磁基因載體MP-PEI，透析過(guò)(afteranalysis)的磁基因載體MP-PEI，以及透析后與DNA復(fù)合的磁性粒子的復(fù)合物MP-PEI-DNA(lulMP-PEI與3ul1.2ug/ulPCS質(zhì)粒復(fù)合)分別取等體積用PBS稀釋后進(jìn)行Zeta電位和粒徑檢測(cè)，結(jié)果如表1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>從表1可以看出，與PEI復(fù)合后，磁性粒子MP的電位變化顯著，粒徑也變化顯著，說(shuō)明PEI不僅對(duì)粒子起到了分散作用，而且與粒子有一定程度地結(jié)合。MP-PEI與DNA結(jié)合后Zeta電位反倒變大，可能是因?yàn)镈NA對(duì)PEI起到了團(tuán)聚作用，使得PEI的分枝狀結(jié)構(gòu)更加緊密地團(tuán)聚在磁性粒子MP的周?chē)瑢?duì)粒子表面的電荷貢獻(xiàn)更大。將樣品用PBS稀釋100倍后通過(guò)TEM觀察，分別觀察了MP，MP-PEI(透析后)和MP-PEI-DNA三個(gè)樣品，結(jié)果如圖1，A為與PEI復(fù)合前的磁性粒子MP，B為與PEI復(fù)合后的磁性粒子MP-PEI，C為與PEI復(fù)合后的磁性粒子MP-PEI再與DNA復(fù)合后的產(chǎn)物。從中可以看出，未與PEI復(fù)合前，磁性粒子MP在PBS溶液中幾乎全部聚集在一起，盡管單個(gè)磁粒子粒徑在幾納米，而實(shí)際測(cè)出的粒徑卻是微米級(jí)。而與PEI復(fù)合后，粒徑則迅速變小，變?yōu)?00多納米，且從TEM可以觀察到磁性粒子完全被分散開(kāi)來(lái)并以某種方式附著在PEI的分支上，從而可以初步判斷PEI對(duì)磁性粒子的復(fù)合和分散作用。MP-PEI與DNA復(fù)合后，由于PEI對(duì)DNA的結(jié)合和團(tuán)聚作用，使得它的分支結(jié)構(gòu)消失，逐漸呈聚集狀，分散在其上的磁性粒子也因此隨著聚集，但是整個(gè)復(fù)合物的粒徑仍維持在幾百納米，且呈單分散狀態(tài)，因此比較適合進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。(2)磁基因載體MP-PEI與DNA的體外結(jié)合將MP-PEI(透析過(guò)的)稀釋為原來(lái)的100倍，取l，2，3，4，5，6，7，8ul分別與10ul0.125ug/ul的PCS質(zhì)粒混合，室溫下靜置IO分鐘后上樣電泳。0.8X的瓊脂糖凝膠，80V，電泳20分鐘，凝膠成像檢測(cè)。瓊脂糖凝膠電泳顯示，當(dāng)10ul的PCS質(zhì)粒，即1.25ugDNA分別與0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08ul的MP-PEI(透析過(guò)的)原液復(fù)合以后，隨著載體濃度的升高，DNA被復(fù)合得越來(lái)越多，在凝膠中表現(xiàn)為泳動(dòng)極慢或者根本不泳動(dòng)，條帶亮度也越來(lái)越暗甚至沒(méi)有，具體見(jiàn)圖2，泳道18依次為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08ul的MP-PEI與DNA結(jié)合后的產(chǎn)物的電泳圖譜?？梢?jiàn)，O.04ul的MPPEI原液即可以完全復(fù)合住10ul，即1.25ug質(zhì)粒。(3)磁基因載體MP-PEI的細(xì)胞毒性將COS-7細(xì)胞接種96孔板上，5*103細(xì)胞/孔，培養(yǎng)16小時(shí)，將透析后的MP-PEI分別取0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07ul經(jīng)PBS稀釋后分別與0.l，O.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7ul1.25ug/ul的同樣經(jīng)PBS稀釋后的PCS質(zhì)粒復(fù)合，靜置20分鐘。按照PEI與磁性粒子全部復(fù)合住的理論，則1體積MP-PEI復(fù)合物液體中含有1/2體積的PEI原始液(0.075g/ml)，同時(shí)含有1/2體積的磁性粒子MP的原始液，所以相應(yīng)地分別取0.005，0.01，0.015，0.02，0.025，0.03，和0.035ul的PEI原始液以及磁性粒子MP原始液經(jīng)PBS稀釋后同樣與O.l，O.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7ul1.25ug/ul的PCS質(zhì)粒復(fù)合，靜置20分鐘，然后分別加入去除了舊RPMI-1640培養(yǎng)液的細(xì)胞中，每個(gè)濃度四個(gè)復(fù)孔，孵育4小時(shí)后，去除含有樣品的上清，換成含有10%血清的新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行MTT檢細(xì)胞活性={吸光度}樣本/{吸光度}對(duì)照組，(對(duì)照組為不加任何樣品的細(xì)胞，同樣4個(gè)復(fù)孔)。通過(guò)MTT法體外測(cè)定MP-PEI，PEI25K以及MP三者對(duì)C0S-7細(xì)胞的毒性，并用LD50數(shù)據(jù)處理程序?qū)λ媒Y(jié)果進(jìn)行了分析，得到了三者對(duì)C0S-7細(xì)胞的半數(shù)致死量，換算成體積后分別為0.03288ul的MP-PEI，O.01555ul的PEI25，0.0344ul的MP。按照磁性粒子與PEI25K全部復(fù)合的理想理論，O.03288ul的MP-PEI中含有0.01644ul的PEI25K以及0.01644ul的MP，其中PEI的含量已高于0.01555ul，說(shuō)明MP-PEI的毒性基本相當(dāng)于或可以說(shuō)是小于與其等量的PEI25K的毒性。而磁性粒子本身的LD50較高，說(shuō)明磁性粒子本身的毒性較小，其與PEI復(fù)合后也在一定程度上降低了PEI本身的毒性，具體見(jiàn)圖3，分別為MP-PEI，PEI本身以及MP本身三者對(duì)C0S-7細(xì)胞的體外毒性。6[OO51](4)體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)1、未加磁場(chǎng)的轉(zhuǎn)染按照1*104個(gè)細(xì)胞/孔的密度將C0S-7細(xì)胞均勻接種于40孔板的前24孔，培養(yǎng)16小時(shí)后，換成無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，然后同樣在無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液里，每孔加入不同體積的MP-PEI與0.5ul1.25ug/ul的pGL3-contro1質(zhì)粒復(fù)合后的產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)染。并用PEI25000作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)濃度4個(gè)平行孔，轉(zhuǎn)染3.5小時(shí)。去掉上清后，換成含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，然后去掉培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞兩次，再用裂解液裂解細(xì)胞，80ul裂解液每孔，37°C，裂解0.5小時(shí)，然后取10ul裂解液與10ulLuciferase底物混合物混合，照度計(jì)下檢測(cè)。2、外加磁場(chǎng)的轉(zhuǎn)染按照1*105個(gè)細(xì)胞/孔的密度將COS-7細(xì)胞均勻接種于2塊12孔板，一塊轉(zhuǎn)染時(shí)磁吸附，一塊不吸附。采用2個(gè)體積的MP-PEI(分別為0.05ulMP-PEI稀釋到50ul，0.08ulMP-PEI稀釋到80u)分別與0.5ul的pGL3-contro1DNA(稀釋到30ul)復(fù)合后的產(chǎn)物來(lái)轉(zhuǎn)染，每個(gè)濃度4個(gè)平行孔。一共做了三次轉(zhuǎn)染，考察了磁吸附對(duì)于不同轉(zhuǎn)染時(shí)間的轉(zhuǎn)染效果的影響，分別為4小時(shí)，2小時(shí)和1小時(shí)。轉(zhuǎn)染后換成含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后裂解檢測(cè)。200ul裂解液每孔，同樣37°C，裂解0.5小時(shí)，然后取15ul裂解液與15ul底物混合物混合，檢測(cè)Luciferase的表達(dá)。再用BCA蛋白定量試劑盒來(lái)檢測(cè)細(xì)胞裂解液中總蛋白的含量以算出每毫克蛋白中Luciferase的表達(dá)量。PEI25000仍為陽(yáng)性對(duì)照，O.02ul(0.075g/ml)PEI25000稀釋到80ul，然后與0.5ulDNA(稀釋到30ul)混和后，靜置10分鐘，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染結(jié)果不加磁場(chǎng)的轉(zhuǎn)染，從DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)可以看出，0.04ul的MP-PEI原液即可以完全復(fù)合住1.25ugDNA.那么0.02ul的MP-PEI即可以復(fù)合住0.625ug的DNA.于是采用0.05，0.l，O.2，0.3，0.4ul的MP-PEI及0.0125ulPEI(0.075g/ml)分別與0.625ugpGL3-contro1質(zhì)粒復(fù)合后轉(zhuǎn)染。結(jié)果見(jiàn)圖4，分別為0.05，0.1，0.2，0.3，0.4ul的MP-PEI及0.0125ulPEI(0.075g/ml)分別與0.625ugpGL3_control質(zhì)粒復(fù)合后轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞的效果?？梢钥闯?，MP-PEI發(fā)揮了基因載體的作用，可以將外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞，并且隨著載體量的增加，細(xì)胞毒性加大，因而即便轉(zhuǎn)入細(xì)胞的DNA量增加，但由于細(xì)胞絕大部分死亡，基因表達(dá)無(wú)法進(jìn)行，所以外源基因的表達(dá)量仍然很低。外加磁場(chǎng)的轉(zhuǎn)染，分別比較了不同轉(zhuǎn)染時(shí)間下，外加磁場(chǎng)吸附與不加磁場(chǎng)吸附的轉(zhuǎn)染效果。具體見(jiàn)圖5，A為MP-PEI攜帶pGL3-control轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞4小時(shí)；B為MP-PEI攜帶pGL3-contro1轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞2小時(shí)；C為MP-PEI攜帶pGL3_control轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞1小時(shí)。從轉(zhuǎn)染結(jié)果可以看出，磁吸附的轉(zhuǎn)染效果明顯好于不吸附的。并且對(duì)于4小時(shí)的轉(zhuǎn)染來(lái)說(shuō)，磁場(chǎng)吸附介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染中，Luciferase的表達(dá)量為不吸附的轉(zhuǎn)染的IO倍，充分說(shuō)明了MP與PEI25000的相互作用，且二者結(jié)合得十分牢固。當(dāng)位于細(xì)胞板底的外加磁場(chǎng)作用于磁性粒子時(shí)，攜帶有DNA的PEI25000也隨之一同被吸引到細(xì)胞板底，充分與細(xì)胞接觸，導(dǎo)致進(jìn)入細(xì)胞的DNA也隨之增多，基因表達(dá)水平提高，但同時(shí)這也在一定程度上增加了細(xì)胞毒性。從2小時(shí)的轉(zhuǎn)染中可以看出，低載體量(0.08ul)的轉(zhuǎn)染效果好于高載體量(0.12ul)的，并且磁吸附與不吸附的基因表達(dá)值差別也更大。實(shí)施例2本實(shí)施例涉及的材料同實(shí)施例1，磁基因載體的構(gòu)建過(guò)程亦同實(shí)施例1，所不同之處在于，當(dāng)pH值為10.5時(shí)停止滴定，繼續(xù)冰浴攪拌反應(yīng)30分鐘；實(shí)施例3本實(shí)施例涉及的材料同實(shí)施例1，磁基因載體的構(gòu)建過(guò)程亦同實(shí)施例1，所不同之處在于，當(dāng)pH值為10.8時(shí)停止滴定，繼續(xù)冰浴攪拌反應(yīng)35分鐘；實(shí)施例2與實(shí)施例3所制備的磁性粒子粒徑均約lum，粒子本身略顯紅色，說(shuō)明沒(méi)有反應(yīng)很完全，磁性粒子的磁性稍微有些弱，與PEI25K復(fù)合后，所得的磁基因載體MP-PEI在粒徑與電位上與實(shí)施例1所得的磁基因載體相比，沒(méi)有大的差別。權(quán)利要求一種直接復(fù)合PEI的磁基因載體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，取FeCl3和FeCl2，采用共沉淀法制備磁性粒子；步驟二，將磁性粒子與聚乙烯亞胺復(fù)合，即得磁基因載體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的直接復(fù)合PEI的磁基因載體的制備方法，其特征是，步驟一中，所述共沉淀法為將FeCl3和FeCl2溶于脫氣水中，制備鐵鹽溶液，將鐵鹽溶液置于冰水浴中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下邊攪拌邊進(jìn)行如下操作逐滴滴加NaOH的水溶液，當(dāng)pH值為10.511時(shí)停止滴定，繼續(xù)冰??；在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將溶液油浴，離心，得磁性粒子。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的直接復(fù)合PEI的磁基因載體的制備方法，其特征是，按摩爾比，F(xiàn)eCl3與FeCl2的比值為2:1。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的直接復(fù)合PEI的磁基因載體的制備方法，其特征是，所述NaOH的水溶液的濃度為5M。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的直接復(fù)合PEI的磁基因載體的制備方法，其特征是，所述繼續(xù)冰浴的時(shí)間30分鐘。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的直接復(fù)合PEI的磁基因載體的制備方法，其特征是，所述油浴為8(TC油浴1小時(shí)。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的直接復(fù)合PEI的磁基因載體的制備方法，其特征是，步驟二中，所述復(fù)合為將磁性粒子溶于去離子水中，得溶液；攪拌條件下，取溶液逐滴滴加到聚乙烯亞胺的PBS溶液中，之后對(duì)該溶液進(jìn)行透析，得磁基因載體。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的直接復(fù)合PEI的磁基因載體的制備方法，其特征是，所述攪拌的時(shí)間為3小時(shí)。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的直接復(fù)合PEI的磁基因載體的制備方法，其特征是，所述聚乙烯亞胺的分子量為25000。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的直接復(fù)合PEI的磁基因載體的制備方法，其特征是，所述透析使用的為透析分子量為10，0000的透析袋。全文摘要一種生物
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的直接復(fù)合PEI的磁基因載體的制備方法，該方法包括如下步驟步驟一，取FeCl3和FeCl2，采用共沉淀法制備磁性粒子；步驟二，將磁性粒子與聚乙烯亞胺復(fù)合，即得磁基因載體。本發(fā)明制備的磁基因載體具有較強(qiáng)的DNA結(jié)合力，可以攜帶外源基因進(jìn)行體外基因轉(zhuǎn)染；在外加磁場(chǎng)作用下，轉(zhuǎn)染效率明顯提高5～10倍，轉(zhuǎn)染時(shí)間縮短到1小時(shí)。文檔編號(hào)C12N15/85GK101748150SQ20101030085公開(kāi)日2010年6月23日申請(qǐng)日期2010年1月28日優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日發(fā)明者徐宇虹,郭微申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)